解淀粉芽孢桿菌JSSW—LA的分離鑒定及對病原菌拮抗特性

孫梅+張維娜+高亮+陳秋紅+施大林+匡群+鄒益東+張憲中

摘要：為了篩選1株對水產病原菌具有拮抗作用的菌株，對菌株JSSW-LA進行生理生化鑒定、16S rDNA序列測定及系統發育樹的構建，采用體外抑菌試驗、共培養試驗考察菌株JSSW-LA對多種水產病原菌的拮抗作用。經鑒定表明，菌株JSSW-LA為解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens），JSSW-LA對嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）、維氏氣單胞菌（Aeromonas veronii）、溫和氣單胞菌（Aeromonas sobria）、愛德華氏菌（Edwardsiella）、豚鼠氣單胞菌（Aeromonas caviae）具有一定的抑制作用，其中對溫和氣單胞菌、豚鼠氣單胞菌抑制效果顯著。共培養結果顯示，低起始濃度的JSSW-LA（2.8×103 CFU/mL）能夠顯著抑制溫和氣單胞菌、豚鼠氣單胞菌生長，高起始濃度的JSSW-LA（2.8×106 CFU/mL）對5種致病菌均具有一定的抑制作用。結果表明，解淀粉芽孢桿菌JSSW-LA對水產中的常見致病菌具有較好的抑制作用，是1株拮抗性能優良的微生物菌株，在水產養殖中具有廣闊的應用前景。

關鍵詞：解淀粉芽孢桿菌；分離；鑒定；病原菌；拮抗

中圖分類號： S182

文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2016）04-0275-04

近年來，隨著高密度集約化養殖規模日益擴大，過度提高養殖高密度和過量投餌的養殖方式使養殖動物排泄物、腐爛的殘餌及其他生物殘體大量沉積，氮、磷等富營養因子排入水體，加重了養殖自身污染，使有害藻類及病菌大量繁殖，養殖水體生態環境日益惡化，并且極大地增加了水產動物之間病原體交叉感染的機會。為此，各類魚病多發，甚至造成水產動物大面積的死亡，這不僅降低了水產品的質量，而且給水產養殖業造成了嚴重的經濟損失。

傳統魚病防治方法是施用藥物，但是此方法容易產生藥物殘留、耐藥性提高等缺點；并且疫苗因針對性強、操作不便等原因，無法大規模使用；抗生素使用不當也容易導致養殖水產品產生耐藥性，污染環境，所以限制其使用。益生素（prodiotics）是近年來國內外迅速崛起的一類微生態制劑，因其具有調節宿主腸道菌群平衡、提高機體健康水平、避免服用抗生素帶來的耐藥性和二重感染等問題的優點，廣泛地應用于醫療、保健、食品、畜牧和水產等行業[1]。芽孢桿菌是最早應用于水產養殖中的益生菌，具有穩定性高、耐加工、易保存等優點；同時，芽孢桿菌被證明具有抗菌活性，能夠產生細菌素（抗菌肽），可以提高水生動物對養殖環境的適應能力和抗病能力，其安全、有效的優點可逐步替代抗生素的使用[2]。本研究從池塘底泥中分離得到1株編號為JSSW-LA的菌株，通過主要理化特性鑒定、16S rDNA序列測定結果及系統發育樹的構建表明，該菌株為解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）。本研究采用體外抑菌試驗考察解淀粉芽孢桿菌JSSW-LA 對水產常見病原菌的抑制作用，同時利用共培養試驗法考察不同濃度的解淀粉芽孢桿菌對病原菌的拮抗作用。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 菌株來源 JSSW-LA菌株分離篩選自無錫市鵝湖青魚池塘底泥。溫和氣單胞菌（Aeromonas sobria）、嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）、豚鼠氣單胞菌（Aeromonas caviae）、維氏氣單胞菌（Aeromonas veronii）、副溶血性弧菌（Vibrio Parahemolyticus）、愛德華氏菌（Edwardsiella）、鰻利斯頓氏菌（Listonella anguillarum）、大腸桿菌（Escherichia coli）、溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）由中國水產科學研究院淡水漁業研究中心魚病研究室提供。

1.1.2 培養基 分離篩選用培養基組成為：10 g/L麩皮，10 g/L 玉米漿干粉，5 g/L NaCl，pH值7.0。基礎培養基為BPY培養基[3]，組成為：5 g/L葡萄糖，1 g/L蛋白胨，5 g/L牛肉膏，5 g/L NaCl，pH值7.0。

1.1.3 儀器與試劑 PCR儀：Eppendorf Mastercycler gradient；凝膠成像系統：Molecular lmager ChemiDocTM XRST；移液器：Thermo Finnpipette；低溫離心機：eppendorf Centrifuge 5810R；電泳儀；高壓滅菌鍋、電子天平、超凈工作臺、振蕩培養箱、生化培養箱等均為國產品牌。

細菌生化反應管，購自廣東環凱微生物科技有限公司；細菌基因組DNA提取試劑盒，購自生工生物工程（上海）股份有限公司；PCR擴增試劑盒，購自大連寶生物工程有限公司；goldview染料，購自上海賽百盛基因技術有限公司；葡萄糖、蛋白胨、牛肉膏、NaCl等，購自國藥集團化學試劑有限公司；麩皮、玉米漿干粉，市售。

1.2 試驗方法

1.2.1 細菌菌株的分離純化 樣品采集于無錫鵝湖青魚池塘，稱取10 g池塘底泥置于裝有90 mL無菌水及少量玻璃珠的250 mL三角瓶中，振蕩30 min，靜置；取上清，接種于分離培養基中，37 ℃培養7 d。

每個樣品吸取1.0 mL，于80 ℃加熱10 min，用移液槍吸取0.1 mL于基礎培養基上，涂布，37 ℃培養。挑取單菌反復劃線純化3次，待長出菌落后，隨機挑選菌落并純化、編號、保存。

1.2.2 篩選菌株的鑒定

1.2.2.1 生理生化鑒定 參照《伯杰氏細菌鑒定手冊》[4]、《常見細菌系統鑒定手冊》[5]，挑取待檢菌落進行革蘭氏染色鏡檢，將0.85%生理鹽水稀釋至約109 CFU/mL的菌懸液接入細菌鑒定生化管，置于37 ℃培養，按照說明書觀察結果。

1.2.2.2 16S rRNA序列測定 利用細菌16S rRNA通用引物，其中正向引物7F：5′-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3′，反向引物1 540 r：5′-AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3擴增目的基因。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。以分離菌株JSSW-LA的基因組DNA為模板，25 μL PCR反應體系為：2.5 μL 10×buffer（含Mg2+）緩沖液、0.5 μL dNTP、0.2 μL酶、各0.5 μL引物，2 μL DNA模板，加無菌水補足體積至25 μL。PCR反應條件為：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 35 s，72 ℃ 1 min，35個循環；72 ℃ 8 min。取5 μL產物在含goldview染色劑的1%瓊脂糖凝膠上電泳，條件為150 V、100 mA、20 min。電泳結束后將凝膠放入凝膠成像系統，觀察結果。PCR擴增產物交由生工生物工程（上海）股份有限公司進行序列測定。

將菌株JSSW-LA的16S rDNA基因序列與GenBank中已知的核酸序列進行Blast分析，挑選同源性較高的序列在Cluster X軟件中完成序列比對，比對結束后用MEGA 4.1軟件構建系統發育樹。

1.2.3 解淀粉芽孢桿菌對病原菌的拮抗作用

1.2.3.1 解淀粉芽孢桿菌JSSW-LA抑菌性測定 紙片法是體外抑菌試驗的常用方法之一[6]，它不僅有利于觀察細菌通過分泌抗菌物質產生的抑菌圈，而且能夠觀測到具有優勢拮抗作用的菌株。將無菌濾紙片在濃度約為107 CFU/mL的解淀粉芽孢桿菌JSSW-LA新鮮培養液中浸泡1.0 h。取 01 mL 106 CFU/mL水產養殖中常見致病菌嗜水氣單胞菌、溫和氣單胞菌、維氏氣單胞菌、豚鼠氣單胞菌、愛德華氏菌、副溶血性弧菌、鰻利斯頓氏菌的液體培養液，分別涂布于LB瓊脂培養基平皿上，然后將浸泡過菌液的濾紙片貼于培養皿上，每個平皿貼3片，每個平皿3次重復。將平皿置于28 ℃培養箱中培養24、48 h，測量抑菌圈大小。

1.2.3.2 解淀粉芽孢桿菌JSSW-LA與致病菌共培養試驗 選取“1.2.3.1”節中經測定JSSW-LA對其能起到抑制生長作用的致病菌，活化后與解淀粉芽孢桿菌菌液共同接入營養肉湯培養基中，使培養基中解淀粉芽孢桿菌起始濃度分別為1×103、1×106 CFU/mL，致病菌起始濃度為1×106 CFU/mL，于30 ℃搖瓶培養48 h，其間于0、3.5、7.0、140、24.0、38.0、48.0 h取樣計數，觀察解淀粉芽孢桿菌JSSW-LA對致病菌的拮抗作用。

2 結果與分析

2.1 生理生化特性

經過分離純化，對得到的1株編號為JSSW-LA的菌株進行生理生化特征檢測，結果顯示，該菌株能分解利用葡萄糖、L-阿拉伯糖、木糖、甘露醇，能水解淀粉和明膠、分解酪素、還原硝酸鹽，分別能在50 ℃、pH值5.7、7%NaCl環境下生長，主要生理生化特性見表1。

2.2 系統發育學分析

菌株JSSW-LA基因序列測序結果表明，16S rRNA 基因長度為1 463 bp，將菌株所擴增的16S rRNA基因序列在 NCBI 通過Blast進行同源性檢索，結果表明為芽孢桿菌屬的16S rRNA基因序列，采用鄰接法構建的菌株分子發育樹見圖1，所分離菌株在系統發育樹上與解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）（登錄號：KC692189）屬同1支，同源性達99%以上。結合生理生化特征，將所分離菌株鑒定為解淀粉芽孢桿菌。

2.3 解淀粉芽孢桿菌JSSW-LA抑菌性的測定

從表2可看出，解淀粉芽孢桿菌JSSW-LA對嗜水氣單胞菌、溫和氣單胞菌、維氏氣單胞菌、豚鼠氣單胞菌、鰻利斯頓氏菌均具有一定的抑制作用，其中對溫和氣單胞菌、豚鼠氣單胞菌的抑制效果較顯著，對溶藻弧菌、大腸桿菌、副溶血性弧菌無明顯抑制作用。

2.4 解淀粉芽孢桿菌JSSW-LA與病原菌共培養

2.4.1 解淀粉芽孢桿菌與嗜水氣單胞菌共培養 由圖2可見，在共培養過程中，起始濃度為2.8×103 CFU/mL的JSSW-LA不能抑制嗜水氣單胞菌的生長；起始濃度為2.8×106 CFU/mL的JSSW-LA在共培養過程中對嗜水氣單胞菌的生長能夠起到一定的抑制作用；單獨培養的嗜水氣單胞菌在 48.0 h 內菌濃度由1.1×106 CFU/mL上升至7.0×109 CFU/mL，共培養的嗜水氣單胞菌在48 h內菌濃度由 1.1×106 CFU/mL 上升至1.8×109 CFU/mL，菌體量較單獨培養降低74.3%。因此可知，高起始濃度JSSW-LA對嗜水氣單胞菌的生長具有一定的拮抗作用。

2.4.2 解淀粉芽孢桿菌JSSW-LA與愛德華氏菌的共培養 由圖3可見，在JSSW-LA與愛德華氏菌共培養過程中，當2個起始濃度的JSSW-LA進入對數增長期后，愛德華氏菌菌體濃度增長緩慢或逐漸下降，說明2個起始濃度的JSSW-LA均能在不同程度上抑制愛德華氏菌的生長，試驗后期愛德華氏菌菌濃度上升與解淀粉芽孢桿菌JSSW-LA的活性降低有關。從試驗結果來看，高起始濃度的JSSW-LA比低起始濃度對愛德華氏菌的抑制效果更好。

2.4.3 解淀粉芽孢桿菌JSSW-LA與維氏氣單胞菌的共培養 由圖4可見，起始濃度為2.8×103 CFU/mL 的JSSW-LA在與起始濃度7.8×106 CFU/mL的維氏氣單胞菌共培養過程中無法抑制致病菌的生長，而起始濃度為2.8×106 CFU/mL 的JSSW-LA在共培養過程中對維氏氣單胞菌的生長能夠起到一定的抑制作用。單獨培養的維氏氣單胞菌在48.0 h內菌濃度由7.8×106 CFU/mL上升至1.9×109 CFU/mL，共培養的維氏氣單胞菌在48.0 h內菌濃度由7.8×106 CFU/mL上升至4.0×108 CFU/mL，菌體量較單獨培養降低78.9%。因此可知，高起始濃度的JSSW-LA對維氏氣單胞菌具有較好的拮抗作用。

2.4.4 解淀粉芽孢桿菌JSSW-LA與豚鼠氣單胞菌的共培養 由圖5可見，在JSSW-LA與豚鼠氣單胞菌共培養過程中，在7～14 h培養階段，與起始濃度為2.8×106 CFU/mL的JSSW-LA共培養的豚鼠氣單胞菌菌濃度由2.8×108 CFU/mL 降為6.6×103 CFU/mL，起始濃度為2.8×103 CFU/mL JSSW-LA共培養的豚鼠氣單胞菌菌濃度由 8.5×108 CFU/mL 降為7.8×106 CFU/mL。因此可知， 不同起始濃度的JSSW-LA均能不同程度抑制豚鼠氣單胞菌的生長，且高濃度JSSW-LA對豚鼠氣單胞菌的拮抗作用更強；培養至中后期，隨著JSSW-LA活性降低，對豚鼠氣單胞菌的拮抗作用減弱，豚鼠氣單胞菌快速增長。

2.4.5 解淀粉芽孢桿菌JSSW-LA與溫和氣單胞菌的共培養 由圖6可看出，JSSW-LA對溫和氣單胞菌的生長具有拮抗作用。單獨培養的溫和氣單胞菌在48 h內菌濃度由 6.6×106 CFU/mL 上升至1.9×109 CFU/mL；而在與解淀粉芽孢桿菌JSSW-LA的共培養過程中，無論JSSW-LA的起始濃度是2.8×103 CFU/mL還是2.8×106 CFU/mL，溫和氣單胞菌的生長量在JSSW-LA進入對數期后均明顯降低，至48.0 h時，溫和氣單胞菌的濃度分別為0.3萬、1.1萬CFU/mL，明顯低于單獨培養的菌濃度1.9×109 CFU/mL。因此可見，JSSW-LA對溫和氣單胞菌具有很強的拮抗作用。

4 小結與討論

解淀粉芽孢桿菌是一種好氧產芽孢的革蘭氏陽性桿狀細菌，與枯草芽孢桿菌具有很高的親緣性。該菌在自然界分布廣泛，對人畜無毒無害，不污染環境，生長快，穩定性好，并且其代謝產物較為豐富，如表面活性肽、伊枯草菌素等[7]，具有廣譜抗菌活性和較強的抗逆能力，對多種病原菌、真菌、有害藻類、線蟲等具有良好的抑制作用，是動植物病害生物防控的有效“武器”。本試驗通過對分離篩選得到的菌株JSSW-LA的生理生化測試顯示，該菌株的明膠水解、淀粉水解和硝酸鹽還原均為陽性，能夠利用甘露醇、葡萄糖等，這些都與陳成等分離到的解淀粉芽孢桿菌性質[8-9]一致。由于細菌16S rRNA基因序列具有高度保守性，其核酸片段長度適宜，16S rRNA序列分析作為微生物分類系統的主要依據已經得到了廣泛認同[10]。本研究為進一步確定菌株的分類學地位，在細菌學鑒定的基礎上測定了分離菌株16S rRNA序列，并進行系統進化樹的構建和同源性分析。通過序列比對、發育樹的構建，鑒定JSSW-LA為解淀粉芽孢桿菌。

目前，對拮抗菌的篩選通常采用體外的試驗方法，其中紙片法是常用的方法之一。指示菌為致病菌，指標是待測菌能夠在瓊脂培養基上對指示菌產生抑制效果[11]。因此，本試驗選用紙片法對分離到的解淀粉芽孢桿菌JSSW-LA進行7種致病菌體外抑菌試驗，解淀粉芽孢桿菌JSSW-LA對嗜水氣單胞菌、溫和氣單胞菌、維氏氣單胞菌、豚鼠氣單胞菌、鰻利斯頓氏菌這5種致病菌具有一定的抑制作用，其中對溫和氣單胞菌和豚鼠氣單胞菌抑制效果明顯。

根據微生物生態學原理，將拮抗菌與病原菌共培養，以活菌數或抑菌圈作為評價指標來篩選候選菌是目前采用較多的方法。目前，針對解淀粉芽孢桿菌對水產常見病原菌拮抗作用方面的研究較少，并且多集中于解淀粉芽孢桿菌對嗜水氣單胞菌拮抗作用的研究。曹海鵬等從養殖池污泥中分離篩選了1株優良的鱘源嗜水氣單胞菌拮抗菌解淀粉芽孢桿菌G1，其對鱘源嗜水氣單胞菌S1產生的抑菌圈直徑為 18.50 mm[6]。劉亞楠在體外通過對抑菌譜及在共培養條件下對致病性團頭魴源嗜水氣單胞菌抑菌效果的測定，經鑒定為解淀粉芽孢桿菌的S18、S24、F4對嗜水氣單胞菌抑菌效果明顯[12]。本試驗分離鑒定得到的JSSW-LA解淀粉芽孢桿菌通過與水產致病菌的共培養，顯示出較強的廣譜抗菌性能，其中低起始濃度的JSSW-LA（2.8×103 CFU/mL）能夠顯著抑制溫和氣單胞菌、豚鼠氣單胞菌的生長，高起始濃度的JSSW-LA（2.8×106 CFU/mL）對5種致病菌均具有一定的抑制作用。共凝集是具有特定遺傳性狀的細菌之間通過特殊分子黏附起來的過程，是復雜生物膜發育的關鍵機制，作為一個特異性較強的過程，共凝集在多樣生物膜系統的發展和維持中起著重要的生態學角色，益生菌與病原菌之間的共凝集被認為是排除病原菌的一種方法[13]。JSSW-LA表現出良好

的拮抗性能與其和致病菌具有良好的凝集率有關，由結果分析可知，JSSW-LA與溫和氣單胞菌、豚鼠氣單胞菌的凝集率要高于JSSW-LA與嗜水氣單胞菌、維氏氣單胞菌、愛德華氏菌的凝集率。

參考文獻：

[1]曾子丹，姚朔影. 益生菌的研究前景及國內外發展狀況[J]. 食品工業科技，2007，28（8）：251-254.

[2] Goddard S. Feed management in intensive aquaculture[J]. American Journal of Roentgenology Radium Therapy & Nuclear Medicine，1996，149（2）：159-179.

[3]權春善，王軍華，徐洪濤，等. 一株抗真菌解淀粉芽孢桿菌的分離鑒定及其發酵條件的初步研究[J]. 微生物學報，2006，46（1）：7-12.

[4]布坎南 R E，吉本斯 N E. 伯杰氏細菌鑒定手冊[M]. 中國科學院微生物研究所，譯. 8版. 北京：科學出版社，1984：751-767.

[5]東秀珠，蔡妙英. 常見細菌系統鑒定手冊[M]. 2版.北京：科學出版社，2001：364-398.

[6]曹海鵬，何 珊，劉麗玲，等. 鱘源病原性嗜水氣單胞菌拮抗芽孢桿菌的鑒定及其生物學特性[J]. 微生物學通報，2011，38（9）：1377-1384.

[7]Ongena M，Jacques P. Bacillus lipopeptides：versatile weapons for plant disease biocontrol[J]. Trends in Microbiology，2008，16（3）：115-125.

[8]陳 成，崔堂兵，于平儒. 一株抗真菌的解淀粉芽孢桿菌的鑒定及其抗菌性研究[J]. 現代食品科技，2011，27（1）：36-39.

[9]王德培，孟 慧，管敘龍，等. 解淀粉芽孢桿菌BI2的鑒定及其對黃曲霉的抑制作用[J]. 天津科技大學學報，2010，25（6）：5-9.

[10]Kim M S，Jeong H D. Development of 16S rRNA targeted PCR methods for the detection and differentiation of Vibrio vulnificus in Marine environments[J]. Aquaculture，2001，193（3/4）：199-211.

[11]Kesarcodi-Watson A，Kaspar H，Lategan M J，et al. Probiotics in aquaculture：the need，principles and mechanisms of action and screening processes[J]. Aquaculture，2008，274（1）：1-14.

[12]劉亞楠. 團頭魴源嗜水氣單胞菌拮抗菌的篩選及拮抗特性研究[D]. 南京：南京農業大學，2013.

[13]Gordon A S，Millero F J. Electrolyte effects on attachment of an estuarine bacterium[J]. Applied and Environmental Microbiology，1984，47（3）：495-499.邢文會，付瑞敏，王 丁，等. 微生物發酵甘薯渣產蛋白飼料的工藝優化及對育肥豬生產性能的影響[J]. 江蘇農業科學，2016，44（4）：279-284.