光照對花生網斑病菌生長、產孢及致病力的影響

胡彥江+張茹琴

摘要：研究了不同光照條件對花生網斑病菌（Phoma arachidicola Marasas，Pauer & Boerema）生長、產孢及致病力的影響。結果表明，在燕麥培養基上培養14 d時，病原菌在近紫光、全光照條件下的菌落直徑（分別為6.2 cm和 6.3 cm），顯著高于黑暗、光暗交替（12 h-12 h）條件下的菌落直徑（分別為3.9 cm和4.3 cm）。在黑暗或光暗交替（12 h-12 h）條件下培養22 d時，花生網斑病菌在燕麥、玉米瓊脂或花生葉煎汁培養基上均未產生分生孢子，但在近紫光下，除玉米瓊脂培養基外，在燕麥培養基和花生葉煎汁培養基上均產生大量的分生孢子，濃度分別為3.1×106個/mL 和7.0×105個/mL。在近紫光下，花生離體葉片于接種病原菌孢子懸浮液后7 d開始發病，但在黑暗、光暗交替條件下未發病。因此，近紫光有利于花生網斑病菌菌絲生長、產孢及致病。

關鍵詞：花生網斑病菌；光照；生長；產孢；致病力

中圖分類號： S435.652

文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2016）04-0174-03

花生（Arachis hypogaea L.）是一種重要的油料和經濟作物，在世界范圍內廣泛種植。其中，中國是世界上最大的花生生產、消費和出口國。據統計，2013年我國花生種植面積達4.71×106 hm2[1]。但由于種植面積的增加，花生連作重茬現象也越來越嚴重，從而導致各種病害也逐年加重，嚴重限制了花生產量及品質的進一步提高[2]。隨著病害控制過程中農藥的大量使用，給花生食品安全及出口也帶來了極大的隱患[3]。

花生網斑病，又稱云斑病、褐紋病、污斑病，1973年在美國德克薩斯州首次發生，1982年首次在我國山東、遼寧等花生產區發現，隨后在陜西、河南等省發生[4]。該病害是一種主要危害花生葉部的真菌病害，也是近年來花生上的嚴重病害之一[2，4]。在花生中后期發病最重，主要危害葉片，其次危害葉柄和莖部，導致花生生長后期大量落葉，影響產量，一般可減產10%～20%，嚴重時達30%以上[2，4]。目前，國內外學者就該病害的病原學[5-7]、發生條件[8-9]及田間病害流行動態[4]等方面進行了研究。Marasas等用發生學方法，結合產孢方式，將該病原菌的無性階段鑒定為半知菌亞門、球殼孢目、莖點霉屬、花生莖點霉（Phoma arachidicola Marasas，Puaer & Boerema）[5]，我國李君彥等的鑒定結果[7]與之一致。該病菌一般以菌絲和分生孢子器在殘葉組織中越冬，病害田間始發期為6月上旬，高峰期在7月份以后，期間持續陰雨和生長后期低溫有利于病害發展[7]。病害的發生與花生生育日數、氣溫和相對濕度呈正相關，與降雨量呈負相關，其中效應最大的為花生生育日數。因此即使不同年度間溫濕度有所變化，第一次病害高峰期出現時間基本一致[8]。不同花生品種間網斑病抗性存在一定差異，在遼寧，花生品種四粒紅﹥白沙1016﹥花育20﹥黑花生﹥白花生[4]。

在花生網斑病菌研究過程中，一株分離自山東省花生研究所萊西試驗田的花生網斑病菌，常規培養時菌絲生長緩慢且難以產生分生孢子，成為該病害后續室內研究的瓶頸問題。因此，本試驗的主要目的是探索光照對花生網斑病菌菌絲生長、產孢及致病力的影響，為花生網斑病后續研究的展開奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 光照對花生網斑病菌菌絲生長的影響

將4 ℃冰箱保存的花生網斑病菌，活化后打取直徑5 mm菌餅，接種于燕麥培養基平板中央，分別置于黑暗、光暗交替（2 400 lx，12 h-12 h）、光照（日光燈2 400 lx）、近紫光（8 W×3）下，25 ℃培養。每處理4個重復，每重復1皿。培養 14 d 后，取出培養物，按照十字交叉法測量菌落直徑，計算平均值。

1.2 營養及光照對花生網斑病菌產孢量的影響

1.2.1 培養基的制作 選用3種產孢培養基，分別為玉米培養基、燕麥培養基和花生葉煎汁培養基。其中，玉米培養基配方：將一定量的自來水煮沸后，加入100 g玉米粉，攪拌均勻，文火煮沸后再煮1 h。趁熱用4層紗布過濾，在濾液中加入12 g瓊脂粉，加熱過程中不斷攪拌至充分熔化后，用自來水定容至1 000 mL。調pH值為6.5。燕麥培養基配方：自來水煮沸后加入30 g燕麥片，文火煮沸后1 h。趁熱用4層紗布過濾，濾液中加入12 g瓊脂粉并不斷攪拌至瓊脂熔化后，用自來水定容至1 000 mL。調pH值為6.5。花生葉煎汁培養基配方：將200 g去皮馬鈴薯塊和31 g洗凈的花生葉片一起文火煮沸30 min。趁熱用4層紗布過濾，濾液中加入12 g瓊脂粉直至熔化，然后加入20 g葡萄糖，溶解后用自來水定容至 1 000 mL。調節pH值至6.5。

1.2.2 不同光照條件對花生網斑病菌產孢量的影響 用直徑5 mm的打菌器打取病原菌菌餅，接種于上述3種培養基制成的平板中央（直徑9 cm）后，分別置于黑暗、光暗交替（日光燈2 400 lx，12 h-12 h）、近紫光（波長340～380 nm，8 W×3）下，于25 ℃恒溫培養。每次試驗3個重復，每重復1皿，共重復3次。

1.2.3 花生網斑病菌產孢量測定 接種22 d后，每個培養皿中加入20 mL無菌水，靜置30 min后制成孢子懸浮液，用移液槍取20 μL用血球計數板對孢子進行計數，每處理重復3次，求平均值。

同時挑取培養基上的小黑點，制成臨時水裝切片，在 Olympus 光學顯微鏡下觀察菌絲、厚垣孢子、分生孢子器及分生孢子的顏色、形態及產生情況，用LEICA ICC50 HD攝像顯微鏡拍照。

1.3 光照對花生網斑病菌離體葉片致病力的影響

致病力測定選用網斑病菌感病品種白沙1016，室內盆栽備用。測定時，取長勢、大小、生長位置一致的花生葉片，用自來水沖洗后，在超凈工作臺上用無菌水沖洗3～4次。無菌條件下將花生葉片置于裝有滅菌濕潤濾紙的培養皿中（直徑 16 cm），每個培養皿內放置1片花生復葉，用移液器取上述 1 mL 分生孢子懸浮液，滴于花生葉片上，對照滴等量的無菌水。將培養皿分別置于黑暗、光暗交替、近紫光條件下、28 ℃恒溫箱培養。注意觀察，記錄葉片發病時間及癥狀。每處理3個重復，共重復3次。

1.4 數據處理

分別用Microsoft Excel 2007與SAS 8.1數據分析軟件進行繪圖和方差分析。

2 結果與分析

2.1 光照對花生網斑病菌菌絲生長的影響

由圖1可知，培養14 d時，不同光照對花生網斑病菌菌絲的生長有極顯著的影響（P<0.01）。其中，在近紫光和全光照（日光）條件下，菌落直徑（6.2 cm、6.3 cm）無極顯著差異（P>0.01）；在黑暗和光暗交替條件下，菌落直徑（3.9 cm、4.3 cm）也無極顯著差異（P>0.01）。但是，在近紫光和全光照條件下的菌落直徑與黑暗和光暗交替條件下的菌落直徑有極顯著差異（P<0.01）。這說明，在近紫光和全光照條件下，菌絲生長顯著快于黑暗和光暗交替條件。

2.2 光照對花生網斑病菌產孢量的影響

花生網斑病菌培養22 d后（表1），在光暗交替（12 h-12 h）和黑暗條件下，在3種培養基上，菌絲無色，凝集成束時呈黃色，產生少量黃褐色厚垣孢子，無分生孢子器產生。在近紫光下，在3種培養基上均產生大量的小黑點——分生孢子器，在燕麥培養基和花生葉煎汁培養基上，有大量分生孢子產生，但在玉米瓊脂培養基上，分生孢子器中未產生分生孢子。在燕麥培養基上，分生孢子大多為橢圓形，單胞，極少數為雙胞，平均大小為20 μm×12.5 μm。

在燕麥培養基上和花生葉煎汁培養基上，分生孢子濃度分別為3.1×106、7.0×105個/mL，二者差異極顯著（P<001）。說明誘導花生網斑病菌產孢的有利條件為用燕麥培養基，并輔以近紫光照射。

2.3 光照對花生網斑病菌致病力的影響

在近紫光下，花生葉片于接種后7 d開始發病，病斑網紋狀，與田間自然發病癥狀相同；至接種后20 d時，病斑進一步擴大。但在黑暗、光暗交替條件下，在觀察期內，葉片始終未表現癥狀。說明近紫光有利于花生網斑病發生（圖2）。

3 結論與討論

光對地球上的生命來說，既是一種基本的能源也是主要的環境信號。除植物以外，光的感應現象還存在于很多非光孢子；無分生孢子器產生0 C近紫光玉米培養基菌絲黃褐色，聚集成束；形成極少量的厚垣孢子；有分生孢子器形成，但未見有分生孢子0 C燕麥培養基形成黃褐色厚垣孢子；有分生孢子器及大量分生孢子形成3.1×106 A花生葉汁培養基形成黃褐色厚垣孢子；有分生孢子器及大量分生孢子形成7.0×105 B合作用的生物中[10]。空氣、光和營養缺乏對真菌孢子發育都有影響。試驗表明，藍光和近紫光可以調節真菌甚至哺乳動物等大多數生物的生理活動[11]。光信號可影響真菌的生長發育、形態、新陳代謝及基因表達等[12]。對于花生網斑病菌，如果利用常見促孢培養基，如燕麥培養基、玉米培養基，在黑暗條件下培養，即便經過長時間的培養，該病原菌不能或僅能產生極少量的分生孢子，這成為限制花生網斑病后續研究的瓶頸問題。在本試驗中，發現光照對花生網斑病菌菌絲生長及產孢量有顯著影響。在近紫光和全光照條件下，菌絲生長顯著快于黑暗和光暗交替條件。在近紫光條件下，在燕麥培養基和花生葉煎汁培養基上均能產生大量的分生孢子。這個結論與李君彥等認為花生網斑病菌“誘發產孢以使用燕麥瓊脂培養基，輔以近紫光照射效果最佳”的結論[7]一致。

在花生網斑病菌致病力測定試驗中，發現利用分生孢子懸浮液接種室內盆栽花生葉片時不能或很少能使之發病，這與王振躍等[13]、李君彥等[7]的試驗結果不同。但盆栽花生在室外自然接種時卻易于發病。考慮到近紫光對網斑病菌菌絲生長及誘導產孢的影響，推測該病菌的致病力可能與一定波長的光有關，本研究結果也印證了這一推想：與黑暗條件、光暗交替條件相比，近紫光照射對花生網斑病菌的致病力有非常顯著的影響。這個結果與胡麗等報道的“適當的近紫外光（12 h光-12 h暗）處理有利于病菌的侵染”[14]一致。

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