3種單花蜜總黃酮含量測定的比較

薛茗閣+卜翠萍+趙祥祥+紀麗蓮

摘要：采用酶標儀微量法，以蘆丁為對照品對市售不同品牌的3種單花蜜（棗花蜜、紫云英蜜、洋槐蜜）總黃酮含量進行測定比較。結果表明，3種單花蜜均含有黃酮類化合物，且不同單花蜜間總黃酮含量存在顯著性差異，其中棗花蜜的總黃酮含量最高（1.72 mg/100 g），紫云英蜜次之（1.26 mg/100 g），洋槐蜜含量最低（1.11 mg/100 g）；不同品牌瓶裝單花蜜間總黃酮含量不同，品牌2的3種單花蜜總黃酮含量均低于品牌1和品牌3。因此，蜂蜜中總黃酮含量可作為不同單花蜜品質評價的標準之一；酶標儀微量法具有簡便、準確等優點，可廣泛應用于蜂蜜及相關產品的快速檢測。

關鍵詞：蜂蜜；總黃酮；酶標儀微量法

中圖分類號： S896.1

文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2016）04-0341-02

蜂蜜是蜜蜂采集植物的花蜜、分泌物或蜜露，與自身分泌物混合后，經充分釀造而成的天然甜物質[1]。根據蜜源植物不同，分為單花蜜和雜花蜜。《本草綱目》中將蜂蜜的藥用功效描述為清熱、補中、解毒、潤燥、止痛[2]。現代醫學也證明蜂蜜具有增強免疫力，治療胃腸道疾病、呼吸道疾病、心臟病和不同炎癥的療效[3]。黃酮類化合物是蜂蜜中主要的有效成分之一，主要來自植物花蜜、花粉和蜂膠，以配基和糖苷形式存在[4]。由于其對人體內自由基有明顯的清除作用，并可抑制細胞的凋亡，常是治療心血管疾病藥物的主要成分。不同的單花蜜中黃酮類化合物種類和含量差別很大，而同種單花蜜中產地不同含量也可能相差懸殊[5-6]。已有研究報道，根據蜂蜜中黃酮類化合物含量的不同，評價蜂蜜質量、推測蜂蜜地理來源[7-8]。

常見的黃酮成分含量測定方法有高效液相色譜法、紫外分光光度計比色法、酶標儀微量法。高效液相色譜法所需樣品劑量少，但操作復雜、成本較高。紫外分光光度計比色法操作簡便、節約成本，但樣品用量大。酶標儀微量法同時具有所需試劑用量少、單次測樣多、效率高等優點，是測量總黃酮含量的理想方法，正逐漸被廣大科研工作者所采用。本試驗選用酶標儀微量法對市場銷量較大的3種單花蜜總黃酮含量進行測定比較，希望利用簡單準確的檢測方法為蜂蜜質量的綜合評價及消費者的選購提供一些參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

于淮安市大型超市購買銷售量較好的3種品牌瓶裝單花蜜（洋槐蜜、棗花蜜、紫云英蜜），所選品牌均為2014年中國蜂產品協會抽檢合格產品。

蘆丁對照品（Sigma公司）；無水三氯化鋁、硝酸鋁、氫氧化鈉、甲醇（分析純，國藥集團化學試劑有限公司）；蒸餾水。

1.2 儀器與設備

Infinite M200 PRO酶標儀（瑞士Tecan公司）；超聲波清洗器KQ-500B（昆山市超聲儀器有限公司）；旋轉蒸發器 RE-2000（上海亞榮生化儀器廠）；循環水式多用真空泵 SHZ-D（III）（鞏義市英裕予華儀器廠）；BS210S電子分析天平（北京賽多利斯儀器有限公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 標準曲線的制備 精確稱取干燥至恒質量的蕓香苷對照品20 mg，加甲醇定容于100 mL容量瓶中，即得 0.2 mg/mL 蕓香苷標準液。準確移取對照品溶液0.00、008、0.16、0.24、0.32、0.40、0.48 mL，分別置于2 mL Ep管中，各加水 0.32 mL，加0.08 mL 5%亞硝酸鈉溶液，搖勻，放置6 min，加0.08 mL 10% 硝酸鋁溶液，搖勻，放置6 min，加0.80 mL 4% 氫氧化鈉溶液，再加水至刻度，搖勻，放置15 min。在510 nm處用酶標儀測定吸光度。以蕓香苷質量濃度為橫坐標，吸光值為縱坐標，繪制標準曲線。回歸方程：y=7.757 9x-0.000 9（r2=0.999 2）。蕓香苷對照品溶液在0～0.048 mg/mL 范圍內吸光度和濃度線性關系良好。

1.3.2 樣品溶液的制備 參考張文霽等[9]、羅顯來等[10]的方法，分別準確稱取3種單花密各3種不同品牌的9種蜂蜜25 g于錐形瓶中，加入無水乙醇25 mL，在常溫下超聲萃 取25 min，重復3次，合并萃取所得上清液，于旋轉蒸發儀中蒸干，用甲醇溶解定容于10 mL容量瓶中，作為樣品溶液。

1.3.3 樣品總黃酮含量測定 取0.16 mL樣品溶液置于 2 mL Ep管中，依照“1.3.1”節的方法測定吸光值，同時取 0.16 mL 甲醇代替待測液處理作空白對照。根據標準曲線求出待測液的總黃酮濃度，計算出樣品中濃度，單位為 mg/100 g 蜂蜜，以蕓香苷計。

1.4 試驗方法考察

對樣品溶液和檢測方法，分別進行精密度試驗、重復性試驗、穩定性試驗、加樣回收率試驗等。

1.5 數據處理

所有樣品均測定3次，分析和處理結果以平均值±標準差表示。采用SPSS 19.0軟件進行分析。統計方法為單因素方差分析，Duncans檢驗。

2 結果與分析

2.1 樣品總黃酮含量測定結果

3種單花蜜總黃酮含量均在1.00 mg/100 g以上，其中棗花蜜總黃酮含量最高（1.72 mg/100 g），紫云英蜜次之（1.26 mg/100 g），洋槐蜜含量最低（1.11 mg/100 g）。不同單花蜜間總黃酮含量存在顯著性差異，單花蜜中總黃酮的含量與蜜源植物的種類密切相關（表1）。

不同品牌瓶裝單花蜜的總黃酮含量也存在一定差異。品牌2中3種單花蜜的總黃酮含量均低于品牌1和品牌3；3種品牌的棗花蜜總黃酮含量變化較大，品牌2棗花蜜黃酮含量明顯低于品牌1和品牌3；紫云英蜜品牌1和品牌3中黃酮含量相近，略高于品牌2；洋槐蜜3種品牌的黃酮含量變幅最小，無顯著性差異。蜂蜜產地、加工工藝、保存時間等因素均可引起單花蜜總黃酮含量的不同（圖1）。

2.2 方法學考察結果

量取同一蜂蜜樣品溶液，在相同波長條件下，連續檢測6次，測得吸光值RSD為2.16%，表明儀器精密度良好。稱取同一蜂蜜樣品溶液，分別在0、20、40、60、80、100、120 min的放置時間進樣，測定吸光值RSD為0.56%，表明樣品在 120 min 內穩定。稱取同一蜂蜜25 g共6份，按照樣品溶液制備方法，計算含量RSD為1.16%，表明該方法重復性好。精確量取已知黃酮含量的蜂蜜供試品溶液，平行3組，3組中分別加入蕓香苷標準品0.05、0.20、0.50 mg，按上述制備方法和條件進行處理和測定，計算平均加樣回收率為91.67%，RSD為2.11%，回收率良好。

3 討論

黃酮作為生物活性物質，在不同蜜源植物中的含量不同。Yao等研究產于澳大利亞的5種單花蜜（Melaleuca honey，Guioa honey，Lophostemon honey，Banksia honey和Helianthu honey）發現Melaleuca honey含量最高，為6.35 mg/100 g，Helianthu honey含量最低，為1.79 mg/100 g，5種單花蜜總黃酮含量差異顯著，可有效地區分蜂蜜來源[11]。郭夏麗等利用高效液相色譜法對江西地區棗花蜜、紫云英蜜、洋槐蜜中的總黃酮進行含量測定，比較得到棗花蜜黃酮含量最高，洋槐蜜最低[25]，本研究結果與之相一致。孫蘭鳳等檢測沈陽地區棗花蜜黃酮含量（4.68 μg/g）也高于槐花蜜（3.16 μg/g）[12]。但不同地區相同單花蜜間黃酮含量存在一定差異。此外，加工工藝、保存條件和保存時間等因素也會影響黃酮含量[13]。

黃酮類化合物可以和鋁離子形成絡合物而顯色，常采用比色法測定總黃酮含量。酶標儀微量法相比較傳統紫外分光光度計法，檢測原理、操作方法、結果判定基本一致，不同之處是所需樣品試劑用量更少、單次檢測樣品更多、耗時更短。本研究測得的方法學考察結果中RSD值均小于5%，表明酶標儀微量法測定蜂蜜中黃酮含量具有較高的精密度、重復性、穩定性和回收率，滿足試驗要求，可替代傳統的紫外分光光度計，用于大批量蜂蜜樣品的快速測試。果葡糖漿勾兌的假蜂蜜中沒有源于植物的黃酮類物質，通過檢測黃酮的含量及種類，可以判斷蜂蜜的真假，評價蜂蜜的質量。我國于2011年正式實施GB 14963—2011《食品安全國家標準 蜂蜜》，其中對理化指標進行了相應修改，但還未將總黃酮含量納入其中，建議加入黃酮含量指標，為蜂蜜質量控制評價提供更全面的科學依據。

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