甘藍型油菜心葉顏色性狀的遺傳和AFLP標記的篩選

淡亞彬+杜德志

摘要：在油菜育種過程中往往會應用到一些指示性狀，旨在研究甘藍型油菜心葉顏色遺傳規律、篩選擴增片段長度多態性（AFLP）標記。通過遺傳分析可知：甘藍型油菜的紫色心葉性狀受1對顯性基因控制，心葉紫色對心葉綠色呈顯性。用心葉紫色甘藍型油菜、心葉綠色甘藍型油菜構建F2、BC1分離群體，通過AFLP、BSA相結合的方法共從512對引物組合中篩選到6個與心葉紫色連鎖的AFLP標記。

關鍵詞：甘藍型油菜；心葉紫色；遺傳規律；AFLP

中圖分類號： S634.303.2

文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2016）04-0090-03

油菜作為世界四大油料作物之一，在我國的種植分布很廣泛，同時在人們的日常生活中擔當很重要的角色[1]。在油菜的各個生長過程中會出現不同的性狀遺傳，其中出現在苗期的有紫紅色心葉、紫色真葉、紫色幼莖、花葉、刺毛等[2]，前三者作為指示性狀最方便，于幼苗早期（即出現1～5張真葉時）就能判斷是否為真雜種，可在幼苗早期拔出雜株，從而大大加快選擇效率。作為具備理想指示性狀的材料還需具備1個必備條件——該性狀受環境影響小，且表現穩定，群體整齊一致，不出現農藝性狀和標記性狀分離的情況[3]。目前，已有育種單位選育出雙低甘藍型紫紅葉油菜材料[4]。

在植物生長過程中，在不同階段所合成的葉綠素、葉黃素、胡蘿卜素和花青素的量是不相同的，也正是這個原因，葉綠體中色素、液泡中色素的呈比例變化給我們呈現出不同的顏色。在紫葉李等一些植物的葉片中，由于液泡中花青素的含量比葉綠體內色素的含量高很多，葉片才表現出花青素的本色——紅色[5]。也有研究表明：花色素苷的合成對于植物葉片顏色起到至關重要的作用。花色素苷普遍存在于植物的各個部位，如花、果實、莖、幼苗甚至根中，主要分布于表皮細胞中?；ㄉ剀諏χ参镞m應環境的意義主要表現在提高光保護能力、提高抗旱能力以及提高抗凍能力[6]。

有關油菜葉色的遺傳分析最早可以追溯到1954年，Singh研究表明，芥菜型油菜紫葉性狀是由1對顯性基因控制的，紫葉對綠葉為顯性。Dixit等于1972年發現，芥菜型油菜的葉緣粉紅色性狀受1對顯性基因控制。1971年，Stringam等對白菜型油菜的紅色莖稈性狀進行研究表明，該性狀同樣受1對顯性基因控制。近些年來，國內對甘藍型油菜葉色的研究也較多，但大都停留在基礎的遺傳分析上。貴州農學院在1978年對部分甘藍型油菜紫色心葉的材料研究發現，該性狀是受1對顯性基因控制的，紫色心葉對綠色心葉為顯性。吳新杰等提到，莫鑒國于1992年發現，甘藍型油菜的紫葉性狀是不完全顯性遺傳，紫葉親本和綠葉親本雜交后，F1代出現了中間類型[7]。黃澤素等于2006年發現，他們所獲得的紫紅葉甘藍型油菜的紫紅色受1對顯性基因控制[8]。涂金星通過對隨機擴增多態DNA（RAPD）分子標記研究發現，紫稈與可育基因Ms1存在連鎖關系，交換值范圍為1.95%～850%[9]。呂九龍等在研究甘藍型葉色基因時采用擴增片段長度多態性（AFLP）分子標記與BSA相結合的方法，共找到2個與紫葉基因Pur連鎖的標記，且位于基因兩側[10-11]。

本研究所用的具有心葉紫色甘藍型油菜材料是經過多代自交獲得的已穩定的材料，且該性狀只是出現在幼苗早期，與那些將紫葉作為標記性狀的材料相比對產量的影響要小。本研究主要目的是：通過觀察田間性狀表現，確定心葉紫色的遺傳規律；通過采用AFLP與BSA相結合的方法找到與紫色心葉GZX基因緊密連鎖的分子標記，為進一步克隆該基因打好基礎，進而能夠應用于分子輔助選擇育種中，加快育種進程。

1 材料與方法

1.1 材料與群體構建

4351、4361為心葉綠色親本，3230為心葉紫色親本（且紫色只在幼苗早期表現）由青海省農林科學院春油菜研究所提供，2個親本均經過多代自交（6代以上），心葉顏色穩定遺傳。

分別用4351、4361與3230進行雜交（同時反交）。獲得的F1代單株與心葉綠色親本進行回交，構建BC1分離群體。同時將F1代中的部分心葉紫色單株套袋自交，獲得F2代分離群體。

1.2 心葉顏色遺傳規律的確定

于幼苗早期（1～5張真葉）在田間調查心葉紫色、心葉綠色單株的分離比，共設2個雜交組合，用卡方測驗來檢驗分離比，確定其遺傳規律。

1.3 DNA的提取及樣品池的構建

在油菜苗期，先掛牌，后在每個單株上取2～3 cm2新鮮嫩葉，用CTAB法提取葉片總DNA[12]。DNA濃度用紫外分光光度計測量，然后用TE緩沖液稀釋至50 ng/μL，-20 ℃保存備用[13]。

根據幼苗早期心葉顏色的鑒定結果，分別隨機選取12個紫色心葉單株、12個綠色心葉單株，將其DNA分別等量混勻，構成2個心葉紫色基因池、2個心葉綠色基因池。

1.4 AFLP分子標記的篩選

酶切組合為PstⅠ+MseⅠ，AFLP引物和接頭由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。預擴增所采用的引物組合為 P0/MG、P0/MC，以稀釋30倍的預擴增產物作為選擇性擴增的模板，隨后選擇性擴增的產物通過6%聚丙烯酰胺凝膠（PAGE）電泳檢測[14]。

1.5 差異片段回收、克隆和測序

將AFLP差異性片段從6% PAGE膠板上挖出并轉入1.5 μL 離心管中，加入30～50 μL ddH2O并用一次性無菌槍頭搗碎，于沸水中煮10 min后于4 ℃離心備用。吸取2 μL上清液作為模板，用原對應引物重新進行PCR擴增，產物用1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，后用Sanprep柱式DNA膠回收試劑盒回收主帶。用純化后的目標片段與 pMD18-T載體（TaKaRa）連接，隨后將連接液導入DH5α大腸桿菌感受態細胞中進行培養。于培養液中加入約300 μL的LB液體培養基（未加Amp），150 r/min溫和搖振60 min。將200 μL轉化液均勻涂布于含有Amp的LB固體培養基上培養，倒置過夜，挑選單克隆菌斑于500 μL LB液體培養基（含Amp）中培養。隨后對菌液進行PCR檢測，將得到的陽性克隆片段送到生工生物工程（上海）股份有限公司測序。具體過程參考李霞的方法[15]。

1.6 AFLP特異片段的序列分析

將篩選得到的與心葉紫色緊密連鎖的標記相應的序列信息提交到NCBI數據庫中進行Blast同源比對分析。選取比對結果中一致性高且E值小于10-7的同源位點，比較標記位點與甘藍型油菜同源位點間的關系。

1.7 遺傳連鎖圖譜的構建

將所獲得的AFLP標記在BC1分離群體中統一進行單株檢測。為了便于單株基因型的確定并找出交換單株，在進行群體檢測時將心葉紫色的單株和心葉綠色的單株進行分組，得到基因型數據后用JoinMap 4 軟件構建GZX基因所在位置的遺傳連鎖圖譜，確定各個AFLP 標記與GZX在染色體上的遺傳圖距和排列順序。

2 結果與分析

2.1 心葉紫色基因的遺傳研究結果

由表1可知，無論是用作母本還是父本，用具有心葉紫色性狀的單株進行雜交，雜種F1代均表現為心葉紫色，說明沒有胞質效應，紫色對綠色為顯性。從回交1代BC1、雜種F2代的表型來看：回交后代中心葉紫色與心葉綠色植株比例為1 ∶1，F2代心葉紫色與心葉綠色植株的比例為3 ∶1。綜上可知，我們所獲得的心葉紫色甘藍型油菜的紫色心葉受1對顯性基因控制。

2.2 AFLP標記的篩選

根據在油菜幼苗早期所鑒定的單株性狀，對所有單株進行性狀分組，并構建基因池。本研究選用512對AFLP選擇性擴增引物（ P/MC、P/MG）。先用相對性狀所構成的基因池對512對引物進行初步篩選，共選出能夠區分出心葉紫色單株、心葉綠色單株的引物組合20對；將這20對引物繼續在由隨機選取的6個心葉紫色單株、6 個心葉綠色單株所組成的小群體中檢測，在檢測結果中共選出符合不超過2個重組單株標準的有6對引物，可認為是與心葉紫色基因緊密連鎖的特異性標記，可用于BC1大群體中進一步篩選重組單株，分別命名為ZX1～ZX6。

2.3 AFLP 特異片段序列比對結果

將得到的6個AFLP特異片段經回收、純化、克隆、測序后，在NCBI中進行了Blast比對，其中只有2個片段得到了一致性較高的比對結果，分別是P10MC07（比對結果表明與A05同源）、P12MG04（與A7同源），其他4個特異片段均沒有比對到染色體上。

2.4 遺傳圖譜的構建

將在BC1群體192個單株中得到的所有檢測結果（純合記為A，雜合記為H，缺失記為“-”）導入到JoinMap4軟件中，分析6個特異性標記與GZX之間的相對距離和位置關系。結果表明，ZX1～ZX5位于GZX同側，ZX6位于另一側；距GZX最近的標記為ZX5，遺傳距離為1.5 cM；距GZX最遠的標記為ZX1，遺傳距離為7.8 cM；標記間最小圖距為0.5 cM，最大圖距為12.2 cM（圖2）。

3 結論與討論

本研究于幼苗早期（1～5張真葉）分別觀察統計了2個分離群體的分離比，對統計結果進行卡方測驗后得出了一致的結果：心葉紫色性狀是由1對顯性基因控制的，這與前人的研究結果[7]一致。但是，前人只是停留在對該性狀的遺傳研究層面上，并沒有對該性狀進行分子水平的研究，而本研究對心葉紫色性狀采用分子標記的方法進行初步定位，為以后更方便地應用該性狀奠定了良好的基礎。

AFLP技術是一種檢測效率高、可靠性好、重復性高、多態性高的DNA指紋技術，自1995年出現以來被廣泛應用于遺傳育種研究、分類和進化等方面[16]。本研究采用AFLP與BSA相結合的方法，共獲得6個與心葉紫色基因緊密連鎖的且分布于GZX基因兩側的AFLP標記，這為后續遺傳圖譜的加密做好了基礎工作。

本研究雖獲得了6個與GZX緊密連鎖的AFLP標記，但只有其中2個特異片段的比對結果較好，這樣一來所獲得的信息不足以確定目標基因具體在哪一條染色體上，究其原因可能是所獲得的心葉紫色甘藍型油菜的遺傳背景較為復雜。

在對GZX基因進行定位時發現，交換單株過多，會導致所得到的標記與目標基因之間距離過遠。究其原因，可能是有的心葉紫色只表現在葉緣，還有一些單株的紫色褪去過早，從而導致在苗期鑒定時誤把心葉紫色的單株鑒定為心葉綠色的單株，這樣在進行BSA法構建基因池時，容易將性狀表現模糊的單株混入，大大影響引物篩選工作的準確性，甚至根本找不到能真實顯示多態性的引物。最近的研究發現，糖在花色素苷合成中可通過信號轉導的方式增強一些酶的活性，以促進花色素苷的合成[17]；史寶勝等研究光照對紫葉李葉片顏色的影響發現，充足的光照可以提高葉片中的碳水化合物含量，從而可以顯著促進花色素苷的合成，使葉片的紫色更加鮮艷[18]。因此本研究提出以下建議：最好在日照充足、心葉紫色性狀表現充分的時候進行鑒定，從而為后期的性狀分組、基因定位打好基礎。

甘藍型心葉紫色油菜作為一種特殊的資源，在應用研究中可以將控制心葉紫色的基因導入到不育系材料中，這樣在苗期就能將母本中的雜株拔出，大大提高種子的純度；在測定一些品種或品系的自然異交率時，得到的后代中凡是帶有心葉紫色性狀的單株都屬于真雜種，這樣就能比較容易且準確地得到該品種的異交率；鑒于本研究的試驗材料具有只在苗期出現且只有心葉為紫色的特點，可以將其當作一種觀賞性的油菜，結合合理布局，能夠創造出一種特殊的視覺效果，從而為當地旅游增加新的創收點。

在苗期進行心葉顏色調查時發現，2個雜交組合F1代所表現的紫色的程度有所不同，導致這種現象的內在原因在本研究中沒有涉及，下一步試驗將會著重探究?？紤]到調查心葉紫色性狀分離時所遇到的困難，下一步將會重點研究影響心葉紫色性狀表現的因素，從而為提高鑒定性狀的準確率提出較為合理的策略。

參考文獻：

[1]傅廷棟. 雜交油菜的育種與利用[M]. 武漢：湖北科學技術出版社，1995：52-166.

[2]劉后利. 油菜遺傳育種學[M]. 北京：中國農業大學出版社，2000：215-225.

[3]鄧國富，李楊瑞，梁世榮，等. 紫葉水稻IR1552紫葉性狀的遺傳及其育種利用[J]. 雜交水稻，2007，22（5）：71-75.

[4]馮武軍. 揭開植物的葉色之謎[J]. 生物學雜志，2007，24（5）：75-76.

[5]孫明霞，王寶增，范 海，等. 葉片中的花色素苷及其對植物適應環境的意義[J]. 植物生理學通訊，2003，39（6）：688-694.

[6]代文東，黃澤素，唐 容，等. 優質甘藍型紫紅葉標記油菜的選育[J]. 貴州農業科學，2009，37（9）：16-18.

[7]吳新杰，陳鳳祥，胡寶成，等. 甘藍型油菜形態標記性狀研究進展[J]. 中國農學通報，2005，21（12）：128-131.

[8]黃澤素，王通強，楊曉容，等. 甘藍型油菜紫紅葉標記性狀的遺傳及利用探討[J]. 種子，2006，25（3）：47-49.

[9]涂金星. 甘藍型油菜隱性雄性核不育及其遺傳標記的研究[D]. 武漢：華中農業大學，1997：113-146.

[10]王青山，李蔥蔥，王 晶，等. AFLP分子標記技術及應用研究進展[J]. 吉林農業科學，2005，30（6）：29-33.

[11]呂九龍.甘藍型油菜葉色基因的初步定位[D]. 武漢：華中農業大學，2008：216-261.

[12]Doyle J J. A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue[J]. Phytochem Bull，1986，19：11-15.

[13]趙會彥，肖 麓，杜德志.青海大黃油菜粒色性狀AFLP標記的篩選和SCAR標記轉化[J]. 中國油料作物學報，2013，35（5）：476-483.

[14]易 斌. 甘藍型油菜隱性核不育基因Bnms1的精細定位和克隆[D]. 武漢：華中農業大學，2008：132-196.

[15]李 霞. 人工合成甘藍型黃籽油菜粒色基因的精細定位[D]. 武漢：華中農業大學，2009：102-164.

[16]李傳友，鄭洪剛，翁曼麗，等. 光敏核不育水稻等位突變系的AFLP分析[J]. 生物工程學報，2000，16（1）：95-99.

[17]Vitrac X，Larronde F，Krisa S，et al. Sugar sensing and Ca2+-calmodulin requirement in Vitis vinifera cells producing anthocyanins[J]. Phytochemistry，2000，53（6）：659-665.

[18]史寶勝，卓麗環，楊建民. 光照對紫葉李葉色發育的影響[J]. 東北林業大學學報，2007，35（4）：16-18.周 彪，郭政宏，嚴亨秀. 藏豬糞便芽孢桿菌基因組DNA的提取方法[J]. 江蘇農業科學，2016，44（4）：93-95.