馬鈴薯晚疫病菌單孢子囊分離技術的改進

謝業焜+吳娥嬌+李冬亮+靳宇佳+詹家綏

摘要：針對現行馬鈴薯晚疫病菌研究中單孢子囊分離方法操作難度大、耗時久、成功率低的問題，在已有的懸浮液分離方法的基礎上，利用單個孢子囊含有多個游動孢子，且每個游動孢子遺傳物質相同的特點，分離獲得單個孢子囊后，采用低溫刺激其釋放游動孢子，形成了一套分離單個孢子囊的新方法。結果表明，改進后的方法成功率提高了近5倍，操作時間減少了50%，同時操作難度也大大降低，是病原群體研究試驗中快速、大批量分離單孢子囊的一種行之有效的方法。該方法成功地應用于馬鈴薯晚疫病菌（Phytophthora infestans）群體遺傳和競爭試驗研究。

關鍵詞：馬鈴薯晚疫病菌；單孢子囊分離；孢子囊；游動孢子

中圖分類號： S435.32

文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2016）04-0172-02

馬鈴薯晚疫病是由致病疫霉（Phytophthora infestans）引起的具有很強的破壞力的、給馬鈴薯生產造成極大危害的病害[1]，每年因馬鈴薯晚疫病造成的直接損失高達數10億美元[2]，因此，明確馬鈴薯晚疫病的發生、發展和進化規律，對馬鈴薯晚疫病的管控十分重要。當今研究多集中于病原菌毒力的增減，很少涉及到病原菌的生存策略[3]。在自然環境中，由于寄主資源有限，同一寄主可能會被多個病原菌侵染，病原菌之間會為了有限的資源展開競爭[4-5]。病原菌對寄主多重侵染時會采取什么樣的繁殖策略，有什么因素會對其造成影響，目前對此眾說紛紜[6-8]。本研究旨在通過探究不同基因型的病原菌侵染同一寄主時，競爭力有何變化，探討不同病原菌在有限的生存空間中采用何種生存策略。

本研究的技術路線為：（1）選取2個SSR等位基因位點有差異的自育交配型菌株；（2）兩兩單獨、兩兩混合按1 ∶1的比例接種到馬鈴薯葉片（感病品種Favorite）上，每處理重復5次；（3）接菌后第3天開始拍照，至第7天結束；（4）從2個不同菌株混合的處理中分離獲得50個孢子囊，分別培養，提取DNA，進行SSR分析；（5）使用ASSESS[9]計算病斑大小與發病面積，檢驗不同等位基因的菌株致病力強弱。

為了得到混合侵染后不同菌株競爭力強弱的結果，必須從混合接種的葉片上分離大量的單孢子囊。而傳統的單孢子囊分離方法——水瓊脂平板劃線法[10]存在以下不足：（1）水瓊脂不含營養物質，孢子囊萌發后無法從水瓊脂上獲取營養，往往難以長到黑麥培養基上；（2）鏡檢費時費力，即使操作熟練也需要花3～10 min才能完成1個單孢子囊的分離；（3）水瓊脂厚度難以控制，太厚不利于鏡檢，太薄又易碎，難以轉移到黑麥培養基上。由于離體的馬鈴薯葉片在被馬鈴薯晚疫病菌侵染后極易腐爛，腐爛后的葉片雜菌極多，無法進行單孢子囊分離，而傳統的水瓊脂平板劃線法效率低下，無法滿足試驗需要。為此，本試驗在袁軍海等的研究方法[11]基礎上進行改進，探尋一種能夠快速、高效，適合大批量獲取單個孢子囊的方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 供試菌株分別于2010年、2011年采自云南省和貴州省安順市，根據省份和市區首寫字母依次編號命名為YN3和AS22。

1.1.2 黑麥培養基 黑麥培養基的制作借鑒Caten等的方法[12]：取50 g黑麥于燒杯中，用自來水沖洗干凈，加入適量去離子水，室溫下浸泡15～20 h，充分研磨后于65 ℃水浴2 h，用4層紗布過濾去渣，加熱煮沸并于濾液中加入12 g瓊脂粉，待瓊脂粉充分融化后用去離子水定容至1 L，分裝，滅菌。

1.1.3 主要器材 三目生物顯微鏡、血球計數板、恒溫培養箱、培養皿（直徑9 cm）、玻片等。

1.2 方法

1.2.1 水瓊脂平板劃線法 先倒1層大約1 mm的水瓊脂平板，然后將孢子囊懸浮液滴在平板上，于10×10倍顯微鏡下觀察，將含有單個孢子囊的部分小心切下，用鑷子將含有孢子囊的一面朝上置于黑麥培養基上，封口，置于18 ℃恒溫培養箱中培養，及時觀察其萌發情況。

1.2.2 改進后的分離方法 改進后的分離方法具體操作如下：

（1）用接種針從發病的馬鈴薯葉片上挑取少許菌絲，在含有200 μL無菌水的2 mL離心管中攪拌數次，待接種針上的菌絲和孢子囊混入無菌水后，用轉速為1 500 r/min的渦旋機渦旋30 s，重復2次。隨后用血球計數板調整孢子囊懸浮液濃度，將孢子囊懸浮液濃度調整到1個/2 μL。（2）于1片載玻片上放置3個已用75%乙醇滅菌的蓋玻片，分別在3個蓋玻片上滴1滴孢子囊懸浮液，然后于10×10倍顯微鏡下鏡檢，若觀測到單個孢子囊，則在液滴上加蓋1塊0.8 cm×0.8 cm 的黑麥培養基，隨后將其轉移至滅菌過的空培養皿中，封口。（3）將培養皿放至4 ℃冰箱中低溫處理2～3 h，刺激孢子囊釋放游動孢子[13]，然后轉移到11 ℃的環境存放 16～18 h，促進游動孢子萌發[14]，最后放置18 ℃的恒溫培養箱中培養4～10 d。（4）待萌發的孢子囊在黑麥培養基塊上產生菌絲，在超凈工作臺中將其轉移至黑麥培養基平板上培養，于18 ℃恒溫培養箱中培養，即可得到由單個孢子囊生長而來的菌株。

2 結果與分析

2.1 單獨侵染與多重侵染病斑面積比較

接種后5 d，YN3菌株單獨侵染時相對病斑面積約為12%，AS22菌株單獨侵染時相對病斑面積約為7%，而將二者按相同的比例混合，進行多重侵染時，相對病斑面積約為24%，相對病斑面積顯著增加了近2倍。

2.2 多重侵染單孢子囊分離情況

YN3菌株所占比例為57%，大于AS22菌株所占的43%，這結果符合單獨侵染時，YN3菌株的侵染力大于AS22菌株。

2.3 單孢子囊分離結果

2種單孢子囊分離結果見表1，對同一菌株采用水瓊脂平板劃線法分離100個孢子囊，最后僅能存活12個分離物，存活率僅為12%；而采用改進后的方法分離100個孢子囊，最后能存活68個分離物，存活率達到了68%，存活率是改進前的5.7倍。

3 討論

從試驗得到的數據來看，將2個不同基因型的馬鈴薯晚疫病菌混合接種到同一葉片上，在接種量（孢子囊數量）保持一致的條件下，混合侵染后的侵染能力明顯大于單獨侵染。單獨侵染時，YN3的相對病斑面積是AS22的 1.71 倍；混合侵染的葉片上YN3的孢子囊數量是AS22的 1.33 倍。表明單獨侵染和混合侵染時，2個菌株毒力的提高大致呈相同比例，也就是說，混合侵染使得2個菌株互相競爭，為了爭取更多的生存空間和資源，二者都提高了自身的毒力，使得自身能在競爭中保持競爭力，避免資源被對方完全占據而失去生存空間。

對于混合侵染時病原物的侵染力有何變化，已有眾多學者開展了研究[6-8]，前人研究結果表明，由于寄主資源有限，混合侵染會使得病原物之間的競爭加劇，從而使得病原物的侵染力提升[4-5]。然而也有一部分試驗觀察到，混合侵染不僅沒有使病原物的侵染力上升，侵染力相比單獨侵染時反而下降了[15]。本研究結果表明，混合侵染后病原物的侵染力出現顯著的提升，且二者的競爭力關系沒有發生顯著的改變。有些試驗的結論[15]卻與之相反，甚至在相同病原物、相同寄主的試驗中也出現了這種情況[3]。今后研究要增加病原物的數量，主要是增加侵染力不同的菌株之間的競爭情況，還有多重侵染時會發生什么情況。將來計劃除了本試驗中使用的2株馬鈴薯晚疫病菌株，再增加2株侵染力相當，但是與本試驗所使用菌株有明顯差異的馬鈴薯晚疫病菌菌株，按兩兩組合、3個組合、4個組合進行混合侵染，以便得到更為豐富的試驗結果。

當前所使用的單孢子囊分離方法——水瓊脂平板劃線法明顯無法滿足如此大量的分離工作。目前，針對馬鈴薯晚疫病菌的單孢分離對象主要有2種，一是分離游動孢子；二是分離孢子囊。因為游動孢子體積極小，只有配制成懸浮液方能分離。但是配制成懸浮液后，因為游動孢子體積太小，且不斷在懸浮液中游動，鏡檢后也很難確定其位置，所以分離難度大。孢子囊相對游動孢子大得多，而且在懸浮液液滴中不易移動，容易鏡檢確定位置，便于分離。

污染率高、萌發率低是影響單孢子囊分離存活率的兩大主要問題。楊志輝等采用單游動孢子的方法分離馬鈴薯晚疫病菌，平均分離率可高達51.6%[16]，如果每個游動孢子都有這樣的分離率，一個孢子囊有6個以上的游動孢子[17]，完全釋放后至少能有3個游動孢子存活。根據上述思路，我們針對單個孢子囊的分離進行改進，用低溫刺激的方法促進孢子囊釋放游動孢子，進而利用游動孢子的數量來提升存活率。

改進后方法相比較于水瓊脂平板劃線法，主要改進之處是操作難度降低，工作效率和存活率提高。水瓊脂平板劃線法首先要鏡檢，要找到一處只有單個孢子囊的地方，然后還要在顯微鏡下劃線切割，該過程如果操作不當很容易把多余的孢子囊也切割下來。劃線切割完成后還要用鑷子轉移水瓊脂塊，為了方便鏡檢，水瓊脂平板一般都倒得很薄，所以鑷子很容易把水瓊脂捏碎，即轉移操作難度較大，改進后的方法克服了這一難題。同時，改進后的方法鏡檢快，只需要檢查液滴上是否有單個孢子囊。鏡檢后操作也很簡單，只需要在液滴上加蓋1塊0.8 cm×0.8 cm的黑麥培養基，再轉移到空的培養皿中即可。從實際操作時間來看，改進后的方法大大節省了操作時間，提高了工作效率，為馬鈴薯晚疫病菌甚至致病疫霉的群體研究帶來了極大便利。

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