玉米轉錄因子基因ZmASR1的克隆及植物表達載體構建

張麗麗+李博+譚燕華+曹揚+易小平

摘要：為深入研究玉米轉錄因子基因ZmASR1的功能，提高玉米株系的產量和抗逆性，根據http：//www.maizegdb.org/ 網站上公布的玉米自交系B73的ZmASR1序列和Cornejo發表的Ubiquitin啟動子的序列，設計引物從玉米自交系B73的DNA序列中克隆了ZmASR1基因和Ubiquitin啟動子，并對ZmASR1基因進行了生物信息學分析。序列分析結果表明，ZmASR1基因DNA全長為1 381 bp，包含1個長度為131 bp的內含子序列，存在1個完整的開放閱讀框417 bp，編碼138個氨基酸。氨基酸序列分析表明其具有ASR家族典型的保守結構域ABA_WDS（abscisic acid/water deficit stress），氨基酸序列的N端有該家族成員所特有的依賴于Zn2+的DNA結合位點，而C端則有1個核定位信號，玉米的ZmASR1與單子葉植物的ZmASR1親緣關系較近，而與雙子葉植物的ZmASR1親緣關系較遠。并構建了同時帶有該啟動子和ZmASR1基因的植物表達載體。

關鍵詞：玉米；Ubiquitin啟動子；ZmASR1基因；生物信息學；植物表達載體

中圖分類號： Q785

文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2016）04-0016-06

玉米生產在保障我國糧食安全中具有十分重要的戰略地位，玉米在世界范圍內廣泛種植，是我國播種面積最大的農作物，同時也是我國產量第一大糧食作物，是主要的糧食飼料兼用作物，以產量高、營養豐富且用途廣泛而被譽為三冠王——高產之王、飼料之王、加工原料之王。玉米的重要性為玉米的發展提供了難得的機遇，但同時我們也必須清醒地認識到玉米生產中遇到的現實困難。糧食產量下降是由各種生物和非生物脅迫的影響造成的，干旱是最重要的環境脅迫，超過任何其他環境因素，嚴重損害植物的生長和發育，限制植物生產和作物的性能[1]。玉米是對水分反應敏感的旱地作物，玉米在整個生長發育過程中需水量較大，但其自身的耐旱性較差。我國每年受旱面積大約為種植面積的40%，干旱一般可使玉米減產20%～30%，因此，干旱成為制約我國玉米發展的首要不利因素。隨著全球氣候變暖、水資源的日益匱乏和干旱的日益加劇，耐旱玉米品種在農業生產中的地位顯得越來越重要。干旱脅迫對玉米根系的生長發育、籽粒產量和品質都有較大影響，干旱脅迫抑制了玉米植株根系的生長，導致產量降低、品質變差。因此有關玉米干旱脅迫與抗旱性機理及其應用的研究才更加迫切，培育耐旱抗旱的玉米品種才是促進干旱和半干旱地區玉米生產發展的有效措施，同時也是抵御干旱提高產量的有效途徑。

ASR（abscisic acid，stress，ripening） 蛋白是一類親水性小分子量的植物特異性蛋白。ASR基因在植物響應發育和環境信號中發揮著重要的作用，包括衰老、果實成熟、花粉成熟和葡萄糖代謝[2-5]。并且ASR基因在ABA誘導和響應生物及非生物脅迫時顯著上調[6-11]。大蕉ASR基因MpAsr受鐮刀菌（Fusarium oxysporum f. sp. cubense）誘導而上調表達[10]。ASR基因還可以影響果實的產量，玉米ASR基因（ZmASR1）的異位表達對玉米產量有很大的影響，這種影響并不受缺水脅迫條件的限制，ZmASR1通過調節支鏈氨基酸的生物合成基因可能有助于改善玉米的產量[12]。

由于ASR基因在擬南芥中不存在[9，13]，對其功能和調控機制的研究非常有限。有研究表明小麥轉錄因子基因TaASR1轉入煙草之后通過激活體內的抗氧化系統和脅迫相關基因的表達來賦予其抗旱性[14]。Ricardi等在番茄中通過ChIP-SEQ技術證明番茄ASR1基因可能通過調控番茄細胞壁和水通道蛋白相關靶基因的表達來賦予番茄對干旱脅迫的耐受性[15]。前期的研究證明[12]，在玉米中ASR家族有9個成員，是目前ASR成員最多的品種，在玉米ASR基因家族9個成員中，在干旱脅迫條件下ZmASR1無論在轉錄水平還是蛋白質組水平上都是表達量最大、變化最為明顯的，并且ZmASR1在玉米中的過量表達可以提高玉米在缺水脅迫下的籽粒產量，但是卻沒有對ZmASR1缺水脅迫下的調控機理進行更深入的研究，因此我們選擇ZmASR1來進行抗旱調控機理的研究更有針對性和目的性。在玉米自交系中過表達ZmASR1基因是研究ZmASR1基因在植物中如何發揮調控作用的有效途徑，對于培育玉米抗旱新品種，促進玉米產業的健康發展具有重要的理論和實踐意義。

要想在玉米自交系中過表達ZmASR1基因，首先要構建植物表達載體，隨著植物基因工程技術的發展，我們不僅要把特定的外源基因轉入受體植物，更要將外源基因特定而高效地表達才能滿足我們的需求。啟動子序列中包含許多重要的順式作用元件，對植物基因的表達水平具有重要作用，使其成為表達調控的關鍵環節。一般認為CaMV35S啟動子在雙子葉植物的遺傳轉化應用廣泛，但在單子葉植物中的活性較低。而Ubiquitin啟動子來自于玉米多聚泛素蛋白基因，是一個在單子葉植物中有較強表達的組成型啟動子，在脅迫條件下，Ubiquitin基因的表達活性會顯著增強[16]。本研究從玉米自交系B73中克隆了Ubiquitin啟動子和玉米ZmASR1基因，構建了同時含Ubiquitin啟動子和ZmASR1基因的植物表達載體，為后續獲得轉基因抗旱株系奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

植物材料為玉米自交系B73，菌株為大腸桿菌DH5α和植物表達載體為pCAMBIA3301，農桿菌菌株為GV3101，酶與試劑為快速限制性內切酶 BamHⅠ、HindⅢ、PmlⅠ購自Thermo Scientific公司，T4 DNA 連接酶，pMD18-T vector （simple）均購自TaKaRa公司。