市售洋槐蜜多酚類成分及其抗氧化活性研究

孫春麗+王紫燕+李春陽+張紅城

摘要：收集了在全國范圍內銷售的15種洋槐蜜樣品，通過HPLC-DAD對蜂蜜樣品多酚類成分進行分析，測定了總酚酸和總黃酮含量，以及蜂蜜清除DPPH自由基、ABTS+自由基、超氧自由基的能力和還原力。結果表明，市售洋槐蜜質量參差不齊，總酚酸含量從3.7 mg/g到23.3 mg/g；總黃酮含量從2.2 mg/kg到12.9 mg/kg。15種商品洋槐蜜均具有一定的抗氧化活性。此外，在15種商品洋槐蜜中只有4個種樣品具有蜂蜜來源純正、成分齊全的特點，是品質好的洋槐蜂蜜。

關鍵詞：洋槐蜜；多酚類成分；抗氧化；黃酮；酚酸；質量監控依據

中圖分類號： S896.1

文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2016）04-0321-07

蜂蜜是蜜蜂將采集的植物花蜜，混以蜜蜂唾液腺的分泌物，經過充分釀造而貯藏在巢脾內的甜物質。其中糖類成分占70%以上，水分占16%～25%，蛋白質平均含量為 0.16%[1]。蜂蜜不僅是一種營養價值高的保健食品，而且具有多種生物學活性，如抗氧化、解毒、消炎[2]、抗癌[3]、保護創面、促進細胞再生[4]等。一些研究證明，多酚類物質（如酚酸和黃酮）具有強的抗氧化能力[5]。蜂蜜中含有豐富的多酚類成分，這些成分不僅具有很強的抗氧化活性，而且具有多種生物活性。因此本研究收集了市售15種洋槐蜜樣品，對其中的多酚類成分及其抗氧化活性進行分析，為洋槐蜜產品的質量監控提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 樣品 收集在商場及專賣店銷售的15種洋槐蜜樣品，品牌種類用A、B、C、…、O代替，其詳細信息如表1所示。

1.1.2 試驗試劑 4-二羥基苯甲醛酸，香草酸，咖啡酸，p-香豆酸，阿魏酸，異阿魏酸，苯甲酸，3，4-二甲氧基肉桂酸，肉桂酸，脫落酸，咖啡酸苯乙酯，短葉松素，山奈酚，山姜素，松屬素，柯因，高良姜素，蕓香苷，來自Sigma 公司；咖啡酸芐酯來自 Funakoshi 公司；短葉松素-3-乙酸酯來自BioBioPha公司；5-甲氧基短葉松素是筆者所在實驗室從蜂膠中收集獲得。1，1-二苯基-2-苦基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH），2，2-azinobis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonicacids）（ABTS），6-Hydroxy-2，5，7，8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid（Trolox），熒光素鈉（sodium fluorescein），2，2，-azobis（2-amidinopropane）dihydrochloride （ABAP），來自Sigma公司。

1.1.3 主要儀器與設備 LC-6AD高效液相色譜儀[配有二極管陣列紫外檢測器（PDA）、SIL-自動進樣器、CTO-10A柱溫箱、LCsolution數據處理系統]，日本島津公司生產；SynergyTM HT型多功能酶標儀，美國Bio-tek公司生產；24孔固相萃取裝置，美國Supelco公司生產；固相萃取小柱Strata-X-A （60 mg/3 mL），美國菲羅門公司生產；恒溫水浴氮吹儀，北京科林工貿有限公司生產。

1.2 方法

1.2.1 蜂蜜中多酚類成分的提取[6] 準確稱取20 g洋槐蜜樣品，蒸餾水5倍稀釋，玻璃棒攪拌至蜂蜜完全溶解。8 000×g離心10 min除去固體不溶物，取上清液倒入提前處理好的Strata-X-A固相小柱。上樣結束后，用3 mL超純水（pH值7）清洗，后用5 mL甲酸-甲醇（5 ∶95，V/V）溶解洗脫，收集洗脫液。將洗脫液在45 ℃恒溫水浴氮吹儀中干燥，用 2 mL 色譜級乙酸甲醇（2 ∶98，V/V）溶解。

1.2.2 蜂蜜提取物中總酚酸含量的測定[7] 采用Folin-Ciocalteu法，以沒食子酸作為對照建立總酚酸含量標準曲線，吸取150 μL蜂蜜提取液，以沒食子酸相對含量表示。

1.2.3 蜂蜜提取物中總黃酮含量的測定[7] 采用AICI3 法，以蕓香苷作為對照建立總黃酮標準曲線，吸取1 mL蜂蜜提取物溶液，以蕓香苷的相對含量表示。

1.2.4 ABTS+自由基清除能力測定[8] 吸取200 μL不同濃度Trolox，加入3 mL ABTS+溶液，震蕩30 s，靜置6 min后，在734 nm處測定吸光度。蜂蜜樣品稀釋為不同濃度，測定方法與Trolox一致。清除率按照如下公式計算：ABTS+自由基清除率=（D0-D）/D0×100%。式中：D0表示空白試劑吸光度，D表示樣品溶液吸光度。

1.2.5 DPPH自由基清除能力測定[9] 取1 mL不同濃度的蜂蜜溶液，加入4 mL 0.2 mol/L DPPH乙醇溶液，避光靜置 30 min，于波長517 nm處測定吸光度，計算不同蜂蜜樣品對DPPH自由基的清除率。DPPH自由基清除率=（D0-D）/D0×100%。式中：D0表示空白試劑吸光度，D表示樣品溶液吸光度。

1.2.6 還原力測定[10] 取200 μL稀釋成不同濃度的蜂蜜溶液，依次加入0.2 mol/L、pH值6.6 磷酸鹽緩沖液2.5 mL，1%鐵氰化鉀2.5 mL，50 ℃水浴20 min，加入10%三氯乙酸 1 mL，取上清液2.5 mL，加入蒸餾水5 mL，0.1% 三氯化鐵 0.5 mL 混勻，在700 nm下測定吸光度。

1.2.7 過氧陰離子清除能力（ORAC法）[11] 吸取20 μL的稀釋后的樣品液至96孔板，加入150 μL 0.081 6 μmol/L熒光素（FL）溶液，覆膜，37 ℃孵育10 min。加入30 μL 153 mmol/L ABAP啟動反應。酶標儀測定條件為：激發波長485 nm，發射波長528 nm，每分鐘測定1次，測定50 min。ORAC值采用美國農業部的單位，即μmol Trolox當量/100 g 樣品。抗氧化能力（antioxidant capacity）=AUCantioxidant-AUCblank。面積差代入Trolox標準曲線即得Trolox當量。

1.2.8 HPLC色譜條件 HPLC條件為Shim-Pack PREP-ODS （250×4.6 mm，5 μm）色譜柱；柱溫箱溫度35 ℃；檢測波長280 nm；進樣量20 μL；流動相：B相為甲醇（2% 乙酸），A相為水（2% 乙酸）；梯度洗脫程序如下：0～30 min，9%～12% B；30～80 min，22%～40% B；80～130 min，40%～ 65% B；130～150 min，65%～80% B；流速為0.7 mL/min。

1.2.9 數據處理 使用SAS 9.1軟件，鄧肯法對數據進行方差分析[12]。采用克拉默（Kramer）檢驗法來評價蜂蜜的綜合抗氧化能力[13]。

2 結果與分析

2.1 15種蜂蜜總酚酸和總黃酮含量的測定

國內外對于蜂蜜的化學組成研究報道較多[14]，主要是針對不同種類的單花蜜，而對于目前市售蜂蜜研究相對較少。本試驗選取15種市售洋槐蜜作為試驗材料，對其總酚酸、總黃酮含量進行了測定，從表2中可以看出，各品牌的洋槐蜜總酚酸和總黃酮含量具有一定的差異。品牌F的酚酸含量最低僅為3.7 mg/kg，品牌J酚酸含量最高為23.3 mg/kg，約是品牌F的7倍。根據酚酸含量之間的差異性可以將15個樣品分為3組，第1組酚酸含量均大于14.0 mg/kg，主要包括樣品B、E、J、K、L；第2組酚酸含量范圍為11.1～ 14.0 mg/kg，主要包括樣品A、C、H、M；第3組酚酸含量偏低，均小于 10.0 mg/kg，包括樣品D、F、G、I、N、O。

此外，不同品牌洋槐蜜黃酮含量也表現出顯著的差異。品牌F含量僅為2.2 mg/kg，品牌J黃酮含量為 12.9 mg/kg，約為品牌F的6倍。根據黃酮含量之間的差異性，將15個樣品分為3組，第1組黃酮含量均大于 7.0 mg/kg，主要包括A、B、C、J、K、L；第2組黃酮含量范圍為5.0～7.0 mg/kg，包括D、E、G、M、N；第3組黃酮含量偏低，均小于5.0 mg/kg，包括F、H、I、O。除去樣品C、D、G、N，各樣品黃酮含量與酚酸含量之間都具有一定的相關性，且不同組別之間差異顯著（P<0.05）。這說明同一樣品蜂蜜總酚酸和總黃酮含量之間具有一定的正相關關系，但是同一品種的蜂蜜總酚酸和總黃酮含量因地域不同存在一定的區別。

2.2 15種蜂蜜抗氧化活性的測定結果分析

2.2.1 ABTS+自由基清除能力 Trolox作為陽性對照，以不同濃度樣品清除ABTS+自由基的能力計算IC50，由試驗結果可知，清除率隨著濃度升高而增加，從15種蜂蜜清除ABTS+自由基IC50值（表2）可以看出樣品G清除ABTS+自由基能力最強，IC50值為（349.48 ± 51.31） mg/mL，樣品B的IC50值為（1 018.81 ± 15.96） mg/mL，是15種洋槐蜜中清除ABTS+自由基能力最弱的，兩者相差2倍。15個品牌洋槐蜜清除ABTS+自由基能力由大到小依次為G>O>D>F>A>J>N>I>K>L>H>M>E>C>B。

2.2.2 DPPH 自由基清除能力 由表2可知，15種樣品對DPPH自由基均具有不同程度的清除能力。總酚酸和總黃酮含量較高的J樣品和D樣品具有較高的清除自由基的能力，IC50值分別為（336.67 ± 3.64）、（366.44 ± 27.92） mg/mL；樣品H清除自由基的能力最弱，IC50值為 975.72 mg/mL。這表明同一品種蜂蜜地域不同，抗氧化能力也存在差異。

2.2.3 還原力的測定 還原力的測定是評價樣品是否具有良好的電子供應能力，還原力強的樣品為良好的電子供應者，同時還原力越強，表示抗氧化性越強[15]。由試驗結果可知，15種洋槐蜜均具有還原力，可作為電子供應者，與自由基反應，轉化為更為穩定的物質。

由表2可得，品牌J的還原能力最強，每100 g 蜂蜜相當于（73.28±2.80） mg Trolox；品牌N還原力最弱，每100 g蜂蜜僅相當于（35.96±1.70） mg Trolox，僅為品牌C的49%。15個品牌洋槐蜜還原力存在一定的差異。15個品牌洋槐蜜還原力由大到小依次為J>C>E>F>K>A>L>M>D>B>G>I>O>H>N。

2.2.4 過氧陰離子清除能力（ORAC法） 氧化自由基吸收能力測定法 （oxygen radical absorbance capacity，ORAC），與其他抗氧化能力分析方法相比，具有顯著的優點。美國農業部2007年、2010年公布的一系列食品的抗氧化能力都是采用ORAC法測定的[16-17]。由表2可知，不同品牌洋槐蜜都有明顯的抗氧化性。其中樣品J抗氧化能力最強，ORAC值為 57.67 μmol Trolox/100 g，且與其他各品牌ORAC數值之間差異顯著（P<0.05）；品牌I的抗氧化性最弱，ORAC值為 23.75 μmol Trolox/100 g，與其他品牌之間也差異顯著（P<005）。品牌A、E、F、J、K具有相對較強的抗氧化性，ORAC值均大于45.00 μmol Trolox/100 g，且這5個品牌之間差異顯著（P<0.05）。

2.2.5 15種洋槐蜜綜合抗氧化性能 綜合上述4種抗氧化能力，采用克拉默（Kramer）檢驗法[13]，對15種不同品牌洋槐蜜的綜合抗氧化性能進行評價，結果如表3所示。查克拉默順序檢驗表：n=4，m=15，上段數據a～b=10～54，因為max Qi=54，min Qi=10，所以對置信度α=5%，15種洋槐蜜之間差異不顯著。

查克拉默順序檢驗表：n=4，m=15，下段數據c～d= 18～46，對于品牌J和品牌K，Qi=10，17 < 18，所以對置信度α=5%，品牌J、K與其他品牌洋槐蜜之間差異顯著；品牌H、I的Qi > 46，所以對置信度α=5%，品牌H、I與其他品牌洋槐蜜之間差異顯著。

這說明品牌J、K洋槐蜜綜合抗氧化性能最強，品牌H、I洋槐蜜綜合抗氧化性能最弱。15種洋槐蜜綜合抗氧化性能由大到小依次為J>K>A>F>E>L>G>M>C>N>D>O>B>H>I。

2.3 15種蜂蜜提取物中多酚類成分

通過標準品建立標準曲線，對不同品牌蜂蜜提取物的成分進行定性定量分析，標準品的結果見圖1。

根據不同品牌洋槐蜜中多酚類成分種類以及特征性成分含量，可以將15個蜂蜜樣品分為3組。第1組樣品多酚類成分齊全，含有9～16個活性成分，包括A、B、C、D 4個品牌（表4、圖2）。該組樣品提取物中主要包括咖啡酸、p-香豆酸、3，4-二甲氧基肉桂酸、脫落酸和丁香酸甲酯等成分。據文獻報道，脫落酸因其在洋槐蜜中廣泛存在而可以作為原料洋槐蜜的標志性成分[18-20]。此外，高含量的丁香酸甲酯被認為是油菜蜜的典型特征[21]。根據該組樣品中丁香酸甲酯與脫落酸含量的比值小于0.5的特征，以及與原料洋槐蜜中多酚類成分的比較[22-23]等，可以斷定該組樣品洋槐蜜來源純正、純度好、品質高，初步認為是品質好的洋槐蜜。

第2組中包括E、F、G、H、I 5個品牌，含有10～17個多酚類成分，該組樣品丁香酸甲酯與脫落酸的含量比值相對第1牌洋槐蜜中該成分峰值低（圖3）。綜上所述，該組洋槐蜜產品多酚類化合物種類齊全，丁香酸甲酯與脫落酸含量比值相對第1組有稍微升高，因此，這5個品牌的樣品屬于一般品質洋槐蜜。

第3組樣品包含J、K、L、M、N、O 6個品牌，多酚類成分種類存在一定差異，例如品牌L中鑒定出14種多酚類成分，而品牌O中僅鑒定出4種成分。丁香酸甲酯含量對比前2組樣品明顯升高，平均含量為2 726.0 μg/kg，是第1組樣品平均含量的7倍。此外，脫落酸平均含量也僅為第1組含量的1/3，品牌O中未鑒定到脫落酸（表4、圖4）。除去品牌O，該組丁香酸甲酯與脫落酸的含量比值范圍為2.47～131.91。

J、K、L、M中多酚類成分與原料蜜[19-20，23]相比，種類差距不大，主要含有香草酸、咖啡酸、p-香豆酸、3，4-二甲氧基肉桂酸、脫落酸和丁香酸甲酯。根據文獻報道，脫落酸是洋槐蜜的標志性成分[18-20]，丁香酸甲酯是油菜蜜的典型特征[21]，這4個樣品脫落酸含量低，丁香酸甲酯含量高，兩者比值范圍為2.47～7.42，因此推斷這些洋槐蜜樣品可能是添加油菜蜜。此外，樣品N、O中分別僅鑒定出4種和6種化合物，且品牌N中丁香酸甲酯與脫落酸含量比值高達131.9，因此可推斷其原料蜜可能是油菜蜜為主的蜂蜜。

3 結論

根據克拉默（Kramer）檢驗法，15種商品洋槐蜜中，品牌J和K綜合抗氧化性能最強，品牌H和I綜合抗氧化性能最弱。15種洋槐蜜綜合抗氧化性能由大到小依次為J>K>A>F>E>L>G>M>C>N>D>O>B>H>I。通過HPLC-DAD對其多酚類成分分析表明，15種商品洋槐蜜中只有4個品牌樣品具有蜂蜜來源純正、成分齊全特點，是高品質蜂蜜；有5個品牌屬于中等品質洋槐蜜；另外有6個樣品可能添加了油菜蜜。

總之，按照多種方法綜合鑒定蜂蜜方法，根據原料蜜中主要多酚類成分的組成比值范圍，可以更好地評價蜂蜜產品的質量，控制蜂蜜產品中有效成分，保持其質量穩定，維護了消費者的利益。

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