水稻氮素利用效率相關性狀的動態QTL分析

曾威+白建江+張才輝+楊瑞芳+方軍+樸鐘澤+石英堯

摘要：為探討水稻不同生育時期氮素利用效率的變化動態及遺傳機制，以秈稻品種Dasanbye、粳稻品種TR22183及其雜交衍生的166個重組自交系（RILs）群體為材料，對控制水稻氮素利用效率主要性狀基因位點（QTL）變化動態進行分析。結果表明，在水稻4個生育時期檢測到10個非條件QTL和6個條件QTL，分布在除第1、4、5、6、9號染色體以外的7條染色體上，但沒有1個性狀能在分析的4個時期都被檢測到；氮素吸收總量在最高分蘗期檢測到2個非條件QTL，聯合變異解釋率為15.61%；氮素含量分別在抽穗后15 d和成熟期檢測到2個非條件QTLs，變異解釋率分別為10.50%、7.93%；干物質產量只在抽穗后15 d檢測到1個非條件QTL，變異解釋率為6.58%；氮素干物質生理利用效率分別在抽穗后15 d和成熟期檢測到5個非條件QTLs，聯合變異解釋率分別為26.87%、14.73%；控制最高分蘗期至抽穗期后15 d氮素吸收總量的條件QTL有1個；控制抽穗期后25 d至成熟期氮素含量的條件QTL有1個，氮素吸收總量的條件QTLs有2個，氮素干物質生理利用效率的條件QTLs有2個。

關鍵詞：水稻；氮素利用效率；數量性狀基因位點；動態分析

中圖分類號： S511.03；Q75

文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2016）04-0110-05

水稻（Oryza sativa）自古以來就是人類重要的糧食作物之一。目前世界上一半以上人口以稻米為主要食物和能量來源。在整個水稻生長發育進程中，氮素是影響水稻形態建成及產量形成的最重要因子之一[1]。因而，氮肥的科學施用是水稻高產穩產的重要保證。在過去半個世紀里，大量施用氮肥已使水稻達到了較高產量潛力，而過量的氮肥投入不僅引起了水稻氮素利用率下降，還產生了環境污染、水稻品質下降、生產成本增加等一系列不利于農業可持續發展的負面問題[2-4]。據報道，目前我國水稻田的氮肥利用率只有30%左右，未被利用的氮肥通過淋溶、揮發、沖洗等以NH3、NO3-、N2O等形式排入環境而損失，并且污染地下水、土壤、河流、大氣，進而影響人體健康[5-6]。因此，如何提高氮素利用效率，并減少氮肥對環境的污染是當前農業領域所面臨的重要課題之一。

水稻氮素利用是一個龐大、極為復雜的生物學過程[7]，涉及到許多代謝過程，受到眾多基因控制，是數量性狀基因座（quantitative trait locus，QTL）研究的對象。QTL分析技術的快速發展，為了解這些復雜數量性狀的遺傳機理提供了有力手段。近年來，關于氮素利用效率的研究很多，認為水稻等多種農作物不同基因型之間氮素的利用效率存在顯著差異，QTL定位結果大多是基于發育最終時期表型數據的傳統QTL分析方法，關于水稻氮素利用效率的動態發育遺傳機制的研究報道較少[8-12]。

水稻氮素生理利用效率是指將植株從衰老營養體轉運氮到產量部分的效率[13]。對于氮素生理利用效率問題，長期以來受到許多研究者關注。國際水稻研究所和韓國等非常重視有關氮高效水稻品種的育種方法與遺傳及生理生化研究，試圖從現有水稻資源中，篩選出低氮條件下依然保持穩產、高產的氮高效、耐低氮水稻種質，并通過育種手段來培育氮素利用效率較高的環保型耐低氮水稻新品種。本研究以水稻整個發育時期不同階段的干物質產量、氮素吸收總量、氮素含量、氮素干物質生理利用率為氮素利用效率主要性狀，利用水稻氮素吸收利用率高（谷物生理氮素利用率為57%）且耐低氮的品種Dasanbye與水稻氮素吸收利用率低（谷物生理氮素利用率為45%）的品種TR22183雜交并通過快速加代，構建了穩定的F9代RIL群體166個系統，作為水稻氮素利用效率相關性狀基因定位分析的基礎材料，在水稻全生育期不同階段對水稻氮素利用效率相關性狀進行動態QTL分析，旨在為選育氮高效水稻新品種提供遺傳基礎信息。

1 材料與方法

1.1 供試材料

選用氮素利用效率高的韓國秈稻品種多產稻Dasanbye和氮素利用效率低的粳稻品種TR22183為雜交親本，雜交后代通過單粒傳9代衍生構建秈/粳交重組自交系群體（RILs）。該群體由166個株系組成，遺傳穩定。2009年5月21日將重組自交系群體和親本播種于上海市莊行試驗站試驗基地內，6月18日移栽。行株距為30 cm×13.3 cm，1行1小區，每行50株，2次重復，隨機區組排列。施肥量為 600 kg/hm2（N ∶P2O5 ∶K2O=20 ∶10 ∶10），其中磷肥、鉀肥全部用作基肥；40%的氮肥用作基肥，30%的氮肥用作分蘗肥，30%的氮肥用作穗肥。田間管理方式遵循一般大田常規栽培方法。

1.2 性狀考察及氮素測定

在水稻抽穗期分別掛牌標記同日抽穗并生長量一致的代表性植株。分別于最高分蘗期，抽穗后15、25 d和成熟期取樣，每小區取2株。將田間取樣的植株清洗干凈、切除根部后，分離稻草和穗部，于105～110 ℃烘箱中殺青30 min后在75 ℃烘至恒質量后稱質量，得到不同部位器官干質量。經粉碎機磨碎，利用半微量凱氏定氮法測定全氮含量。

依據Moll等的方法[14]，以植株的干物質產量、氮素吸收總量、氮素含量、氮素干物質生理利用效率等4個相關性狀作為氮素利用效率的主要考察指標。其計算方法如下：

氮素吸收總量（Nt）=地上部干物質產量×氮素含量；

氮素干物質生理利用效率（ DMPN ）=地上部干物質產量/氮素積累量。

1.3 數據分析和QTL定位

利用SAS 8.1軟件分析方差，描述正態性。調查某時刻各株系的氮素生理利用指標，即為該時刻[y（t）]的表型值，根據朱軍提出的條件遺傳效應值的統計分析方法[15]，可以獲得給定的（t-1）時刻表型值的y（t）時刻條件表型值[y（t/t-1）]。非條件QTL的加性效應反映發育初始時刻至t時刻基因表達的累積效應，條件QTL的加性效應則為（t-1）～t時刻基因表達的凈加性效應。

采用QTL ICI Mapping 4.0軟件的完備區間作圖（ICIM）方法[16]進行QTL分析。QTL的似然函數比值的對數（LOD值）的閾值設為2.0，當實際求得的LOD值大于閾值時，就認為該區段有一個QTL，同時估算每個QTL的加性效應值和可解釋的表型變異率，QTL的命名遵循McCouch等的命名原則。試驗群體的遺傳圖譜含208個SSR標記，總圖距 1 467.5 cM，標記間平均距離7.1 cM[17]。

2 結果與分析

2.1 親本及RILs群體不同生育時期氮素利用效率相關性狀表型分析

由表1可以看出，在4個生育時期，2個親本間干物質產量、氮素含量、氮素吸收總量、氮素干物質生理利用效率的表型值均有差異，其中干物質產量和氮素吸收總量在最高分蘗期差異最大，抽穗后25 d的氮素干物質生理利用效率差異最大。在RILs群體中，干物質產量、氮素吸收總量、氮素干物質生理利用效率都呈雙向超親分離，表現為接近正態的連續分布。表明水稻氮素利用效率為多基因控制的數量性狀，能進行QTL分析。

2.2 4個生育時期氮素利用效率相關性狀的QTL定位

在水稻4個生育時期共檢測到控制水稻氮素利用效率相關性狀的10個非條件QTL，分布于水稻第2、3、8、10、12號染色體上，LOD值為2.02～2.77，加性效應為-28.94～28.35，可解釋表型變異的6.01%～10.81%（表2、圖1）。

在最高分蘗期，檢測到2個控制氮素干物質生理利用效率的QTL，分別為qNt3、qNt8，貢獻率分別為7.94%、7.67%，qNt3增效等位基因來自多產稻，qNt8增效等位基因來自TR22183。

在抽穗15 d，分別檢測到5個控制氮素利用效率相關性狀的QTL。其中，檢測到1個控制干物質產量的QTL，為qDMPHF10，位于第10號染色體上，貢獻率為6.58%，加性效應為-1.91；檢測到1個控制氮素含量QTL，為qNCHF2，位于第2號染色體上，貢獻率為10.50%，加性效應為-1.05，qDMPHF10、qNCHF2增效等位基因均來自多產稻；檢測到3個控制氮素干物質生理利用效率的QTL，分別為qDMPNHF2a、qDMPNHF2b、qDMPNHF12，貢獻率分別為9.45%、10.81%、6.61%。

在成熟期，共檢測到3個控制氮素利用效率相關性狀的QTL，其中檢測到1個控制氮素含量的QTL，為qNCM2，貢獻率為7.96%；檢測到2個控制氮素干物質生理利用效率的QTL，分別為qDMPNM2、qDMPNM12，分別位于第2、12號染色體上，貢獻率分別為8.72%、6.01%。

在水稻4個生育時期，共檢測到10個控制水稻氮素利用效率相關性狀的QTL位點，多數QTL位點的位置不同，僅在2號染色體上檢測到同時控制2個時期（抽穗期后15 d和成熟期）氮素干物質生理利用效率的QTL位點。

2.3 4個生育時期氮素利用效率相關性狀的動態QTL定位

由表3、圖1可見，在4個發育階段檢測到6個氮素利用效率相關性狀的條件QTL，其中檢測到1個控制最高分蘗期至抽穗后15 d氮素吸收總量的QTL和2個抽穗后25 d至成熟期氮素吸收總量的QTL，分別位于第3、7、12號染色體上，可解釋表型變異的7.78%～9.42%；檢測到1個控制抽穗后25 d至成熟期氮素含量的QTL，位于第12號染色體上，可解釋表型變異的7.32%；檢測到2個控制氮素干物質生理利用效率的QTL，位于第11、12號染色體上，位于第12號染色體RM17～S12109區間的qDMPNHL～DMPNM12的貢獻率達最大值，為10.87%。

根據QTL的效應模式，可將它們分為3類。第1類：非條件QTL與條件QTL定位區間完全一致。如第3號染色體RM545～S03041區間上檢測到控制最高分蘗期至抽穗后 15 d 的氮素吸收總量的QTL qNt～NtHF3，該位點也檢測到控制氮素吸收總量非條件QTL qNt3；在12號染色體上檢測到控制抽穗后25 d至成熟期的氮素干物質生理利用效率的QTL qDMPNHL～DMPNM12，也檢測到控制氮素干物質生理利用效率非條件QTL qDMPNHF12。第2類：條件QTL只在某一特定時期表達，而非條件QTL卻能在多個時期重復出現。如在第12號染色體上檢測到控制氮素干物質生理利用效率的條件QTL qDMPNHL～DMPNM12，只在抽穗后25 d至成熟期表達，而非條件QTL可在抽穗后15 d和成熟期同時表達。第3類：條件QTL與非條件QTL始終不能在同一區間被檢測到。如定位在第7、10、11號染色體上的QTL均屬此類。綜上，這些條件QTL為非條件QTL提供了較為合理的解釋。

3 結論與討論

本研究在水稻生育進程中的4個時期檢測到10個非條件QTL，分布在第2、3、8、10、12號染色體上，LOD值為 2.02～2.77，單個QTL貢獻率為6.01%～10.81%，其中貢獻率大于10%的QTL有2個，平均每個時期檢測到2.5個QTL。在抽穗期后25 d未檢測到控制水稻氮素利用效率相關性狀的QTL，而在抽穗期后15 d檢測到5個QTL。說明控制水稻氮素利用效率的QTL表達具有明顯的時空性，有的QTL只在某個特定發育時期才表達。比較本研究結果與前人研究結果[9，11，18-22]發現，控制水稻氮素利用效率的QTL貢獻率較小，水稻氮素利用效率大多是由微效QTL控制。同時還發現，在位于第2、3、12號染色體上的QTL重演性較好，有一定的應用潛力。對于前人研究中被檢測到的QTL未能在本研究中重現，這可能與所用的群體材料、試驗環境、測定時期不同有關，或這些性狀易受環境影響。在最高分蘗期第2、12號染色體上檢測到控制水稻氮素利用效率的QTL簇，暗示這些區段很可能存在不同時期穩定表達的控制水稻氮素利用效率的QTL。此外本研究還發現了一些新的QTL位點，這為水稻氮高效利用基因的發掘提供了部分遺傳基礎，也為分子標記輔助選擇提供了新信息。

傳統的QTL定位大都以性狀發育終點的累積量為表型值進行QTL分析，測得的QTL只能解釋此位點在發育終點以前所有基因表達的累積遺傳效應[23]，無法準確了解該位點基因在不同發育時段內的凈表達效應，也忽略了性狀形成的發育特性。動態性狀的生長發育受基因網絡控制，其遺傳基礎復雜。以性狀發育終點的累積量為表型值進行QTL分析不能充分反映性狀發育不同階段不同基因表達的動態變化及相應階段的凈遺傳效應，也不能揭示基因表達的時空差異。水稻氮素利用效率是一個動態發育過程，受遺傳網絡控制，基因表達存在時空選擇性和發育階段特征。本研究采用條件分析方法結合復合區間作圖法，可對目標數量性狀的發育動態進行QTL定位，能更深入地了解單個QTL在性狀發育過程中基因表達行為的時空模式。

樸鐘澤等曾長期研究水稻氮素利用效率情況[24-25]，與以往研究對比，本研究的最大進步是結合了之前的研究結果，并開拓性地對水稻整個生育期的4個時期進行氮素利用效率相關性狀的動態QTL分析，不僅證實了水稻不同基因型之間氮素的生理利用效率存在顯著差異，還發現控制水稻氮素利用效率的QTL主要在抽穗期后15 d和成熟期2個生育階段表達。

本研究在水稻4個生育時期共檢測到6個條件QTL，雖然數量相對較少，貢獻率也相對不高，但檢測到1個能夠持續表達的主效QTL，而其他微效QTL表現為動態變化，這與氮素干物質生理利用效率的動態變化過程相符。在第3、12號染色體上發現條件QTL與非條件QTL重合，說明控制水稻氮素利用效率的QTL位點可能是分段表達的，并且具有表達的時空性；而第2、3類QTL也存在，說明水稻的氮素利用效率是一個復雜和易受環境影響的遺傳性狀。

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