香蕉枯萎病拮抗放線菌8N—10的分離鑒定及抑菌效果評價

王飛+周登博+廉法欽+陳宇豐+高祝芬+戚春林+張錫炎

摘要：為了分離對香蕉枯萎病病原菌有拮抗作用的放線菌，對菌株8N-10進行鑒定及測定抗菌活性。采用梯度稀釋涂布平板法和平板對峙法分離拮抗菌，通過形態學特征、生理生化特征、16S rDNA序列測定及建樹分析確定其分類學地位。用平板對峙的方法測定菌株對9種香蕉病原菌的拮抗作用，最后用盆栽試驗的方法驗證菌株8N-10對香蕉枯萎病的防效。結果表明，共分離出10株拮抗放線菌，初步鑒定拮抗性最好的菌株8N-10為諾爾斯氏鏈霉菌（Streptomyces noursei）對香蕉枯萎病病原菌4號小種的抑菌帶達（15.5±0.65） mm。菌株8N-10對所有供試病原菌均具有不同程度的拮抗活性，表現出良好的廣譜抗菌特性。其中，菌株8N-10對香蕉葉緣枯斑病病原菌（Alternaria musae）、粉蕉葉枯病病原菌（Pestalogiopsis sp.）、香蕉長形斑病病原菌（Curvularia fallax）的抑菌帶均達到10 mm以上，顯示了較強的抑制活性。菌株8N-10發酵液對香蕉枯萎病的相對防治率達92.708%，具有很好的防治效果。諾爾斯氏鏈霉菌8N-10對香蕉枯萎病的抑菌活性高，且其抑菌譜廣，具有很好的應用前景。

關鍵詞：香蕉枯萎病；拮抗菌；諾爾斯氏鏈霉菌

中圖分類號： S476

文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2016）04-0179-05

香蕉枯萎病，別稱巴拿馬病、黃葉病，是由尖孢鐮刀菌古巴專化型引起的毀滅性土傳維管束病害[1]。該菌分為4個生理小種[2]，其中4號小種侵染范圍最廣，幾乎危害所有的香蕉品種。目前該病已經傳遍我國廣東、廣西、福建、云南、海南等主要香蕉種植產區[3]，因此分離具有拮抗作用的放線菌，從而達到生物防治香蕉枯萎病的效果不失為一個很有意義的研究方向。生物防治是植物病蟲害綜合治理的重要手段，是保護生態環境、實現農業可持續發展的有力保障[4]。何欣等研究發現施用生物有機肥能顯著促進香蕉植株生長，有效降低香蕉枯萎病的發病指數[5]。隨著人們的不斷探究，發現放線菌中的鏈霉菌對香蕉枯萎病菌的抑制作用非常明顯[6]。秦涵淳等用分離出的2株放線菌發酵液進行盆栽試驗，結果對香蕉枯萎病防效達86%以上，極顯著高于惡霉靈藥劑處理[7]。本研究對采集的香蕉根際土壤放線菌進行了分離篩選，選其中1株對香蕉枯萎病菌拮抗作用最強的的放線菌 8N-10 進行菌株鑒定，并測定該菌株對香蕉枯萎病的抑制效果以及菌株對其他香蕉病原菌的廣譜拮抗性能。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試病原菌為香蕉枯萎病病原菌（Fusarium oxysporium f. sp. cubense 4，FOC4）、香蕉長形斑病菌（Curvularia fallax）、香蕉炭疽病菌（Colletotrichum musae）、香蕉大灰斑病菌（Curvularia lunata）、貢蕉眼斑病菌（Bioplaris oryzae）、香蕉果尖腐爛病菌（Deightoniella troulosa）、香蕉葉緣枯斑病菌（Alternaria musae）、貢蕉煙頭病菌（Fusarium sp.）、粉蕉葉枯病菌（Pestalogiopsis sp.）均由筆者所在實驗室保存[8]。供試土壤為海南省臨高縣南寶鎮（109°51′18″E，19°47′3″N）香蕉園健康植株根際土壤。除去石子、根系等雜物，混勻后用無菌封口袋采集，于 4 ℃ 冰箱保存。培養基按照文獻[9]的方法配制。放線菌分離和培養采用高氏一號瓊脂培養基，倒平板前加入0005% 的重鉻酸鉀來抑制細菌和真菌的生長；用PDA培養基進行病原菌的培養以及拮抗試驗；鑒定用培養基參照文獻[10]的方法配制。

1.2 拮抗放線菌的分離與篩選

1.2.1 土壤放線菌的分離 稱取土樣5 g，加入45 mL無菌水，于28 ℃、200 r/min的搖床中振蕩1 h，吸取上清液用無菌水逐級稀釋成10-2、10-3和10-4濃度，每個濃度各吸取 100 μL 涂布到含重鉻酸鉀的高氏一號培養基平板上，封口膜封口后倒置培養在28 ℃的生化培養箱中，適時挑取不同形態的單個菌落分離劃線，純化并保存。

1.2.2 篩選拮抗放線菌 采用瓊脂塊平板對峙培養法[11]篩選拮抗放線菌，用打孔器截取直徑5 mm的香蕉枯萎病病原菌菌餅于PDA平板中央，并在周圍4個角距離病原菌邊緣 2.5 cm 處接種待測菌株，對照只接病原菌菌餅，倒置培養在28 ℃的生化培養箱中，對照組菌絲鋪滿培養基時觀察試驗組抑菌情況，測量抑菌帶的寬度。根據有無抑菌帶篩出對FOC4有拮抗效果的菌株，連續接種5代進行復篩，選取抑菌帶最寬的菌株進行下一步試驗。

1.3 拮抗菌株的鑒定

1.3.1 形態學觀察 將拮抗菌株劃線接種于高氏一號培養基，28 ℃插片培養 7～14 d，顯微鏡下觀察菌體的形態特征。

1.3.2 培養特征觀察 采用文獻[12]提供的方法，將拮抗菌株分別接種在高氏一號、ISP2、ISP3、ISP4、ISP5、ISP6、ISP7培養基上，28 ℃培養8～15 d，觀察培養基內菌絲、氣生菌絲的生長狀況和可溶性色素的顏色。

1.3.3 生理生化特性測定 測定拮抗菌株明膠液化、酯酶、脲酶、淀粉水解、纖維素利用、硝酸鹽還原、H2S的產生、pH值和氯化鈉耐受范圍、碳源利用、氮源利用等生理生化特性[10]。

1.3.4 細胞壁化學成分分析 采用快速薄板層析法[13]對菌株8N-10的全細胞水解液的氨基酸和糖型進行分析。

1.3.5 分子生物學鑒定 采用堿裂解法提取基因組DNA[14]，用通用引物27F，5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，1 492R，5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′進行PCR擴增。反應體系50 μL，10 μL DNA模板、引物1 492R、27F各17 μL、25 μL DreamTaqTMGreen PCR master mix、22 μL ddH2O。PCR擴增程序：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸1.5 min，30個循環；72 ℃終延伸 10 min，4 ℃保存。PCR產物送至北京六合華大基因科技股份有限公司進行測序。將測序獲得的16S rDNA序列通過Blast程序、BioEdit、Mega 6.0軟件進行分析并構建系統發育樹。

1.4 抗菌譜的測定

將指示真菌菌盤接種在PDA平板中央，在真菌菌餅周圍四角距離2.5 cm處接種8N-10菌株，對照只接病原菌菌餅，倒置培養在28 ℃的生化培養箱中，試驗設3個平行。待對照長滿培養皿時觀察測量抑菌帶的寬度并拍照記錄。

1.5 拮抗放線菌發酵液對FOC4抑制作用的測定

1.5.1 拮抗菌發酵液的制備 將拮抗菌接種到大豆粉液體培養基中，28 ℃、200 r/min振蕩培養7 d。

1.5.2 制備FOC4孢子懸浮液 選取FOC4菌絲鋪滿平板的PDA培養基，用無菌水配制成1×106 CFU/mL孢子懸浮液。

1.5.3 拮抗放線菌發酵液對FOC4孢子萌發影響情況的測定 將拮抗菌發酵液8 000 r/min離心5 min，上清液用微孔濾膜過濾除菌后與FOC4孢子懸浮液等體積混合均勻置于玻片上，光照培養在28 ℃、濕度為80%的人工氣候箱中24 h，無菌水對照。在顯微鏡下觀察，以孢子萌發的芽管長度達到或超過孢子直徑長度的一半定為萌發[15]，并計算各處理的孢子萌發率，以5次重復的平均值作為測定結果。

孢子萌發抑制率=[（對照孢子萌發率-處理孢子萌發率）/對照孢子萌發率]×100%。

1.5.4 拮抗放線菌8N-10對香蕉枯萎病抑制的盆栽效果測定 試驗設4個處理，分別為染病后澆清水、染病后澆不加拮抗菌的發酵液、染病后澆拮抗菌發酵液、不染病澆清水。每處理設20個重復。

種苗染病采用蘸根接種法[14]接種后置于室溫、自然光照條件下培養，每3 d澆1次水。待染病各組均有香蕉苗葉片變黃后，處理2施用無菌發酵液，處理3施用拮抗菌發酵液，每株灌注100 mL，每7 d澆1次發酵液。連續試驗90 d后統計各處理病情指數（DSI）。

病情分級，0級為無癥狀；1級整株無變黃葉片；2 級為1株2片葉萎蔫；3級為全株 1/3～1/2 葉片萎蔫；4級為全株1/2株黃葉葉片萎蔫；5級為全株3/4 以上葉片萎蔫或死亡[16]。

DSI=∑（病害的級別×該級別的植株數）/供試植株數[16]。

相對防治效果=[（對照病情指數-處理病情指數）/對照病情指數]×100%[17]。

2 結果與分析

2.1 菌株篩選

初步篩選獲得10株拮抗放線菌，其中8N-10對香蕉枯萎病菌的抑菌帶最大，達到（15.5±0.65） mm，因此選取該菌株作進一步研究。

2.2 拮抗菌株的鑒定

2.2.1 形態學結果 菌株8N-10的菌絲生長旺盛，分枝明顯（圖1-A），無橫膈膜（圖1-B）。

2.2.2 培養特征結果 菌株8N-10在不同培養基上的菌落形態如圖2所示，菌落在7種培養基上均呈近圓形，在ISP2、ISP4、ISP5、ISP7培養基上褶皺明顯，在ISP1、ISP2培養基上氣生菌絲呈粉末狀覆蓋在表層。具體形態特征見表1。

2.2.3 生理生化特性測定 在碳源利用方面菌株8N-10能很好地利用鼠李糖、木糖、阿拉伯糖、水楊苷、可溶性淀粉、纖維二糖、山梨醇、D-果糖、α-乳糖、葡萄糖、蔗糖、D-甘露醇，能較好地利用松三糖、無水乳糖、肌醇、木聚糖、核糖、蜜二糖，對D-半乳糖利用效果不是很好，不能利用海藻糖、甘露醇；在氮源利用方面能很好地利用甘氨酸、羥基脯氨酸、纈氨酸，能較好地利用四水合鉬氨酸，在蛋氨酸、苯基丙氨酸、硫酸銨、硝酸銨、絲氨酸上生長一般，在組氨酸、半胱氨酸上生長不佳，不能在精氨酸、草胺酸、乙酸銨為氮源的培養基上生長；菌株8N-10有淀粉水解能力；能使硝酸鹽還原；能產生尿素酶；能分解吐溫20，不能分解吐溫40和吐溫80；不產H2S；不能水解纖維素；能使明膠液化；pH值為4～10均可生長；在鹽度為1%～2%時生長，在2%以上不能生長（表2）。

2.2.4 細胞壁化學成分 細胞壁化學成分分析顯示，菌株8N-10細胞壁含有谷氨酸、丙氨酸等，化學組分屬于Ⅰ型，其全細胞水解不含特征性糖，糖型為C。

2.2.5 16S rDNA堿基序列測定 放線菌8N-10用通用引物擴增后，PCR產物大小在1 500 bp左右，測序得出序列長度為1 422 bp。與GenBank數據庫中相關種屬的菌株進行序列比對，發現與菌株8N-10同源性達99%的均為鏈霉菌。選取20個序列進行系統發育學分析（圖3），菌株8N-10與Streptomyces noursei（諾爾斯氏鏈霉菌）聚為一支，結合形態學特征、生理生化特征初步將菌株8N-10歸類為諾爾斯氏鏈霉菌。

2.3 抗菌譜測定結果

平板對峙結果顯示菌株8N-10抗菌譜廣，對所有供試病原菌均具有不同程度的拮抗活性。其中，菌株8N-10對香蕉葉緣枯斑病（圖4-A）、粉蕉葉枯病（圖4-B）、香蕉長形斑病（圖4-C）病菌的抑制活性較強，抑菌帶均達到10 mm以上，對長形斑病抑制效果最好，抑菌帶達到13.30 mm（表3）。

2.4 拮抗放線菌發酵液對FOC4抑制作用測定結果

2.4.1 對FOC4孢子萌發抑制作用的測定結果 對照組的FOC4孢子萌發率達到了90.25%（圖5-A），經拮抗菌發酵液處理的FOC4 孢子萌發率為5.16%（圖5-B），發酵液對孢子萌發的抑制率達94.28%（圖5）。

2.4.2 盆栽防效結果 連續栽種90 d后，接染病原菌后澆清水（圖6-A）的一組香蕉苗全部死亡干枯，病情指數達到5；接染病原菌后澆無菌發酵液（圖6-B）的一組香蕉苗只剩4株依然存活，且剩余4株苗全株1/2葉片萎蔫，該組病情指數4.8；接染病原菌后澆加菌發酵液（圖6-C）的一組香蕉苗存活19株，1株干枯死亡，病情指數0.35，植株長勢優良；未接菌澆清水（圖6-D）的一組香蕉苗均能成活，但生長狀況差。初步結果表明拮抗菌發酵液對香蕉枯萎病的相對防治效果為92.708%，且種苗生長狀況良好（圖6）。

3 結論與討論

大量研究結果表明，應用拮抗微生物能安全有效地防治果蔬病害[18-19]，目前人們已成功分離和篩選到數百種對果蔬病害有明顯抑制效果的拮抗微生物[20-22]，有數十種微生物已研發成菌劑在生產上應用。但香蕉枯萎病的生物防治研究起步較晚，目前還沒有成功的商業化產品[22]。南寶蕉園的香蕉連續留芽10年，而枯萎病的發病率依然在10%以下，除了規范化的管理以外，其土壤環境必然有特殊之處。

本研究從南寶蕉園香蕉根際土壤中分離出10株拮抗放線菌，其中8N-10在平板上對枯萎病菌的抑菌帶達到 （15.5±0.65） mm，和同類研究中的15.3 mm的抑菌帶寬度相當[17]。結合生理生化特征、分子生物學鑒定等結果初步將菌株8N-10歸類為諾爾斯氏鏈霉菌。以諾爾斯氏鏈霉菌作為生防菌防治香蕉枯萎病目前尚未有報道，本研究發現拮抗菌8N-10的發酵濾液對香蕉枯萎病菌的孢子萌發有很好的抑制作用，抑制率達到94.28%。其發酵液對患病香蕉苗的治療效果很好，相對防治效果為92.708%，盆栽防控效果比俞魯等報道的防治效果為74%[23]要好，而且施用發酵液的香蕉苗營養供應充足，長勢良好。拮抗菌8N-10對香蕉的其他8種病害病原菌均有一定的抑制作用，其抑菌譜廣。其中，菌株8N-10對香蕉葉緣枯斑病、粉蕉葉枯病、香蕉長形斑病的抑菌帶均達到10 mm以上，具有較強的抑制活性，但其廣譜抑菌效果不如黃霄等報道的類植物乳桿菌[24]。但綜合結果表明拮抗菌8N-10在香蕉病害的防治方面具有很好的開發價值。

農用抗生素大多來源于放線菌，因此從放線菌中篩選拮抗菌一直是生防菌研究熱點[25]。諾爾斯氏鏈霉菌產生的化合物已有報道[26]，本研究所篩選出的菌株其有效活性成分還有待進一步試驗，其對病原菌的拮抗機理還有待進一步探究。

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