外源ABA處理的玉米葉片酵母雙雜交cDNA文庫的構建及評價

馬芳芳+蔣明義

摘要：為深入研究ABA信號轉導機制以及篩選該信號途徑中相關重要蛋白的相互作用，利用Gateway技術，以外源ABA處理的玉米葉片為材料首先構建了cDNA初級文庫，初級文庫再通過LR重組的方式最終構建成以pDEST22為目的載體的酵母雙雜交cDNA文庫。經質量鑒定，該文庫的滴度為3.9×106 CFU/mL，文庫總容量達到1.17×107 CFU，平均插入cDNA片段長度大于800 bp，重組率大于95%。結果表明所獲酵母雙雜交文庫質量較高，符合文庫構建的標準，保證了文庫的覆蓋度，為進一步開展互作蛋白篩選的后續工作奠定了基礎。

關鍵詞：ABA；玉米；酵母雙雜交；cDNA文庫；滴度；重組率；互作蛋白

中圖分類號： S513.01；Q78

文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2016）04-0058-04

脫落酸（ABA）是一種重要的植物激素，它在植物生長發育的各個方面，包括種子發育、萌發和休眠、營養生長及對各種生物、非生物脅迫的響應等方面起作用[1-2]。水分脅迫下（包括干旱、鹽漬），植物體通過迅速積累ABA以促進氣孔關閉以及調節眾多基因的表達，從而使植株對逆境環境做出適應反應[3-6]。大量研究表明，ABA信號轉導是一個非常復雜的網絡，許多重要的中間組分如胞內鈣離子、鈣調素、磷酸肌醇、cADPR、H+、活性氧、一氧化氮以及蛋白可逆磷酸化等都在ABA信號轉導途徑中發揮著重要的作用[7]。然而ABA參與的許多信號途徑的詳細過程特別是具體的分子作用機理仍有待闡明，鑒定參與ABA信號途徑的細胞組分，并對其功能進行闡明分析，將有助于我們提高對ABA信號轉導途徑的認識。

酵母雙雜交系統是一種用來研究蛋白質間相互作用的簡便、快速而有效的方法[8]，該方法由Fields和Song于1989年首先建立，至今被廣泛應用于生物研究的各個領域[9-10]。它的一個很重要的功能就是發現新的蛋白質以及發現蛋白質的新功能，即從cDNA文庫中篩選出與已知蛋白相互作用的未知蛋白，進而為探索該蛋白的相關特性及功能奠定基礎[11-15]。所以，高質量酵母雙雜交 cDNA 文庫的構建是利用酵母雙雜交技術進行大規模互作蛋白篩選的前提和保障[16]。近年來，針對許多重要農作物如水稻[17]、小麥[18]、大麥[19]、玉米[20]等，眾多學者構建了以不同組織、器官、細胞類型或分化時期為材料的酵母雙雜交cDNA文庫，為相關作物的蛋白質組學研究提供了基礎。然而國內外關于外源ABA處理的玉米cDNA文庫的相關研究還未見報道，本研究以施用外源ABA的玉米為材料，利用Gateway技術構建了ABA處理的玉米葉片酵母雙雜交cDNA文庫，旨在有效地分離與已知蛋白相互作用的靶蛋白，以期為深入研究ABA信號網絡提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 植物材料 以玉米（Zea mays L.）雜交種農大108為材料，將玉米種子浸泡12 h后，25 ℃催芽，挑取發芽一致的種子播于含有營養液的沙土中培養[晝/夜溫度28 ℃/22 ℃，光照度200 μmol/（m2·s），相對濕度75%，晝/夜光周期14 h/10 h]。當幼苗的第2片真葉完全展開時，用鋒利的刀片將玉米幼苗從莖基部快速切割下來，放在純水中2 h以消除傷害脅迫[21]，然后用100 μmol/L外源ABA進行處理[溫度25 ℃、光強200 μmol/（m2·s）]，在不同的處理時間點（0.25、0.5、1、2、4、8、12、24 h），分別剪取第2片葉，迅速置于液氮中冷凍，將最終所得材料混合均勻，-80 ℃ 保存備用。

1.1.2 菌株和載體 大腸桿菌DH10B、文庫載體pDONR222（用于構建初級文庫）、pDEST22（用于構建酵母雙雜交文庫）均購自Invitrogen公司。

1.1.3 主要試劑 Trizol Reagent、CloneMiner cDNA Library Construction Kit、FastTrack 2.0 mRNA Isolation Kit、1 kb Plus DNA Ladder、UltraPureTMPhenol-Chloroform-Isoamyl Alcohol （體積比25 ∶24 ∶1） 購自Invitrogen公司；氨芐青霉素、卡那霉素為Sigma公司產品；Taq DNA Polymerase、DNA Marker Ⅲ、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、質粒小提試劑盒購自天根生化科技有限公司。

1.1.4 引物 M13 Forward，5′-GTAAAACGACGGCCAG-3′； M13 Reverse，5′-CAGGAAACAGCTATGAC-3′； pDEST22 Forward，5′-TATAACGCGTTTGGAATCACT-3′； pDEST22 Reverse，5′-AGCCGACAACCTTGATTGGAGAC-3′。所用引物由上海生工生物技術有限公司合成。

1.2 玉米葉片酵母雙雜交cDNA文庫的構建

1.2.1 玉米葉片總RNA的提取和mRNA的純化 取玉米葉片，在預冷的研缽中將其用液氮研磨成細粉，用Trizol提取其總RNA，具體過程參照說明書進行。得到的總RNA經過質量及純度檢測之后，用于下一步的mRNA純化操作，具體的純化過程參照FastTrack2.0 Kit說明書進行。得到的mRNA經質量及純度檢測之后，用于下一步的文庫構建操作。

1.2.2 cDNA初級文庫的構建 參照CloneMiner cDNA Library Construction Kit說明書，按以下步驟進行：首先將上步純化得到的mRNA進行cDNA第1鏈的合成；然后進行cDNA第2鏈的合成及純化；cDNA與三框重組接頭attB1 Adapter連接后進行cDNA的分級分離及收集；利用Gateway技術將收集得到的cDNA與入門文庫載體質粒pDONR222混合進行BP重組反應；重組反應產物經Proteinase K處理以及純化之后，利用電轉化法轉入大腸桿菌DH10B；加入1 mL SOC培養基，37 ℃培養1 h，即為cDNA初級文庫菌液；加甘油至終濃度20%，-80 ℃保存備用。

1.2.3 酵母雙雜交cDNA文庫的構建 參照CloneMiner cDNA Library Construction Kit說明書，將上述得到的cDNA初級文庫菌液接種于含有卡那霉素抗性的肉湯培養基中，30 ℃過夜培養；第2天中抽質粒并檢測吸光度；將中抽得到的質粒稀釋到終濃度300 ng/μL，取出其中1 μL，利用Gateway技術將其與酵母雙雜交文庫載體質粒pDEST22（含GAL4 Transcriptional-Activation Domain）混合進行LR重組反應；重組反應產物經Proteinase K處理以及純化之后，利用電轉化法轉入大腸桿菌DH10B；加入3 mL SOC培養基，37 ℃培養1 h，即為酵母雙雜交cDNA文庫菌液；加甘油至終濃度20%，-80 ℃保存備用。

1.2.4 文庫質量的鑒定

1.2.4.1 庫容量的鑒定 分別從“1.2.2”節和“1.2.3”節得到的轉化后文庫細菌原液中取出10 μL，稀釋1 000倍后，從中吸出50 μL涂布于含有相應抗性的LB平板上（初級文庫鑒定平板使用卡那霉素抗性、酵母雙雜交文庫鑒定平板使用氨芐青霉素抗性），37 ℃培養12～16 h后進行計數，根據公式：文庫滴度（CFU/mL）=平板克隆數×稀釋倍數/涂板體積；文庫總容量（CFU）=文庫滴度×文庫總體積，計算出文庫的滴度以及總容量。

1.2.4.2 重組率和插入片段長度鑒定 從平板上隨機挑取24個單克隆進行菌落PCR，初級文庫菌落PCR使用的引物Primer 1和引物Primer 2分別是M13 Forward和M13 Reverse，酵母雙雜交文庫菌落PCR使用的引物Primer 1和引物Primer 2分別是pDEST22 Forward和pDEST22 Reverse，PCR反應條件：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，56 ℃復性30 s，72 ℃延伸3 min，共30個循環；72 ℃延伸10 min；4 ℃保溫。PCR產物用1% Agarose 凝膠電泳檢測，鑒定插入片段大小和陽性克隆重組率。

2 結果與分析

2.1 玉米葉片總RNA和純化的mRNA質量分析

利用Trizol Reagent提取了外源ABA處理的玉米葉片總RNA，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，可見28S和18S條帶明亮清晰，亮度比約2 ∶1，表明該總RNA完整性好且基本上未發生降解（圖1）。經總RNA紫外分析測定，結果顯示D260 nm/D280 nm為1.95，表明總RNA純度好，符合實驗要求，可用于后續實驗操作。總RNA樣品經過分離純化后得到了mRNA，電泳圖結果可見其在較大范圍內呈涂布狀分布（圖2），與預期結果相符，說明純度較高，完整性較好。

2.2 cDNA初級文庫的質量鑒定

2.2.1 庫容量測定 從cDNA初級文庫原始菌液中取出10 μL，稀釋1 000倍后，吸出50 μL涂布于含卡那霉素抗性的LB平板上，37 ℃培養12～16 h后計菌落數，結果為643個（圖3），菌液量為1 mL。根據公式：文庫滴度（CFU/mL）=平板克隆數×稀釋倍數/涂板體積；文庫總容量（CFU）=文庫滴度×菌液總體積，計算得出：cDNA初級文庫的滴度=643×1 000/0.05=1.28×107 CFU/mL；cDNA初級文庫的總容量=1.28×107 CFU/mL×1 mL=1.28×107 CFU。

2.2.2 重組率和插入片段大小測定 從平板上隨機挑取24個單克隆進行菌落PCR，PCR產物用1% Agarose 凝膠電泳檢測，根據電泳圖，可以看出所有克隆的PCR結果都呈陽性，重組率達100%，插入cDNA片段長度大小不等，主要分布在500～3 000 bp范圍內，多態性較好，且平均插入片段長度大于1 000 bp（圖4）。

2.3 酵母雙雜交文庫cDNA文庫的質量鑒定

2.3.1 庫容量測定 從酵母雙雜交cDNA文庫原始菌液中取出10 μL，稀釋1 000倍后，吸出50 μL涂布于含氨芐青霉素抗性的LB平板上，37 ℃培養12～16 h后計菌落數，結果為195個（圖5），菌液量為3 mL。根據公式：文庫滴度（CFU/mL）=平板克隆數×稀釋倍數/涂板體積；文庫總容量（CFU）=文庫滴度×菌液總體積，計算得出：酵母雙雜交文庫的滴度=195×1 000/0.05=3.9×106 CFU/mL；酵母雙雜交文庫的總容量=3.9×106 CFU/mL×3 mL=1.17×107 CFU。

2.3.2 重組率和插入片段大小測定 從平板上隨機挑取24個單克隆進行菌落PCR，PCR產物用1% Agarose 凝膠電泳檢測，從電泳圖中可以看出24個克隆中有23個為陽性結果，重組率大于95%，cDNA插入片段長度大小不等，主要分布在500～3 000 bp范圍內，多態性較好，且平均插入片段長度大于800 bp（圖6）。

3 討論

一個高質量酵母雙雜交 cDNA 文庫的獲得，能夠為我們進行大規模互作蛋白的篩選提供前提和保障，對于我們研究相關生物的功能蛋白質組學具有重要意義。目前很多生物種類的cDNA文庫已經獲得，并且在此基礎上獲得了大量的信息[17-20]，然而關于外源ABA處理的玉米cDNA文庫的相關研究還未見報道。已有的研究發現，一些蛋白激酶如MAPK[22]、CCaMK[23-25]、CDPK[26]等在ABA誘導的抗氧化防護過程中發揮著重要的作用，我們擬利用酵母雙雜交技術篩選與這些蛋白相互作用的靶蛋白，進而探究該蛋白在ABA信號途徑中的具體作用機制，因此，外源ABA處理的玉米葉片酵母雙雜交cDNA文庫的建立就成為了不可或缺的重要基礎工具。

RNA質量的好壞直接影響文庫質量的高低，本研究中提取的玉米葉片總RNA純度高、完整性好且基本上未發生降解，經分離純化后得到的mRNA在較大范圍內呈涂布狀分布，具有較高的純度和完整性，可用于后續的文庫構建。本研究在構建酵母雙雜交cDNA文庫的過程中使用了Gateway技術，一種基于已研究的非常清楚的λ噬菌體位點特異性重組系統，該系統能夠高效而快速地將DNA定向重組進入不同的載體系統中，進而應用于蛋白的表達與功能分析[27-29]。由于在載體構建時無需經歷限制性內切酶的酶切和酶連等過程，并且通過引入3種不同的接頭使得插入片段能夠包含3種不同的讀碼方式，這樣既降低了嵌合克隆出現的概率、保證了插入片段的序列完整性，同時又克服了由于插入片段中非編碼區帶有終止密碼子而造成的蛋白提前終止翻譯，有效地提高了文庫的完整性和覆蓋性[30]。

通常一個高質量的cDNA文庫，其庫容量應至少大于 1×106 CFU，這樣才能保證cDNA種類的完整性以及文庫的代表性。本試驗對構建的玉米葉片酵母雙雜交cDNA文庫的分析結果表明，庫容量為1.17×107 CFU，保證了文庫的覆蓋度。而平均插入cDNA片段長度則體現了文庫遺傳信息的完整性，如果大部分克隆插入了全長cDNA序列，則說明文庫的完整性好。本試驗構建的文庫重組率大于95%，平均插入cDNA 片段長度大于800 bp，說明該文庫達到了高質量文庫的標準，可以用來進行后續的大規模互作蛋白的篩選試驗。

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