玉米Argoanute基因家族的全長cDNA克隆與表達分析

翟立紅+周蘭庭+韓鵬+騰峰

摘要：Argonaute（AGO）蛋白是小RNA分子誘導的沉默復合體（RISC）的核心因子，以玉米自交系B73為材料，利用RLM-RACE技術，克隆得到玉米17個AGO基因的全長cDNA序列，發現6個成員具有5′非翻譯外顯子，可能其表達受此機制調控。同時，利用半定量RT-PCR對其在玉米幼苗不同根系組織（包括初生胚根、冠根、次生胚根和側根）進行表達分析，結果表明：未檢測到ZmAGO5b、ZmAGO18b表達，ZmAGO1a/b、ZmAGO2a、ZmAGO10在各類根系中高水平表達，其他11個ZmAGOs表達水平較低，因此揭示選擇性表達不同的ZmAGOs可能是不同類型的根系分化及其功能的精細調控所必需的。

關鍵詞：Argonaute基因；克隆；5′非翻譯外顯子；表達

中圖分類號： S513.01；Q785

文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2016）04-0041-04

在真核生物中，小RNA（small RNA：sRNA）介導轉錄水平、轉錄后水平以及染色質水平的基因沉默。植物內源 sRNA 包括microRNA （miRNA）和各類小干擾RNA（short interfering RNA，siRNA）[1]。在已知的由sRNA介導的基因表達調控途徑中，sRNA必須與Argonaute（AGO）蛋白形成沉默復合體（RNA-induced silencing complex：RISC）引導sRNA通過序列互補與靶標（RNA或DNA）結合，進而降解mRNA、抑制翻譯或修飾染色質[1]。由此可見，AGO蛋白是sRNA行使其功能的重要因子。Argonaute蛋白最初是在植物中發現的[2]，是一類分子量較大、含有可變的N端、PAZ、MID和PIWI結構域的蛋白質[3-4]，其中PAZ和PIWI屬于保守結構域。在細菌和人類中的研究揭示了PAZ、MID、PIWI結構域在小RNA調控途徑中的作用[5-6]。其中，MID結合小RNA的5′-磷酸端，使小RNA錨定在AGO蛋白上；PAZ識別小RNA突出的3′ 端[3-4]；PIWI會形成一種類似于RNase H酶的折疊結構，具有內源核酸酶的活性。有研究發現，PIWI內存在保守的活性位點Asp-Asp-His（DDH motif）[7]，但DDH motif存在與否并不能完全代表AGO蛋白是否具有催化功能[8]。在擬南芥中，證實有催化功能的AGO蛋白有AtAGO1、AtAGO4、AtAGO7 和AtAGO10[9-13]。

不同物種中，AGO蛋白的數目不同。擬南芥基因組中注釋有10個AGO蛋白，水稻中有19個AGO蛋白，玉米中有17個AGO蛋白。擬南芥的AGO蛋白大致可分為三大類，AGO1、AGO5 和AGO10為第1類，AGO2、AGO3、AGO7為第2類，AGO4、AGO6、AGO8和AGO9為第3類[14]。Kapoor等把水稻和擬南芥AGO蛋白劃分為四大類，分別為AGO1、MEL1/AGO5、ZIPPY/AGO7和AGO4[15]。Zhai等將玉米中的AGO蛋白劃分為五大類，將與OsAGO18同源性較高的2個蛋白單獨劃為一類[16]。目前證實，植物中的AGO1主要參與miRNA通路，在植物的各個生長發育階段均起著重要的調控作用[9，17]。在擬南芥中，與AtAGO1親緣關系最近的AtAGO10突變后表現為莖尖分生組織發育異常，AtAGO1和AtAGO10競爭結合miR165/miR166，調節HD-ZIP Ⅲ 的表達，進而調節SAM發育和保持[18]。擬南芥中的AtAGO5僅在生殖組織中表達[19]，與水稻中的OsMEL1表達相似[15]。AGO7在反式作用的短干擾RNA（trans-acting short interfering RNAs，tasiRNA）的形成及其功能途徑中起重要作用[12]。AtAGO2與AtAGO3結構高度相似且功能冗余，AGO2在植物逆境環境下高效表達[15]，暗示在抗逆過程中起重要作用。AGO4蛋白主要是圍繞RNA介導的DNA甲基化（RdDM）過程中的作用機制展開，在整個發育過程中均有較高水平表達[15]。AGO6、AGO4在DNA甲基化上存在部分功能冗余，最近的研究證實AtAGO6在擬南芥莖和根的分生組織中存在RNA介導轉錄水平基因沉默的功能[20]。AtAGO8、AtAGO9序列相似度很高，其中，AtAGO8在擬南芥所有組織中表達量均較低，被認為是一個假基因[21]。最近的報道發現擬南芥中的 AtAGO9 在胚珠和花藥中的表達量非常高[22]。而與AtAGO9高度同源的玉米AGO104基因，控制玉米的無融合生殖，在性母細胞旁的體細胞大量富集[23]。截至目前，植物不同根系中AGO基因家族的表達模式還未見報道。

玉米（Zea mays L.）是當今世界最重要的糧、飼、能源、工業原料兼用的高產作物。根系是玉米重要的組織器官，在保持植株形態、水分和營養吸收與運輸、響應植物對環境脅迫等方面起著重要的作用。本研究以玉米測序自交系B73為材料，選取玉米幼苗不同根系組織包括初生胚根、冠根、次生胚根和側根對17個AGO基因進行表達分析，為探索AGO基因在根系形態建成方面的調控機制奠定基礎，與此同時，利用RACE技術對玉米17個AGO基因的全長cDNA進行克隆測序分析，以完善玉米AGO基因的序列信息，為全面解析玉米的AGO基因提供基礎。

1 材料與方法

1.1 供試材料

本試驗選用的材料玉米自交系B73，為美國優良自交系，配合力好，具有參考基因組序列。

選取大小均勻、籽粒飽滿的玉米B73種子用15%的H2O2浸泡30 min進行表面消毒處理后，滅菌蒸餾水沖洗3次，播種于沙缽中（沙子高壓滅菌），室內培養。當初生胚根和次生胚根長出時，分別取樣，最后取側根、冠根，每種根系取樣不少于3株，液氮速凍，-80 ℃冰箱保存。

1.2 方法

1.2.1 全長cDNA克隆 使用FirstChoice RLM-RACE（Ambion公司）試劑盒（貨號：AM1700）對玉米中鑒定到的ZmAGO基因進行5′末端和3′ 末端的擴增，試驗步驟嚴格按照說明書執行，5′-RACE和3′-RACE所用的巢式引物見Zhai等發表的文章[16]，最后一步擴增得到的PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳，將目的條帶切膠回收，連接至pGEM-T Easy載體（Promega公司），4 ℃連接過夜后進行轉化，篩選約10個陽性克隆送至Invitrogen公司進行菌液測序。

1.2.2 半定量RT-PCR 以Zhai等報道的17個玉米AGO基因家族[16]作為研究對象，利用NCBI網站上在線工具 Primer-Blast 進行基因特異引物設計（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov），擴增產物進行測序以確保擴增片段的特異性，所使用的引物信息見表1，以Actin（NM_001155179）作為內參基因，進行玉米AGO基因家族成員的半定量RT-PCR。首先用內參引物對4個組織的cDNA進行不同循環數目的PCR擴增，確定處于指數擴增期的循環數并調整模板加入體積使其在相同的循環數下亮度一致，然后利用內參調好的模板體積進行基因擴增，此時同樣要進行指數擴增期循環數的確定，最終得出不同基因在不同組織中的相對表達水平。

2 結果與分析

2.1 AGO家族基因的全長cDNA克隆及分析

基于所預測的基因序列設計基因特異性引物，使用RACE技術擴增所有17個基因的全長cDNA，我們共得到了11個ZmAGOs的5′末端和17個ZmAGOs的3′末端。大多數基因的轉錄本與B73 RefGen v2所預測的相似，但ZmAGO1b與B73 RefGen v2 所預測的基因結構存在較大差異，實際擴增所得到的5′-UTR第1個184 bp長度的非編碼外顯子（untranslated exon）位于預測基因的第1內含子區域，起始密碼子后移15 bp，說明該基因可能存在多個選擇性剪切轉錄本。通過序列分析發現，ZmAGO1a/b/f、ZmAGO5c、ZmAGO4、ZmAGO9存在5′非編碼外顯子，有可能這6個ZmAGO基因受該機制調控。

2.2 AGO家族基因在不同類型根組織中的表達分析

為詳細鑒定ZmAGOs基因在各類根系組織中的表達，將各類根組織細分為：冠根、初生胚根、次生胚根、側根并分別取樣（圖2）。圖3的RT-PCR結果表明：ZmAGO5b和 ZmAGO18b 在被測的玉米根系組織中未檢測到表達，15個ZmAGOs在玉米根系組織中表達，其中ZmAGO1a、ZmAGO1b、ZmAGO2a、ZmAGO10在各類根系都高水平表達，暗示這些基因在玉米根系發育中的重要作用；其他11個ZmAGOs基因的表達水平則相對較低。另外，有些ZmAGOs基因也顯示出其在不同類型根組織中表達的特異性，如ZmAGO2b、ZmAGO9在冠根、初生胚根和側根中表達，但在次生胚根中未檢測到其表達；ZmAGO5d、ZmAGO4則在冠根、次生胚根和側根中表達，但在初生胚根中未檢測到其表達。不同類型的根組織中大多數ZmAGOs基因具有相似的表達模式，說明這些ZmAGOs基因是各種根系組織生長發育共同需要的，以保持根系的基本組織特性；而不同類型的根組織表達不同的ZmAGOs基因，說明選擇性地表達不同的ZmAGOs基因可能是不同類型的根系分化及其功能的精細調控所必需的。

2.3 ZmAGOs與OsAGOs的微共線性分析

通過微共線性分析發現（圖4），玉米第10染色體的ZmAGO1c、ZmAGO2b，第2染色體的ZmAGO2a和ZmAGO1b與水稻第4染色體的OsAGO1b、OsAGO2的片段高度同源；玉米第9染色體的ZmAGO10a，第6染色體的ZmAGO10b與水稻第6染色體的OsPNH1高度同源；玉米第2染色體的ZmAGO18a，第1染色體的ZmAGO18b與水稻第7染色體的OsAGO18高度同源。由此推測玉米和水稻分化后，可能玉米的部分基因組序列發生了重復或加倍。

3 討論

小RNA介導的基因沉默在植物的生長發育和抗逆脅迫響應等方面均發揮重要作用，RISC作為小RNA 行使功能的主要組分，AGO蛋白是核心元件，甚至有學者認為研究AGO蛋白所結合的小RNA的表達量比整體研究小RNA的表達量更能說明某種小RNA的功能[24]。近年來，在植物中開展關于AGO蛋白功能及其結合的小RNA類型的研究越來越多，使得AGO蛋白的研究成為小RNA調控途徑的熱點。目前，AGO基因的功能在模式植物擬南芥中的研究最為全面和透徹，而在玉米中的報道較少。Qian等利用B73 RefGen v1的基因組序列對玉米全基因組的AGO蛋白進行了預測和表達分析，結果顯示，玉米基因組存在18個AGO基因，并以玉米幼苗為材料對AGO基因家族在干旱和鹽脅迫下的表達模式進行了分析[25]。許鑫等以玉米自交系昌7-2為材料，研究了6個AGO基因在玉米幼苗第1葉、第2葉、第3葉、第4葉、總根、莖尖和胚芽鞘中的表達情況[26]。Zhai等利用B73 RefGen v2基因組序列發現了17個編碼AGO蛋白的基因，并選取了8個包含營養組織和生殖組織的材料進行了表達分析，結果顯示，所有AGO家族基因在生殖組織的表達遠高于營養組織[16]，這與水稻中OsAGOs的表達模式相似[15]，預示著小RNA在生殖生長階段發揮重要的調控作用。

根系是玉米重要的組織器官，在保持植株形態、水分和營養吸收與運輸、響應植物對環境脅迫等方面起著重要的作用。本研究以Zhai等報道的17個ZmAGO基因為研究對象，以玉米自交系B73為材料，對該基因家族成員的基因結構進行了解析，并將玉米幼苗的4種根系分別取材進行表達分析，結果發現，ZmAGOs有6個成員存在5′非翻譯外顯子，可能AGO基因家族受到此機制的調控[16]；對ZmAGOs在各類根系中的表

達分析表明，有些ZmAGOs基因顯示出其在不同類型根組織中表達的特異性，如ZmAGO2b、ZmAGO9在冠根、初生胚根和側根中表達，但在次生胚根中未檢測到其表達，ZmAGO5d、ZmAGO4則冠根、次生胚根和側根中表達，但在初生胚根中未檢測到其表達，說明選擇性地表達不同的ZmAGOs基因可能是不同類型的根系分化及其功能的精細調控所必需的。

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