藏豬糞便芽孢桿菌基因組DNA的提取方法

周彪+郭政宏+嚴亨秀

摘要：藏豬源的芽孢桿菌制劑具有潛在研究應用價值，更好地提取其基因組DNA對后期研究具有重要作用。采用微波法、酚/三氯甲烷法、改進CTAB法、試劑盒法等4種方法提取同一份藏豬糞便DNA，測定所得DNA含量及純度，然后對DNA進行16S rRNA基因擴增并使用瓊脂糖凝膠電泳法對比。結果表明，4種方法均能提取到藏豬糞便的芽孢桿菌基因組DNA，微波法雖然得到最多的DNA，但是其蛋白質含量過高，DNA純度最低；試劑盒法提取的DNA純度最高，但是DNA含量太低；綜合比較，改進CTAB法DNA得率多且純度高，性質穩定，擴增效果好，價格低廉，是最優提取方法。

關鍵詞：藏豬；糞便；基因組DNA；提取方法

中圖分類號： S852.6

文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2016）04-0093-02

藏豬別稱藏香豬，原產于中國青藏高原海拔2 500～4 300 m 的農區和半農區。藏豬保存了較為純正的品系資源，是唯一能適應高原海拔氣候和以放牧為主的豬種，是我國特有世界珍稀的草食性優良品種[1]。藏豬肉質優良，主要源于其食草特性和生活環境，也與其不同于其他豬種的特殊胃腸道環境有著密不可分的關系。芽孢桿菌制劑通常都是以休眠孢子的形式存在，進入動物腸道后，孢子能在腸道上部迅速萌發、增殖，并分泌很多種活性很強的消化酶，有助于降解植物性飼料中某些復雜的碳水化合物，同時可以消耗大量的氧，維持腸道厭氧環境，增強腸道對厭氧益生菌的定植，抑制致病菌生長，平衡、穩定乳酸桿菌，維持腸道微生態平衡[2-5]。

藏豬來源的芽孢桿菌制劑具有潛在的開發研究價值，提取其基因組DNA在開發研究中具有重要的意義，理想的基因組DNA獲取方法除了考慮到DNA的產率，還要考慮到盡可能減少DNA的降解及試劑成本等。目前，已經有多種提取微生物基因組DNA的方法[6-8]，如微波法、酚/三氯甲烷法、CTAB法、試劑盒法等。為了探究不同方法獲取的基因組DNA對芽孢桿菌研究的影響，本試驗采用4種方法對樣品進行基因組DNA的提取，通過紫外可見分光光度計、瓊脂糖凝膠電泳分析不同方法得到DNA的產量、純度、穩定性，再將獲得的基因組DNA進行16S rRNA基因擴增進行對比并評價。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）裂解液、酚、三氯甲烷、異戊醇、無水冰乙醇、AxyPrep細菌基因組DNA小量制備試劑盒、瓊脂糖、磷酸鈉緩沖液（pH值7.0）、10%SDS溶液、TAE緩沖液、TE緩沖液、LB液體培養基等。

1.1.2 試驗樣品 采集于西藏林芝地區一牧民家中公藏豬新鮮糞便，-80 ℃液氮保存帶回實驗室。

1.1.3 主要儀器 PCR擴增儀，東勝龍ETC811；高速冷凍離心機，Thermo；紫外可見分光光度計，上海成光儀器有限公司；凝膠成像系統，Tanon；電泳儀，Tanon；電泳槽，Tanon；微量移液器，Eppendorf；電子天平，江蘇省常州市宏衡電子儀器廠；渦旋振蕩器，北京優晟聯合科技有限公司等。

1.2 方法

1.2.1 樣品預處理 稱取凍存的糞便樣品5 g于4 ℃冰水或冰盒上解凍，置于50 mL 0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液中，并充分渦旋混勻，紗布過濾后，收集濾液并于沸水浴中處理 5 min，吸取1 mL熱處理后的濾液加入到19 mL LB液體培養基中，振蕩培養24 h，4 ℃保存備用。

1.2.2 基因組DNA的提取

1.2.2.1微波法 （1）微量移液器取1 mL LB菌液于1.5 mL EP管中，12 000 r/min離心2 min，再用PBS洗滌菌體2～3次；（2）棄上清，加500 μL 1×TE吹打混勻，取100 μL于200 μL EP管，12 000 r/min離心2 min；（3）棄上清，加100 μL 1×TE吹打混勻，12 000 r/min離心2 min；（4）棄上清，加100 μL 1×TE吹打混勻，用微波爐（先預熱1 min）加熱1 min，12 000 r/min 離心2 min；（5）收集上清液，即為所提DNA。

1.2.2.2 酚/三氯甲烷法 （1）微量移液器取1 mL LB菌液于 1.5 mL EP管中，10 000 r/min離心3 min，棄上清；（2）加入 500 μL STE液懸浮，加10 μL蛋白酶K（20 mg/mL），混勻，37 ℃ 恒溫水浴20 min，再加入10% SDS 20 μL，10 mg/mL PKA 20 μL；（3）置于55～65 ℃恒溫水浴中1～3 h；（4）500 μL 酚-三氯甲烷-異丙醇（體積比為25 ∶24 ∶1），下層生成牛奶色，混勻后10 000 r/min離心4 min；（5）上一步后分3層，用剪了頭的槍頭吸取上層DNA，加入異丙醇-三氯甲烷 500 μL，10 000 r/min離心3 min，收集上清；（6）加入30 μL 5 mol/L NaCl，1 000 μL冰無水乙醇，混勻后，冰上靜置10 min至出現白色絲狀物，10 000 r/min離心3 min，棄上清；（7）加入500 μL 70%乙醇，10 000 r/min離心2 min，棄乙醇，風干約30 min；（8）加入100 μL 無菌水即為所提DNA。

1.2.2.3 改進CTAB法 （1）微量移液器取1 mL LB菌液于1.5 mL EP管中，13 000 r/min離心2 min，棄上清，用0.85% NaCl溶液洗滌2次，加550 μL 1×TE吹打混勻；（2）加8 μL蛋白酶K（20 mg/mL），混勻，37 ℃恒溫水浴30 min，再加40 μL 10% SDS混勻，37 ℃恒溫水浴30 min，再加入100 μL 5 mol/L NaCl混勻，加80 μL CTAB NaCl溶液混勻，65 ℃恒溫水浴10 min；（3）再加入8 μL 10 mg/mL Rnase，37 ℃恒溫水浴 1 h；（4）加入等體積（0.7～0.8 mL）三氯甲烷-異丙醇（體積比為24 ∶1），輕輕振蕩混勻，14 000 r/min離心12 min，分3層，收集上清液，加入等體積酚-三氯甲烷-異丙醇（體積比為25 ∶24 ∶1），輕輕振蕩混勻，14 000 r/min離心 10 min；（5）收集上清液，加入等體積三氯甲烷-異丙醇（體積比為24 ∶1），輕輕振蕩混勻，14 000 r/min離心10 min，收集上清液，加入2倍體積預冷的無水乙醇，混勻，-20 ℃靜置30 min，14 000 r/min離心 10 min，棄上清，加入500 μL 70%乙醇，混勻；（6）14 000 r/min 離心3 min，棄上清，風干 15 min，將沉淀溶于60 μL ddH2O中，即為所提DNA。

1.2.2.4 試劑盒法 采用AxyPrep細菌基因組DNA小量制備試劑盒，具體步驟參見說明書。

1.2.3 基因組DNA質量檢測 分別采用紫外可見分光光度計法、1%瓊脂糖凝膠電泳法、PCR擴增法分析所提取基因組DNA的得率、純度以及大小。

2 結果與分析

2.1 基因組DNA得率及純度

對藏豬糞便進行沸水浴處理5 min，只有芽孢桿菌可以存活于沸水浴中，其他細菌已被殺死。將4種方法所提取的基因組DNA稀釋100倍，用紫外可見分光光度計測定DNA得率及純度，每個樣品DNA測定3次，取其平均值，得到DNA提取含量、DNA純度和蛋白質含量。DNA得率測定標準：D260 nm值為1時等同于50 μg/mL雙鏈DNA，D260 nm/D280 nm比值在1.7～1.9之間，則說明所測樣品DNA 純度較高；比值低于1.7，則可能有蛋白等雜質污染；高于2.0，則樣品DNA很可能已經降解。從表1可以看出，DNA得率微波法>改進CTAB>試劑盒法>酚/三氯甲烷法；DNA純度試劑盒法>改進CTAB>酚/三氯甲烷法>微波法；蛋白含量微波法>改進CTAB>試劑盒法>酚/三氯甲烷法。改進CTAB法的DNA得率和純度均是第2位；微波法得率最高，但是其蛋白含量最高，導致DNA純度最低；試劑盒法得率居第3位，DNA純度最高且蛋白含量最少；酚/三氯甲烷法得率最低且DNA純度居于第3位。微波法和酚/三氯甲烷法的D260 nm/D280 nm比值均低于170，接近1.0，這2種方法提取的DNA污染較嚴重，改進CTAB法和試劑盒法分別是1.69、176，屬于純度較高的DNA。試劑盒法需要價格昂貴的試劑盒。綜合考慮以上因素，改進CTAB法最適合于藏豬糞便中芽孢桿菌基因組DNA的提取。

2.2 基因組DNA電泳檢測

1%瓊脂糖凝膠電泳法檢測結果（圖1）表明，4種方法提取的基因組DNA分子質量均在23 000 bp左右，酚/三氯甲烷法所提DNA拖尾較嚴重，表明含雜質較多，其余3種方法所提基因組DNA較為完整且純度較高，電泳條帶清晰。圖2為基因組DNA在-20 ℃冰箱存放24 h后所得電泳，微波法提取的基因組DNA降解量最多，表明DNA含有太多雜質。其他3種方法基因組DNA均有相似程度的降解。

2.3 16S rRNA基因PCR擴增后效果

用細菌16S rRNA基因通用引物擴增所提基因組DNA，使用1% 瓊脂糖電泳法檢測，以Marker DL2000作為標準分子質量參照，通過凝膠成像系統成像（圖3），4種方法PCR擴增效果都較好，擴增的片段大小在15 000 bp左右，且干擾性雜帶不多，重現性較好，但微波法、改進CTAB法和試劑盒法獲得的條帶較清晰，酚/三氯甲烷法的條帶較模糊，表明微波法、改進CTAB法和試劑盒法提取的基因組DNA具有較好的質量，所得的 DNA 可作為 PCR 模板進行16S rRNA 基因的有效擴增，為進行后續的試驗研究提供材料保障。

3 結論與討論

微波法只有洗滌、微波振蕩破壁和酚/三氯甲烷抽提3步，相對于物理法破壁的費時、費力和酶法破壁的長時間消化處理，微波法具有簡便、高效、快速和價廉等特點[9]。雖然微波法能提取到高得率的DNA，但所提DNA中含有太多雜質，以致其穩定性極差，很可能是因為未進行核酸酶消化處理。酚/三氯甲烷抽提方法是目前提取外周血基因組DNA方

法，可除去蛋白質和色素物質，研究表明，酚/三氯甲烷法可提取高純度的DNA[10]。在本試驗中，酚/三氯甲烷法提取的基因組DNA得率最低，DNA純度居于第3位，可能與酶消化細胞壁時間不足、萃取不徹底有關。改進CTAB法提取的基因組DNA得率和純度均居第2位，綜合考慮是提取藏豬糞便芽孢桿菌基因組DNA的最優方法。CTAB法提取的DNA經瓊脂糖凝膠電泳檢測和16S rRNA擴增表明，該法提取的DNA蛋白質污染少，降解不明顯，產量穩定，重復性好，可做大量提取試驗并應用于后續研究。試劑盒法操作簡單，用時相對較短，所得DNA質量較為穩定，但價格昂貴，使用次數有限，不適合作大量基因組DNA提取。不同方法出現的差異可能與不同方法裂解細菌細胞的效率及藏豬糞便中特異菌群組成有關。用4種方法提取同一份樣品DNA的得率和純度差異較大，說明對腸道菌群研究時采用不同DNA提取方法會影響對菌群多樣性的分析，導致引入一些誤差，因此，在研究不同動物腸道菌群時應選擇合適的方法提取DNA以減少菌群分析誤差。

參考文獻：

[1]賀寒冰，尹洛蓉，楊 肖，等. 藏豬和長白豬對口蹄疫疫苗的免疫應答特性比較研究[J]. 四川動物，2011，30（4）：517-521.

[2]胡東興，潘康成. 微生態制劑及其作用原理[J]. 中國飼料，2001（3）：14-16.

[3]何明清，程安春. 動物微生態學[M]. 成都：四川科學技術出版社，2004.

[4]劉學劍. 飼用芽抱桿菌的研究和應用[J]. 廣東飼料，2005（14）：30-32.

[5]黎春輝. 芽孢桿菌與部分抗菌中草藥聯合應用的研究[D]. 長沙：湖南農業大學，2008：1-7.

[6]陳思媛，郭明璋，賀曉云，等. 用于分子生物學檢測的糞便DNA的提取方法優化[J]. 農業生物技術學報，2013，21（12）：1509-1517.

[7]Tang J N，Zeng Z G，Wang H N，et al. An effective method for isolation of DNA from pig faeces and comparison of five different methods[J]. Journal of Microbiological Methods，2008，75（3）：432-436.

[8]鄭 剛，陳己任，胡博文，等. 基于DGGE分析的大鼠糞便及腸道細菌DNA提取方法研究[J]. 食品科學，2011，32（17）：215-218.

[9] Orsini M，Romano-Spica V. A microwave-based method for nucleic acid isolation from environmental samples[J]. Lett Appl Microbiol，2001，33：17-20.

[10]劉正旺，云美玲，鐘江華，等. 提取陳舊血液標本中DNA的三種方法比較[J]. 中國熱帶醫學，2012，12（3）：321-323.趙 滿，李麗芳，王友竹，等. 黃粉甲翅芽生長因子基因的克隆及表達分析[J]. 江蘇農業科學，2016，44（4）：95-98.