篦子三尖杉牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸合成酶基因的克隆與序列分析

齊小瓊+胡晨熙+李大衛

摘要：三尖杉是我國特有植物，主要含有生物堿、黃酮及萜類等生物活性物質。以篦子三尖杉為試驗材料，根據同源克隆的方法擴增三尖杉牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸合酶（GGPPS）基因，并通過生物信息的方法對該基因進行鑒定和分析。結果表明，篦子三尖杉GGPPS基因全長1 217 bp，含有1個完整的1 182 bp開放閱讀框（ORF），編碼393個氨基酸的蛋白序列，GGPPS蛋白相對分子量為43.042 ku，理論等電點（pI）為6.57，其二級結構主要由α-螺旋和無規則卷曲組成；蛋白質同源分析表明，三尖杉GGPPS含有多聚異戊二烯基合成酶家族中保守的5個特征性結構和2個富含天冬氨酸的區域；同源模建分析顯示，三尖杉GGPPS具有GGPPS蛋白典型的三維結構，特別與薄荷GGPPS蛋白的三維結構及活性位點極其相似；系統進化分析表明，三尖杉GGPPS蛋白歸屬植物進化支，且與加拿大紅豆杉、曼地亞紅豆杉、海南粗榧的GGPPS蛋白歸為同一分支。

關鍵詞：篦子三尖杉；萜類化合物；牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸合酶（GGPPS）；克??；序列分析；同源模建；系統進化

中圖分類號： S188；Q785

文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2016）04-0079-04

萜類化合物是植物代謝中數量最多的一類代謝物，以異戊二烯為結構單元，在植物的光合作用、呼吸作用、生長、發育、繁殖、信號轉導和防御中發揮重要作用。植物中存在的某些萜類具有重要的經濟價值和藥用價值，如紅豆杉（Taxus）中的二萜紫杉醇[1]、銀杏（Ginkgo biloba）中的二萜銀杏內酯和倍半萜白果內酯[2-3]、青蒿（Artemisia annua）中的倍半萜青蒿素[4]等。三尖杉屬（Cephalotaxus）植物主要含有生物堿、黃酮類化學成分，其中的三尖杉酯類生物堿由于具有明顯的抗癌活性得到了深入研究，關于黃酮類成分的研究較少。除此之外還含有一些萜類化合物，如二萜類的海松酸、柳杉酚等，初步研究表明，該類化合物對微生物有抑制作用[5]。牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸（geranylgeranyl diphosphate，GGPP）是包括紫杉醇、銀杏內酯、海松酸、柳杉酚在內的所有二萜類化合物的共同前體，由牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸合成酶（geranylgeranyl pyrophosphate synthase，GGPPS）催化，通過類異戊二烯合成途徑生成。在該反應途徑中，GGPPS催化15 C的法呢基焦磷酸（farnesylpyrophosphate，FPP）與5 C的異戊烯焦磷酸（isopentenylallyl diphosphate，IPP）縮合生成GGPP[6-7]。因此，GGPPS是紅豆杉植物合成紫杉醇、銀杏合成銀杏內酯、三尖杉屬植物合成海松酸和柳杉酚的關鍵酶之一。在三尖杉中克隆該基因并分析其序列的結構特征和進化模式，將為后續的功能研究和基因工程、代謝工程等技術手段大量獲得有用產物奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 植物材料 篦子三尖杉（Cephalotaxus oliveri）摘采于中國科學院武漢植物園，取其嫩葉立即置于液氮中保存備用。

1.1.2 主要分子生物學試劑 普通Taq DNA聚合酶、高保真 LA Taq 酶、dNTP等試劑，購自TaKaRa；DNA凝膠純化回收試劑盒，購于Axygen生物技術有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 篦子三尖杉GGPPS基因的克隆

1.2.1.1 引物的設計 用加拿大紅豆杉 （Taxus canadensis） GGPPS蛋白（登錄號：AADl6018）作為查詢序列，進行Blastp相似性搜索，在三尖杉屬植物海南粗榧（C. hainanensis）中得到1條同目標序列相似性較高的序列 （登錄號：GBHQ10039.1）。根據這條序列設計3對特異引物（分別位于中部和左右端部），詳見表1。

1.2.1.2 篦子三尖杉GGPPS基因的分段擴增 以提取的篦子三尖杉總DNA為模板，分別以F1-1、R1-2，F2-1、R2-2，F3-1、R3-2為引物進行PCR擴增。擴增體系為25 μL，包含2.5 μL 10×PCR buffer（Mg2+ plus），2 μL dNTP混合物（每種2.5 mmol/L），各1 μL引物（10 μmol/L），0.5 μL Ex-Taq（2 U/μL），1 μL DNA模板（25 ng/μL），補加17 μL的水。反應條件為：94 ℃ 5 min；94 ℃ 1 min，53 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，36個循環；72 ℃延伸8 min。

PCR結束后，進行DNA瓊脂糖凝膠電泳，對擴增的DNA進行檢測。

1.2.2 產物回收、測序 擴增片段的凝膠回收按照試劑盒說明書進行操作，將回收的目的片段送華大基因測序。

1.3 數據分析方法

采用BioEdit（North Carolina State University） 軟件對克隆測序得到的片段進行拼接。采用ORF finder進行開放閱讀框確定。運用DNAstar軟件推測氨基酸序列，運用分析蛋白質物理化學的Expasy Protparam軟件（http：//web.expasy.org/protparam）分析蛋白質的分子量、理論等電點、氨基酸組成。查詢Prosite數據庫查找蛋白質含有的序列模式和功能域，使用在線軟件SOPMA程序（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa_sopma.html）預測蛋白質二級結構并計算各種二級結構所占百分比。使用SWISS-MODEL服務器[8-10] （http：//swissmodel.expasy.org/），基于同源建模的原理，進行篦子三尖杉GGPPS三級結構的預測，預測結果用PyMOL軟件展示和編輯。

以篦子三尖杉GGPPS蛋白作為查詢序列，運用Blast工具（http//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）進行序列相似性搜索，并選取相似性較高的序列用MEGA 6軟件[11]中的鄰接算法進行進化樹的構建，其中多重序列比對使用Clustalx軟件進行。

2 結果與分析

2.1 篦子三尖杉GGPPS序列的獲得與分析

采用改良的CTAB 法獲取篦子三尖杉總DNA，并通過電泳進行純度檢測，結果見圖1。用引物F2-1、R2-2進行PCR擴增，最終獲得560 bp左右的三尖杉GGPPS的中間片段（圖1-A）。分別以引物F1-1、R1-2，F3-1、R3-2進行PCR擴增，最終分別獲得 700、750 bp左右的上、下游片段（圖1-B、1-C）。產物經回收純化和測序，用BioEditor軟件進行拼接，獲得1條總長為1 217 bp的GGPPS DNA序列。用ORF Finder軟件預測開放閱讀框（ORF），結果顯示：該DNA序列包含1段1 182 bp的完整編碼區，編碼393個氨基酸。將獲得的基因組DNA序列與已報道的海南粗榧mRNA進行比對發現，篦子三尖杉GGPPS基因不含有內含子，與大多數植物一樣，在外顯子-內含子的進化上是保守的。

2.2 篦子三尖杉GGPPS蛋白質序列結構特征分析

篦子三尖杉GGPPS基因完整的開放閱讀框（ORF）長為1 182 bp，編碼393個氨基酸（圖2），相對分子質量約為 43.042 ku，理論等電點為6.57。在氨基酸序列中，含量最高的為丙氨酸（Ala，39個）、亮氨酸（Leu，39個），均占9.92%；其次是賴氨酸（Lys，33個，占8.40%）、天門冬氨酸（Asp，29個，占7.28%）、蘇氨酸（Thr，27個，占6.87%）、纈氨酸（Val，27個，6.87%）。酸性氨基酸[天門冬氨酸（Asp）、谷氨酸（Glu）]總數52個，堿性氨基酸[精氨酸（Arg）、賴氨酸（Lys）]50個；總親水性平均系數為-0.147。Prosite數據庫比對發現，三尖杉GGPPS蛋白序列的177～193氨基酸位（氨基酸序列：LIhDDlpcmDnddfRRG）和311～323氨基酸位（氨基酸序列：VGllFQVvDDIlD）分別是2個多聚異戊二烯基合成酶的特異序列（圖3）。

SOPMA分析表明，α-螺旋（alpha helix，Hh）、無規則卷曲（random coil，Cc）是三尖杉GGPPS蛋白質二級結構的主要成分，組成α-螺旋、無規則卷曲、延伸鏈氨基酸比例分別為45.80%、41.48%、12.72%，不含其他結構。蛋白質三級結構是在二級結構的基礎上進一步盤繞、折疊形成的，決定了蛋白質的功能。在SWISS-MODEL服務器上預測篦子三尖杉GGPPS蛋白的三維結構，結果顯示，與薄荷（Menthax piperita）GGPPS蛋白同源性最高（PDB ID：3krp.2.A），為68.37%。以此結構為模型構建篦子三尖杉的三級結構，發現該蛋白具有植物GGPPS蛋白典型的三維結構，說明功能也非常類似，該蛋白在進化上很保守 （圖4）。

2.3 GGPPS蛋白質同源性分析與系統進化樹構建

Blast比對結果顯示，三尖杉GGPPS蛋白質序列與已報道的海南粗榧（C. hainanensis）、加拿大紅豆杉（T. Canadensis）、曼地亞紅豆杉（Taxus xmedia）、挪威云杉（Picea abies）、銀杏（Ginkgo biloba）、煙草（Nicotiana tabacum）、北美冷杉（Abies grandis）、馬尾松（Pinus massoniana）、橡膠樹（Hevea brasiliensis）、巴豆（Croton sublyratus）、大豆（Glycine max）、美花煙草（Nicotiana sylvestris）等12種高等植物GGPPS蛋白質的一致性分別為98.9%、89.5%、88.8%、70.4%、70.1%、54.3%、69.4%、67.6%、54.0%、54.5%、54.4%、54.5%。多序列同源比對分析結果表明，不同植物來源的GGPPS蛋白質的N末端差異很大，C末端保守性強。GGPPS蛋白在結構和功能上屬于多聚異戊二烯合成酶家族，該家族具有5個保守功能域（Ⅰ～Ⅴ），5個保守區域中包含2個富含天冬氨酸區域：DDXXXXD、DDXXD。在篦子三尖杉GGPPS氨基酸序列中存在這樣的5個保守結構域，結構域Ⅱ、結構域Ⅴ中也分別發現富含天冬氨酸的基序DDLPCMD、DDILD（圖5）。

采用Neighbor-joining算法，在MEGA 6軟件平臺上構建植物GGPPS的分子系統進化樹（圖6）。對比植物GGPPS分子系統進化樹，三尖杉GGPPS蛋白歸屬于裸子植物進化支，且與海南粗榧、加拿大紅豆杉、挪威云杉、北美冷杉、馬尾松的GGPPS蛋白歸為同一小分支（圖6）。被子植物、裸子植物GGPPS各形成獨立的分支，兩者形成姊妹關系，說明這兩大分支從同一祖先平行分化而來；該基因樹與物種樹基本吻合，說明該基因的進化與物種的分化基本一致。

3 結論

通過PCR技術克隆獲得的篦子三尖杉GGPPS DNA序列長度為1 217 bp，含有1 182 bp的完整開放閱讀框。三維結構模擬表明：該蛋白具有GGPPS蛋白典型的三維結構；多重序列比對顯示，三尖杉GGPPS 蛋白與其他物種來源的GGPPS蛋白相似性較高，尤其是與海南粗榧、加拿大紅豆杉、曼地亞紅豆杉的GGPPS相似性高達88%以上，它們都包含多聚異戊二烯合成酶家族的5個保守性結構域（圖5）。在三尖杉GGPPS蛋白的氨基酸序列的177～193、311～323位分別是2個多聚異戊二烯基合成酶的特異序列LIhDDlpcmDnddfRRG、VGllFQVvDDIlD（圖3），這2個保守的富含天冬氨酸的區域位于酶的催化活性位點，與IPP、烯丙基底物的結合有關。從結構到功能預測都顯示，克隆的基因具有典型的GGPPS特征，因此克隆的篦子三尖杉GGPPS編碼蛋白很可能參與或調節了三尖杉二萜類等物質的生物合成，但完全闡明三尖杉萜類化合物的生物合成和調控機制還需要進行進一步試驗驗證。

參考文獻：

[1]占愛瑤，由香玲，詹亞光. 植物萜類化合物的生物合成及應用[J]. 生物技術通訊，2010，21（1）：131-135.

[2]朱 俊，許 鋒，廖詠玲. 銀杏萜內酯調控研究進展[J]. 中國農學通報，2007，23（7）：301-305.

[3]張洪娟，譚碧玥，曹福亮. 銀杏GbGGPS基因的克隆及序列分析[J]. 南京林業大學學報：自然科學版，2013，37（4）：8-12.

[4]陳大華，葉和春，李國鳳，等. 植物類異戊二烯代謝途徑的分子生物學研究進展[J]. 植物學報，2000，42（6）：551-558.

[5]Politi M，Braca A，de Tommasi N，et al. Antimicrobial diterpenes from the seeds of Cephalotaxus harringtonia var. drupacea[J]. Planta Medica，2003，69（5）：468-470.

[6]Lange B M，Rujan T，Martin W，et al. Isoprenoid biosynthesis：the evolution of two ancient and distinct pathways across genomes[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2000，97（24）：13172-13177.

[7]Rodríguez-Concepción M，Boronat A. Elucidation of the methylerythritol phosphate pathway for isoprenoid biosynthesis in bacteria and plastids. A metabolic milestone achieved through genomics[J]. Plant Physiology，2002，130（3）：1079-1089.

[8]Biasini M，Bienert S，Waterhouse A，et al. SWISS-MODEL：modelling protein tertiary and quaternary structure using evolutionary information[J]. Nucleic Acids Research，2014，42（W1）：W252-W258.

[9]Arnold K，Bordoli L，Kopp J，et al. The SWISS-MODEL workspace：a web-based environment for protein structure homology modelling[J]. Bioinformatics，2006，22（2）：195-201.

[10]Benkert P，Biasini M，Schwede T. Toward the estimation of the absolute quality of individual protein structure models[J]. Bioinformatics，2011，27（3）：343-350.

[11]Tamura K，Stecher G，Peterson D，et al. MEGA6：molecular evolutionary genetics analysis version 6.0[J]. Molecular Biology and Evolution，2013，30（12）：2725-2729.趙金艷，盧 宏，張振武，等. 快速PCR介導的NeuroD-3′UTR的定點突變研究[J]. 江蘇農業科學，2016，44（4）：83-86.