適合銀杏葉發(fā)酵的菌株篩選及發(fā)酵效果

林標(biāo)聲+吳江文+江火香+戴愛(ài)玲+楊小燕

摘要：研究了適合銀杏葉發(fā)酵的菌株及其發(fā)酵效果。結(jié)果表明，銀杏葉添加濃度為40%～50%時(shí)，地衣芽孢桿菌、嗜熱乳桿菌、產(chǎn)朊假絲酵母適合用于銀杏葉發(fā)酵，其最佳的比例混合為2 ∶1 ∶1，最優(yōu)的發(fā)酵工藝條件為接種量5%，含水量50%、發(fā)酵時(shí)間15 d，發(fā)酵溫度30 ℃，與發(fā)酵前物料相比，發(fā)酵后銀杏葉制劑菌株大量生長(zhǎng)，產(chǎn)生乳酸，粗蛋白、氨基酸含量顯著上升，提高了產(chǎn)品的益生菌含量、適口性及營(yíng)養(yǎng)成分。

關(guān)鍵詞：銀杏葉；發(fā)酵菌株；篩選；地衣芽孢桿菌；嗜熱乳桿菌；產(chǎn)朊假絲酵母

中圖分類號(hào)： S182

文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2016）04-0315-03

銀杏（Ginkgo biloba L.）是世界上最古老的孑遺植物，為中國(guó)特有珍稀樹(shù)種，分布廣泛，資源豐富。銀杏的藥用價(jià)值主要體現(xiàn)在葉和果實(shí)上，我國(guó)宋朝時(shí)民間就使用銀杏葉治療哮喘和支氣管炎[1]等疾病。自20世紀(jì)60年代起，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)銀杏葉的化學(xué)成分、藥理作用、藥物功效等進(jìn)行了大量的相關(guān)研究，結(jié)果表明，銀杏葉化學(xué)成分復(fù)雜，種類較多，許多成分具有重要的生理功能及活性[2]。到目前為止，從銀杏葉中分離出的化學(xué)活性成分有160余種，包括銀杏黃酮類、有機(jī)酸類、萜內(nèi)酯類、烷基酚酸類、銀杏酚類、醇類及甾類等[3]。銀杏葉的食用安全性也較高，目前，以銀杏葉及提取物為原料的藥物和保健食品等已經(jīng)大量上市。特別是近年來(lái)銀杏葉作為飼料添加劑，在畜禽飼養(yǎng)方面有了一定的運(yùn)用，能起到促進(jìn)畜禽腸胃吸收、促生長(zhǎng)、增強(qiáng)免疫力等功效，其作為一種新型飼料添加劑在畜牧業(yè)中具有廣闊的開(kāi)發(fā)應(yīng)用前景[4-5]。銀杏葉的相關(guān)開(kāi)發(fā)，主要以銀杏葉提取物為主，但銀杏葉提取物的傳統(tǒng)溶劑浸提法既造成了大量有效成分的損失，也無(wú)法保證產(chǎn)品的純天然性[6]。而利用微生物發(fā)酵銀杏葉制成微生物發(fā)酵劑，既克服了傳統(tǒng)方法的缺點(diǎn)，又使銀杏葉功效成分得到更好的直接釋放[7]。從國(guó)內(nèi)外資料調(diào)查可知，銀杏葉在畜牧業(yè)上的應(yīng)用還很少，特別是將銀杏葉微生物發(fā)酵劑開(kāi)發(fā)及作為飼料添加劑在生豬中的應(yīng)用還未見(jiàn)報(bào)道，可能是銀杏葉制劑的相關(guān)成分對(duì)微生物有一定的抑制作用，限制了銀杏葉發(fā)酵制劑的研制與開(kāi)發(fā)[8-9]。因此，本研究以銀杏葉為發(fā)酵基質(zhì)，通過(guò)篩選適合銀杏葉發(fā)酵的優(yōu)良菌株，優(yōu)化其配伍組合，考察其發(fā)酵效果，為將來(lái)進(jìn)一步開(kāi)發(fā)出操作易行、裝置簡(jiǎn)易且成本低廉、營(yíng)養(yǎng)豐富、適口性好的銀杏葉發(fā)酵制劑產(chǎn)品提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

銀杏葉購(gòu)自市場(chǎng)，在60 ℃烘干后粉碎，過(guò)20目篩備用，裝入自封袋密封保存。

初始菌株來(lái)源：市場(chǎng)購(gòu)買(mǎi)的各畜用復(fù)合微生物發(fā)酵劑凍干菌粉（包括酵母菌，雙歧桿菌、嗜熱乳桿菌，枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌等），各有效菌活性乳酸菌含量≥20億/g。

1.2 方法

1.2.1 銀杏葉發(fā)酵的整體工藝流程

1.2.2 銀杏葉發(fā)酵發(fā)酵菌株的篩選 銀杏葉發(fā)酵液與發(fā)酵菌株培養(yǎng)基的配制：將銀杏葉粉碎后，過(guò)篩40～50目，短時(shí)瞬間高溫蒸煮，配制出濃度為300～600 mg/mL溶液加入到適合各菌生長(zhǎng)的培養(yǎng)基中，作為篩選培養(yǎng)基。

分別取1 g復(fù)合菌劑于9 mL無(wú)菌水中，振蕩15 ～20 min 后，適當(dāng)稀釋。分別取0.1 ～0.2 mL稀釋液于篩選培養(yǎng)基中，酵母菌采用YPD培養(yǎng)基，乳酸菌采用MRS培養(yǎng)基，芽孢桿菌采用菌液60 ℃加熱15～20 min 后涂布于LB培養(yǎng)基中。培養(yǎng)觀察不同濃度銀杏葉條件下各菌長(zhǎng)勢(shì)，挑選生長(zhǎng)旺盛、形態(tài)完整的菌株作為選定菌株。經(jīng)形態(tài)、顯微、生理生化鑒定，最終確定適合銀杏葉發(fā)酵的微生物菌株類型及屬性。

1.2.3 發(fā)酵菌株最適合菌株配比、接種量的篩選 將所篩選的各菌均培養(yǎng)至10億～100億個(gè)/mL，各均按設(shè)定的比例取量混合，總菌量再按物料總量4%～5%的比例接入到35～37 ℃ 溫水中攪拌、活化20～30 min，溫水中含總發(fā)酵物料 80～100 mg/mL 紅糖。菌株活化后，與銀杏葉450～480 mg/mL、硫酸銨40～50 mg/mL、維生素C 1～2 mg/mL，硫酸鉀 1～2 mg/mL混合均勻，并補(bǔ)充水分至450 mg/mL，用裝量1～2 kg呼吸膜包裝、密封，常溫（25 ℃）生料發(fā)酵12 d，發(fā)酵后檢測(cè)各項(xiàng)指標(biāo)，選定最合適的菌株組合比例。各菌比例及接種量按表L827正交試驗(yàn)表安排進(jìn)行。

1.2.4 銀杏葉發(fā)酵工藝條件的優(yōu)化 將所篩選的各菌均培養(yǎng)至10億～100億個(gè)/mL，按照選定的最優(yōu)組合的發(fā)酵菌株比例及接種量加入35～37 ℃溫水?dāng)嚢琛⒒罨?0～30min，溫水中含總發(fā)酵物料80～100 mg/mL紅糖。菌株活化后，與銀杏葉450～480 mg/mL、硫酸銨40～50 mg/mL，維生素C 1～2 mg/mL，硫酸鉀1～2 mg/mL混合均勻，并補(bǔ)充水分至400～500 mg/mL，用裝量1～2 kg呼吸膜包裝、密封，常溫（20～35 ℃）生料發(fā)酵10～15 d。發(fā)酵物料含水量、發(fā)酵溫度及發(fā)酵時(shí)間是銀杏葉發(fā)酵效果的重要因素，試驗(yàn)采用L934正交表進(jìn)行優(yōu)化試驗(yàn)。

1.2.5 銀杏葉發(fā)酵效果的評(píng)價(jià) 在選定的最優(yōu)工藝條件下發(fā)酵銀杏葉，對(duì)其進(jìn)行感官評(píng)定及營(yíng)養(yǎng)分析，并與發(fā)酵前物料成分進(jìn)行對(duì)比分析，分析銀杏葉發(fā)酵后各指標(biāo)的變化情況。

1.2.6 測(cè)定分析方法 pH值采用上海雷磁儀器廠生產(chǎn)的PHS-25型酸度計(jì)測(cè)定；乳酸含量采用南京建成乳酸檢測(cè)試劑盒測(cè)定；纖維采用酸堿消煮法測(cè)定；黃酮采用蕓香苷比色法測(cè)定；蛋白凱氏定氮法測(cè)定；總氨基含量采用 S433D 全自動(dòng)氨基酸測(cè)定。各檢測(cè)方法參照國(guó)家飼料檢測(cè)分析標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行[10]。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵菌株的篩選及鑒定

不同濃度銀杏葉條件下，所接各菌的長(zhǎng)勢(shì)情況見(jiàn)表1，結(jié)果表明，不同類型的培養(yǎng)基中，銀杏葉濃度越高，其對(duì)菌株的抑制作用越強(qiáng)。為了充分利用銀杏葉中的營(yíng)養(yǎng)成分，綜合考慮選定銀杏葉添加濃度40%～50%時(shí)，并從中篩選生長(zhǎng)旺盛、長(zhǎng)勢(shì)良好、形態(tài)結(jié)構(gòu)完整的菌落進(jìn)行擴(kuò)培、鑒定[11]，結(jié)果見(jiàn)表2，選定的菌株鑒定為地衣芽孢桿菌、嗜熱乳桿菌、產(chǎn)朊假絲酵母。

2.2 發(fā)酵菌株最適合菌株配比、接種量

發(fā)酵菌株最適合菌株配比、接種量的試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。結(jié)果表明，地衣芽孢桿菌生長(zhǎng)最為旺盛，生長(zhǎng)快，當(dāng)其比例多時(shí)，微生物總菌數(shù)也多。當(dāng)微生物總菌數(shù)高時(shí)，各菌聯(lián)合作用，銀杏葉基質(zhì)利用較多，所得蛋白含量、產(chǎn)生的乳酸含量也較高，為了便于提高工作效率，選定總菌數(shù)為篩選指標(biāo)參考依據(jù)，按正交試驗(yàn)結(jié)果，選定的最優(yōu)組合為A2B1C1D2，即地衣芽孢桿菌 ∶嗜熱乳桿菌 ∶產(chǎn)朊假絲酵母=2 ∶1 ∶1，接種量5%，此條件下各菌生長(zhǎng)旺盛，乳酸含量較多，粗蛋白和多肽含量也較高。

2.3 發(fā)酵工藝條件的優(yōu)化

銀杏葉發(fā)酵工藝條件的優(yōu)化結(jié)果見(jiàn)表4、表5，結(jié)果表明，最佳的制備工藝條件為A3B3C2，即含水量50%、發(fā)酵時(shí)間 15 d、發(fā)酵溫度30 ℃，其中發(fā)酵物料含水量對(duì)發(fā)酵過(guò)程影響最大，達(dá)到極顯著水平。

2.4 銀杏葉發(fā)酵效果評(píng)價(jià)

銀杏葉發(fā)酵后與發(fā)酵前的營(yíng)養(yǎng)成分進(jìn)行對(duì)比分析，結(jié)果見(jiàn)表6。結(jié)果表明，發(fā)酵后復(fù)合菌株大量生長(zhǎng)，嗜熱乳桿菌產(chǎn)生了乳酸的香味，并且地衣芽孢桿菌、產(chǎn)朊假絲酵母將銀杏葉中的纖維、黃酮分解，使其發(fā)酵物質(zhì)中的粗蛋白、氨基酸含量顯著上升，提高了產(chǎn)品的益生菌含量、適口性及營(yíng)養(yǎng)成分。

3 結(jié)論與討論

通過(guò)含不同濃度銀杏葉的篩選培養(yǎng)基得到適合銀杏葉發(fā)酵的微生物菌株，通過(guò)鑒定確認(rèn)為地衣芽孢桿菌、嗜熱乳桿菌、產(chǎn)朊假絲酵母，并通過(guò)正交試驗(yàn)，優(yōu)化得到了適合銀杏葉發(fā)酵的最佳工藝條件為：地衣芽孢桿菌、嗜熱乳桿菌、產(chǎn)朊假絲酵母以2 ∶1 ∶1比例混合，接種量按總發(fā)酵物料5%接種，含水量50%、發(fā)酵時(shí)間15 d，發(fā)酵溫度30 ℃，與發(fā)酵前物料相比，發(fā)酵后復(fù)合菌株大量生長(zhǎng)，嗜熱乳桿菌產(chǎn)生了乳酸的香味，并且地衣芽孢桿菌、產(chǎn)朊假絲酵母將銀杏葉中的纖維、黃酮分解，使其發(fā)酵物質(zhì)中的粗蛋白、氨基酸含量顯著上升，提高了產(chǎn)品的益生菌含量、適口性及營(yíng)養(yǎng)成分。

銀杏葉發(fā)酵制劑的研制國(guó)內(nèi)報(bào)道較少，本研究采用多菌聯(lián)合發(fā)酵銀杏葉是一個(gè)開(kāi)創(chuàng)性的工作，各益生菌相互作用，對(duì)銀杏葉中的基質(zhì)能更好地利用，所得營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)更為豐富，這對(duì)銀杏葉制劑的推廣應(yīng)用具有更好的現(xiàn)實(shí)作用[12-13]。而對(duì)銀杏葉發(fā)酵制劑產(chǎn)品的實(shí)際開(kāi)發(fā)、使用對(duì)象、使用效果等有待于進(jìn)一步研究闡明。

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