紅毛菜28SrDNA和IGS序列分析及系統(tǒng)發(fā)育

徐佳杰+姜波+朱建一+何淵+沈宗根

摘要：為了探討中國境內(nèi)紅毛菜的物種關(guān)系及親緣關(guān)系，對紅毛菜核糖體基因的28S rDNA、IGS序列進行了研究。28S rDNA序列分析結(jié)果顯示：江蘇（LYG、NT）、福建（NRD1、NRD2）、廣東（NA1、NA2、NA3）的7個海水紅毛菜遺傳距離為0～0.004；而威海（WH）的海水紅毛菜與其他海水紅毛菜的遺傳距離為0.144～0.147；山西娘子關(guān)（NZG）、甘肅興隆山（XLS）的2個淡水紅毛菜之間的關(guān)系極近，遺傳距離為0.001；淡水紅毛菜與威海的海水紅毛菜的遺傳距離（0.125）小于淡水紅毛菜與其他7個海水紅毛菜的遺傳距離（0.210～0.213）。對江蘇、福建、廣東的7個海水紅毛菜的IGS序列進行分析顯示，7個海水紅毛菜親緣關(guān)系極近?；?8S rDNA序列的系統(tǒng)進化樹顯示，中國境內(nèi)采集到的紅毛菜分為3個進化分支：2個淡水紅毛菜形成獨立1支，而海水紅毛菜則分為2個進化分支，其中威海的海水紅毛菜單獨為1個分支，其他7個海水紅毛菜歸為另1個分支。由此推測，目前為止中國境內(nèi)至少存在3種紅毛菜。

關(guān)鍵詞：紅毛菜；28S rDNA；IGS；分類學(xué)

中圖分類號： Q968.43+9；S188+.1

文獻標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2016）04-0066-04

紅毛菜（Bangia）屬紅藻門（Rhodophyta）紅藻綱（Rhodophyceae）紅毛菜亞綱（Bangiaophycidae）紅毛菜目（Bangiales）紅毛菜科（Bangiaceae）[1]。紅毛菜的形態(tài)極其簡單，為直立不分枝的絲狀紅藻[2]。紅毛菜在全球的分布極為廣泛，從北半球的北歐到南半球的新西蘭都有分布[3]，包括海水環(huán)境、淡水環(huán)境[4]。紅毛菜的傳統(tǒng)分類方法是根據(jù)其形態(tài)（藻體長度、直徑和顏色）、染色體數(shù)目、繁殖方式、生活環(huán)境和地理分布等特征進行研究[5-6]。由于紅毛菜形態(tài)結(jié)構(gòu)極其相似，且易受棲息環(huán)境的影響而發(fā)生變化[5]，因此僅依據(jù)傳統(tǒng)分類學(xué)方法已經(jīng)不能滿足紅毛菜的分類需求，不少研究者開始從分子水平對紅毛菜進行分類研究[7-8]。

紅毛菜核糖體RNA基因序列由18S rDNA、5.8S rDNA、28S rDNA構(gòu)成1個轉(zhuǎn)錄單元，彼此之間被轉(zhuǎn)錄內(nèi)間隔區(qū)（ITS1、ITS2）隔開；轉(zhuǎn)錄單元之間則被基因內(nèi)間隔區(qū)（IGS）隔開[9-10]。核糖體RNA基因序列不同區(qū)域由于功能需要不同，承受不同的選擇壓力而表現(xiàn)出不同的進化速率，如編碼區(qū)序列（18S rDNA、5.8S rDNA、28S rDNA）具有功能需要，承受較高的選擇壓力而表現(xiàn)出較慢的進化速率，適用于種屬間及以上水平的分類研究[11-12]；非編碼區(qū)序列（ITS1、ITS2、IGS）則沒有功能需要，承受較低的選擇壓力而表現(xiàn)出較快的進化速率，適用于種屬間甚至種下水平的分類研究[13-15]。Freshwater等根據(jù)28S rDNA對紅藻的13個物種進行序列分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)13個物種可以分為11目[11]，由此推測28S rDNA可能更適合用于紅藻較高階元間的系統(tǒng)發(fā)育研究。Pecchia等對向日葵莖潰瘍病菌（Diaporthe helianthi）的18S rDNA 5′端的部分IGS序列進行分析，結(jié)果顯示：來自阿根廷、法國、意大利、南斯拉夫、羅馬尼亞的病菌可以分為3個獨立的菌群[16]。

本研究首次對采自中國沿海地區(qū)、內(nèi)陸地區(qū)10個不同采集地的紅毛菜進行28S rDNA的分子系統(tǒng)學(xué)研究，分析中國境內(nèi)紅毛菜的物種關(guān)系。同時對江蘇省、福建省、廣東省的7個海水紅毛菜的IGS序列進行分析，以探討不同地區(qū)海水紅毛菜間的親緣關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

10個紅毛菜采集地分別是山東威海（WH）、江蘇連云港（LYG）、江蘇南通（NT）、福建莆田南日島（2個采集地：NRD1、NRD2）、廣東汕頭南澳（3個采集地：NA1、NA2、NA3）的8個海水紅毛菜，以及山西陽泉娘子關(guān)（NZG）、甘肅蘭州興隆山（XLS）的2個淡水紅毛菜，具體信息見表1。將采集到的材料分別用海水、淡水初步清洗后陰干，置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 DNA的提取

采用CTAB法對采自不同地理群的紅毛菜進行DNA提取[17]，通過1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測所提取DNA的完整性，置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 PCR擴增

引物序列如表2所示，PCR引物由蘇州金維智生物科技有限公司合成。PCR反應(yīng)體系為50 μL，包括：5 μL 10×LA Taq PCR Buffer Ⅱ（Mg2+Plus），5 μL dNTP Mixture （2.5 mmol/L），2 μL DNA模板，各1 μL上、下游引物（20 μmol/L），0.5 μL LA Taq（5 U/μL），35.5 μL ddH2O。PCR反應(yīng)條件為：95 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，30個循環(huán)；72 ℃ 7 min。

1.4 克隆與測序

PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳檢測后，采用試劑盒切膠回收，將回收的目的片段與pEASY-T3載體連接，于25 ℃連接15 min。然后將連接產(chǎn)物導(dǎo)入Trans1-T1感受態(tài)細胞，冰浴30 min，熱激30 s，再冰浴2 min。完成連接轉(zhuǎn)化后，加LB液體培養(yǎng)基于37 ℃搖菌復(fù)蘇，然后均勻涂抹在LB固體培養(yǎng)基上，37 ℃恒溫培養(yǎng)過夜。最后挑選陽性克隆樣品送蘇州金維智生物科技有限公司進行測序。

1.5 序列分析

通過NCBI中的BLAST軟件對測序獲得的序列與GenBank 中的序列進行同源性比對，以確定其為正確序列。用DNAMAN軟件對樣品進行多序列比對，手工調(diào)整個別堿基。通過MEGA6.06軟件計算序列兩兩之間的遺傳距離并構(gòu)建ML系統(tǒng)進化樹[18]，自舉重復(fù)數(shù)為1 000，其他參數(shù)均為默認值。系統(tǒng)進化樹所用到的序列名稱和登錄號見表3。

2 結(jié)果與分析2.1 28S rDNA、IGS序列的PCR擴增

以 ITS-LF/LR1為引物，連云港（LYG）、南通（NT）、南日島1、南日島2（NRD1、NRD2）、南澳1、南澳2、南澳3（NA1、NA2、NA3）的海水紅毛菜基因組DNA為模板，均成功擴增出1條大小約2 100 bp的目的條帶（圖1-a）。以威海（WH）的海水紅毛菜基因組DNA為模板，擴增獲得的PCR產(chǎn)物為單一明亮條帶，大小約為2 000 bp（圖1-b）。以I2LF/I2LR為引物，娘子關(guān)（NZG）、興隆山（XLS）的淡水紅毛菜基因組DNA為模板，擴增獲得大小約2 400 bp的單一明亮條帶（圖1-c）。以 IGSF1/IGSR1為引物，海水紅毛菜（除WH以外）基因組DNA為模板，擴增獲得的PCR產(chǎn)物為單一明亮條帶，大小約為1 600 bp（圖1-d）。

在NCBI中進行比對，確定其為紅毛菜的28S rDNA序列，剪去上游5.8S rDNA、ITS區(qū)序列后，獲得不同地理群紅毛菜的28S rDNA序列長度分別為：威海（WH）的海水紅毛菜為1 514 bp，其他7個海水紅毛菜均為1 541 bp，淡水紅毛菜均為1 855 bp。江蘇省、福建省、廣東省的7個海水紅毛菜擴增獲得的IGS序列與福建莆田的海水紅毛菜IGS序列（KR010939）比對后，相似性極高，約為99%，因此確定它們?yōu)楹Ｋt毛菜的IGS序列，且不同地理群海水紅毛菜的IGS序列長度為1 645～1 646 bp。

2.2 不同地理群28S rDNA、IGS序列的比對分析

將不同地理群測序獲得的28S rDNA序列比對后，對齊剪切，用MEGA 6.06生物信息學(xué)軟件計算序列的遺傳距離。由表4可見，在海水種群中，連云港（LYG）、南通（NT）、南日島2個品種（NRD1、NRD2）、南澳3個品種（NA1、NA2、NA3）的7個海水紅毛菜之間遺傳距離為0～0.004，其中連云港（LYG）、南澳1（NA1）、南澳3（NA3）的28S rDNA序列相同。威海（WH）的海水紅毛菜與其他采集點的7個海水紅毛菜之間的遺傳距離為0.144～0.147。娘子關(guān)（NZG）、興隆山（XLS）的2個淡水紅毛菜之間的遺傳距離為0.001。淡水紅毛菜與海水紅毛菜之間的遺傳距離較遠，其中與威海（WH）的海水紅毛菜的遺傳距離為0.125，與其他7個海水紅毛菜的遺傳距離為0.210～0.213。根據(jù)上述結(jié)果分析，初步推測連云港（LYG）、南通（NT）、南日島2個品種（NRD1、NRD2）、南澳3個品種（NA1、NA2、NA3）的海水紅毛菜為1個類群，進而采用進化速率較快的IGS序列對這些地理群的海水紅毛菜進行分析，結(jié)果見表4。可以看出，采自江蘇省、福建省、廣東省的7個海水紅毛菜的IGS片段序列遺傳距離極近，為 0～0.003，其中連云港（LYG）、南通（NT）的IGS序列相同。

2.3 基于28S rDNA序列構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹

由于GenBank中已有的紅毛菜科28S rDNA序列較少，且僅有的幾個紫菜序列也只是28S rDNA上游序列，因此選取長度適宜的紫菜28S rDNA序列與本研究中的紅毛菜28S rDNA上游序列進行系統(tǒng)進化樹的構(gòu)建。石花菜目Capreolia implexa（AF039545）為外類群，系統(tǒng)進化樹見圖2?？梢钥闯觯哼B云港（LYG）、南通（NT）、南日島2個品種（NRD1、NRD2）、南澳3個品種（NA1、NA2、NA3）的7個海水紅毛菜歸于1個進化分支，置信度為100%；威海（WH）的海水紅毛菜單獨歸于1個大分支上；8個海水紅毛菜與紫菜聚類為1支，為2個淡水紅毛菜的姐妹分支；娘子關(guān)（NZG）、興隆山（XLS）的淡水紅毛菜則歸為另1個分支，置信度為100%。

3 討論與結(jié)論

3.1 28S rDNA序列遺傳距離和系統(tǒng)進化樹分析

國內(nèi)外關(guān)于28S rDNA序列應(yīng)用于物種分類與進化的研究相對較少，僅有幾位研究者對紅藻不同物種的28S rDNA進行研究。Freshwater等報道了石花菜目中16個石花菜物種的28S rDNA序列差異度小于rbcL且大于18S rDNA的差異度，介于兩者之間，發(fā)現(xiàn)其研究價值不亞于18S rDNA、rbcL序列[11，21]。Harper等研究珊瑚藻28S rDNA序列時曾推測，28S rDNA序列具有區(qū)分親緣關(guān)系較近的物種的潛能[22]。從本研究數(shù)據(jù)中可以看出，不同物種間28S rDNA上游序列的遺傳距離為0.125～0.213，顯然28S rDNA序列在種間及種以上水平的分類鑒定能力較好，驗證了Harper等的推測：28S rDNA 具有區(qū)分鑒定親緣關(guān)系較近的相關(guān)物種的潛能，在未來具有較大的發(fā)展前景[9]。

根據(jù)紅毛菜28S rDNA上游序列比對分析后，10個地理群的紅毛菜大致分為3個類群。結(jié)合GenBank中已有的紫菜28S rDNA序列構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，結(jié)果顯示，10個地理群紅毛菜分為3個進化分支：其中連云港（LYG）、南通（NT）、南日島2個品種（NRD1、NRD2）、南澳3個品種（NA1、NA2、NA3）的7個海水紅毛菜歸為1個分支；而威海的海水紅毛菜則與其他7個海水紅毛菜差異較大，獨立歸為1個大分支，顯示了海水紅毛菜的多樣性；娘子關(guān)（NZG）、興隆山（XLS）的2個淡水紅毛菜則單獨歸為1個分支，且與海水紅毛菜存在明顯差異。

3.2 IGS序列遺傳距離分析

有研究報道，在種內(nèi)及種間系統(tǒng)進化分析中，IGS序列的變異率高于ITS1、ITS2[9，23]，一般用于親緣關(guān)系較近的物種或者種內(nèi)分析。先后有多位研究者對不同物種的遺傳多樣性等方面進行研究[24-26]。Li等對采自莆田、汕頭、寧波3個產(chǎn)地的栽培壇紫菜的部分IGS進行分析，在1 085～1 100 bp的序列中存在55個變異位點，即約5%的變異率，因此推測IGS可以作為紅藻種內(nèi)研究的分子標(biāo)記[27]。根據(jù)紅毛菜核糖體基因28S rDNA序列分析結(jié)果及系統(tǒng)進化樹，可以確定采自江蘇省、福建省、廣東省的7個海水紅毛菜是同一類群，利用部分IGS序列對這7個海水紅毛菜的種內(nèi)親緣關(guān)系進行分析。IGS序列遺傳距離的分析結(jié)果顯示，7個地理群的海水紅毛菜遺傳距離極近（0～0.003），幾乎沒有差別，因此可以認為這7個地理群的海水紅毛菜關(guān)系緊密，可能為同一物種。

結(jié)合不同地理群紅毛菜核糖體28S rDNA、IGS序列分析結(jié)果及基于28S rDNA構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹可知，本研究中采集到的紅毛菜具有物種多樣性，淡水紅毛菜與海水紅毛菜之間存在明顯區(qū)別，海水紅毛菜存在遺傳多樣性，且采自江蘇省、福建省、廣東省的7個海水紅毛菜之間關(guān)系緊密，可能由1個物種起源而來。從目前數(shù)據(jù)可知，28S rDNA可以用于紅毛菜種及種以上水平分類研究。此外，由于目前紅毛菜和紫菜等紅藻的28S rDNA序列的數(shù)據(jù)有限，將來仍需更多研究來補充和完善此系統(tǒng)進化樹，為研究紅毛菜科物種多樣性、遺傳多樣性以及保護紅毛菜的種質(zhì)資源提供參考。

參考文獻：

[1]鄭寶福，李 鈞. 中國海藻志[M]. 北京：科學(xué)出版社，2009：83-104.

[2]許 璞，張學(xué)成，王素娟，等. 中國主要經(jīng)濟海藻的繁殖與發(fā)育[M]. 北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2013：165-189.

[3]汪文俊，王廣策，許 璞，等. 紅毛菜生物學(xué)研究進展 Ⅰ.生活史和有性生殖研究[J]. 海洋科學(xué)，2008，32（4）：92-96.

[4]錢樹本，劉東艷，孫 軍. 海藻學(xué)[M]. 青島：中國海洋大學(xué)出版社，2005：91-95.

[5]Sheath R G，Cole K M. Systematis of Bangia （Rhodophyta） in North America. Ⅰ. Biogeographic trends in morphology[J]. Phycologia，1984，23（3）：383-396.

[6]張學(xué)成，秦 松，馬家海，等. 海藻遺傳學(xué)[M]. 北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2005：308-318.

[7]Müller K M，Cole K M，Sheath R G. Systematics of Bangia（Bangiales，Rhodophyta）in North America. Ⅱ. Biogeographic trends in karyology：chromosome numbers and linkage with gene sequence phylogenetic trees[J]. Phycologia，2003，42（2）：209-219.

[8]Müller K M，Sheath R G，Vis M L，et al. Biogeography of Bangia （Bangiales，Rhodophyta） based on the RuBisCo spacer，rbcL gene and 18S rRNA gene sequences and morphometric analysis.1. North America[J]. Phycologia，1998，37（3）：195-207.

[9]Harper J T，Saunders G W. The application of sequences of the ribosomal cistron to the systematic and classification of the florideophyte red algae （Florideophyceae，Rhodophyta）[J]. Cahiers de Biologie Marine，2001，42（1）：25-38.

[10]翟中和，王喜中，丁明孝.細胞生物學(xué)[M]. 北京：高等教育出版社，1995：367-369.

[11]Freshwater D W，F(xiàn)redericq S，Bailey J C. Characteristic and utiliy of nuclear-encoded large-subunit ribosomal gene sequences in phylogenetic studies of red algae[J]. Phycological Research，1999，47（1）：33-38.

[12]le Gall L，Saunders G W. A nuclear phylogeny of the Florideophyceae （Rhodophyta） inferred from combined EF2，small subunit and large subunit ribosomal DNA：establishing the new red algal subclass Corallinophycidae[J]. Molecular Phylogenetics and Evolution，2007，43（3）：1118-1130.

[13]戴小軍，歐立軍，李文嘉，等. 栽培稻種內(nèi)rDNA基因IGS序列分析及系統(tǒng)學(xué)意義[J]. 作物學(xué)報，2008，34（9）：1569-1573.

[14]張寶玉，王廣策，呂頌輝，等. 三株赤潮硅藻5.8S rDNA及轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）的克隆及序列分析[J]. 海洋學(xué)報：中文版，2006，28（1）：111-117.

[15]丁小余，王崢濤，徐 紅，等. 楓斗類石斛rDNA ITS區(qū)的全序列數(shù)據(jù)庫及其序列分析鑒別[J]. 藥學(xué)學(xué)報，2002，37（7）：567-573.

[16]Pecchia S，Mercatelli E，Vannacci G. Intraspecific diversity within Diaporthe helianthi：evidence from rDNA intergenic spacer （IGS） sequence analysis[J]. Mycopathologia，2004，157（3）：317-326.

[17]楊君，王茜，劉美華，等. 一種簡便的海藻DNA提取方法[J]. 生物技術(shù)，1999，9（4）：40-43.

[18]Tamura K，Stecher G，Peterson D，et al. MEGA6：molecular evolutionary genetics analysis version 6.0[J]. Molecular Biology and Evolution，2013，30（12）：2725-2729.

[19]林中姮. 三種經(jīng)濟紅藻核糖體基因簇的克隆與分析[D]. 蘇州：蘇州大學(xué)，2012：39.

[20]李星辰. 條斑紫菜（Pyropia yezoensis）核糖體RNA基因（nrDNA）全長序列的克隆與分析[D]. 蘇州：蘇州大學(xué)，2014：33.

[21]Freshwater D W，Bailey J C. A multigene phylogeny of the Gelidiales including nuclear large-subunit rRNA sequence data[J]. Journal of Applied Phycology，1998，10（3）：229-236.

[22]Harper J T，Saunders G W. Molecular systematic of the Florideophyceae （Rhodophyta） using nuclear large and small subunit rDNA sequence data[J]. Journal of Phycology，2001，37（6）：1073-1082.

[23]Appels R，Dvorˇák J. The wheat ribosomal DNA spacer region：its structure and variation in populations and among species[J]. Theoretical and Applied Genetics，1982，63（4）：337-348.

[24]De Lucchini S，Andronico F，Nardi I. Molecular structure of the rDNA intergenic spacer （IGS） in Triturus：implications for the hypervariability of rDNA loci[J]. Chromosoma，1997，106（5）：315-326.

[25]Murakami A. Structural differences in the intergenic spacer of 18S-26S rDNA and molecular phylogeny using partial extrernal transcribed spacer sequence in hop，Humulu lupulus[J]. Breeding Science，2001，51（3）：163-170.

[26]Elisabetta M，Susanna P，Sandro C，et al. Sequence analysis of rDNA intergenic spacer region （IGS）as a tool for phylogenetic studies in Trichoderma spp.[J]. Journal of Zhejiang University，2004，30（4）：460-461.

[27]Li Y Y，Shen S D，He L H，et al. Sequence analysis of rDNA intergenic spacer （IGS） of Porphyra haitanensis[J]. Journal of Applied Phycology，2010，22（2）：187-193.王 琳，孫慶玲，劉 輝，等. 擬南芥缺失突變體at14a的比較轉(zhuǎn)錄組分析[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016，44（4）：70-74.