酶法提取夏秋季次品綠茶茶多酚工藝優(yōu)化

黃德娜+李鋒+曾承露+張?jiān)?劉潔

摘要：以夏秋季產(chǎn)都勻毛尖為原料，利用響應(yīng)面法對(duì)復(fù)合酶（纖維素酶和果膠酶）輔助提取毛尖茶中茶多酚的工藝進(jìn)行優(yōu)化。首先采用單因素試驗(yàn)分析pH值、料液比、提取溫度、提取時(shí)間、酶用量5個(gè)因素對(duì)茶多酚提取率的影響，篩選出影響茶多酚提取率顯著的因素，結(jié)合響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝參數(shù)，并對(duì)各個(gè)因素的顯著性和交互性進(jìn)行分析。結(jié)果顯示毛尖茶中茶多酚的提取最佳工藝條件為：在 60 ℃的水浴條件下，pH值為5.5，酶解時(shí)間為70 min時(shí)，茶多酚的提取率可達(dá)22.39%。

關(guān)鍵詞：都勻毛尖；綠茶；纖維素酶；果膠酶；茶多酚；響應(yīng)面法

中圖分類號(hào)： R284.2

文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2016）04-0347-04

黔南地區(qū)茶葉資源豐富，都勻、貴定、甕安等都是產(chǎn)茶大縣，茶葉是該地區(qū)主導(dǎo)產(chǎn)業(yè)之一，但忽視夏秋茶生產(chǎn)的現(xiàn)象尤為突出。按照茶樹1年萌發(fā)4輪新梢的生長(zhǎng)規(guī)律，夏秋茶產(chǎn)量要占全年總產(chǎn)量的60%以上，若能很好利用夏秋茶資源，對(duì)于提高茶葉生產(chǎn)整體效益，有效增加茶農(nóng)收入，推動(dòng)黔南州茶葉產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展，將發(fā)揮重要作用。茶葉中主要活性成分有茶多酚、茶多糖、咖啡堿、茶氨酸等。茶多酚為茶葉中多酚類的總稱，其具有抗氧化、抗菌、抗癌等生理功能，對(duì)一些心血管、腫瘤等疾病有一定的預(yù)防作用[1-2]，被廣泛應(yīng)用于藥品、食品及保健等行業(yè)[3-4]。據(jù)報(bào)道，當(dāng)前國(guó)內(nèi)外對(duì)茶多酚的需求為2 000 t/年左右[5]，其市場(chǎng)價(jià)值達(dá)到十幾億元，極具開發(fā)價(jià)值。目前對(duì)黔南地區(qū)夏秋低檔綠茶的相關(guān)研究較少，若能從中提取茶多酚并進(jìn)行相關(guān)研究，對(duì)黔南夏秋茶葉的綜合利用具有極大意義。

目前，植物活性成分的提取方法種類較多（有機(jī)溶劑萃取法、微波法、超聲波法等），但各有優(yōu)缺點(diǎn)[6-8]。本研究采用酶技術(shù)提取茶多酚，酶具有專一性和高效性，只破壞細(xì)胞壁，從而有利于細(xì)胞壁內(nèi)的有效成分溶出。此法提取條件溫和、簡(jiǎn)單，克服活性成分結(jié)構(gòu)被破壞的缺點(diǎn)，是一種安全、有效、無污染的提取方法[9]。本試驗(yàn)擬采用復(fù)合酶法提取茶葉中茶多酚，以茶多酚提取率為評(píng)價(jià)目標(biāo)，從酶用量、時(shí)間、溫度、pH值等方面考察復(fù)合酶法提取茶多酚的效果，并優(yōu)化提取工藝條件，以期為次品茶葉或茶老葉的綜合利用提供科學(xué)依據(jù)和技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

都勻毛尖茶（夏秋茶）購(gòu)于貴州都勻，烘干粉碎后，過40目篩，裝袋，4 ℃保存?zhèn)溆谩＠w維素酶、果膠酶購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；95%乙醇、硫酸亞鐵、酒石酸鉀鈉、十二水磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀等試劑均為分析純，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司；復(fù)合酶溶液為等體積1 mg/mL纖維素酶溶液和1 mg/mL 果膠酶溶液混合而成。

1.2 儀器

TU-1901 型雙光束紫外-可見分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；HH-S2 型數(shù)顯恒溫水浴鍋（鄭州英峪予華儀器有限公司）；BS124S電子分析天平（賽多利斯）PH值S-2C數(shù)字式酸度計(jì)（上海理達(dá)儀器）；優(yōu)普超純水器（成都超純水有限公司）；中草藥高速粉碎機(jī)（北京科偉永興有限公司）

1.3 方法

1.3.1 茶多酚提取工藝流程 茶葉→干燥→粉碎→稱質(zhì)量→酶法浸取→過濾→離心→上清液→定容檢測(cè)→分析茶多酚含量。

1.3.2 單因素試驗(yàn) 稱取綠茶樣品粉末1.00 g，分別就不同溫度（35、40、45、50、55、65 ℃），不同浸取時(shí)間（15、30、45、60、75、90 min），不同酶用量（50、100、150、300 μL），不同pH值（5.0、5.5、6.0、6.5、7.0）和不同料液比（g ∶mL，1 ∶40、1 ∶60、1 ∶80、1 ∶100、1 ∶120、1 ∶140）進(jìn)行單因素試驗(yàn)，考察上述各因素對(duì)茶多酚提取率的影響，從中選取對(duì)提取率影響顯著的因素進(jìn)行后續(xù)優(yōu)化試驗(yàn)。

1.3.3 響應(yīng)面分析試驗(yàn)設(shè)計(jì) 在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選取pH值、提取時(shí)間、提取溫度3個(gè)因素為試驗(yàn)因素，以茶多酚提取率為響應(yīng)指標(biāo)，采用Box-Behnken響應(yīng)面法，利用Design-Expert V8.0.6軟件研究各因素間的交互作用及其對(duì)茶多酚提取率的影響。試驗(yàn)設(shè)計(jì)見表1。

1.3.4 茶多酚提取率的測(cè)定 參考國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 8313—2002《茶 茶多酚測(cè)定》，采用酒石酸亞鐵比色法測(cè)定，具體如下：準(zhǔn)確吸取茶多酚提取試液1 mL于25 mL容量瓶中，加入4 mL水和5 mL酒石酸亞鐵，充分混勻，用pH值為7.5的磷酸鹽緩沖液定容，放置約5 min，以試劑空白做參比，于波長(zhǎng)540 nm測(cè)吸光度D；整個(gè)顯色過程在30 min內(nèi)完成。茶多酚提取率以茶葉質(zhì)量分?jǐn)?shù)表示，按下式計(jì)算：

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 酶用量對(duì)茶多酚提取率的影響 由圖1可知，隨著酶用量的增加，茶多酚提取率呈上升趨勢(shì)。在酶用量為100 μL時(shí)，提取率達(dá)到最高值，之后提取率略有上升呈平緩趨勢(shì)，即酶用量達(dá)到飽和后，底物被水解的速率不再增加。因此，選用酶用量為100 μL用于后續(xù)試驗(yàn)。

2.1.2 提取時(shí)間對(duì)茶多酚提取率的影響 由圖2可知，隨著浸取時(shí)間的增加，毛尖茶的茶多酚提取率呈直線上升趨勢(shì)。在75 min之后茶多酚提取率減緩略有下降，說明通過增加時(shí)間無法增加茶多酚提取率；浸取時(shí)間過短導(dǎo)致茶多酚提取不完全，時(shí)間過長(zhǎng)可能導(dǎo)致提取出的茶多酚被氧化；同時(shí)茶葉中的某些酚類、單寧及花色素是纖維素酶的天然抑制劑，如在溶液中濃度過度積累會(huì)對(duì)酶解反應(yīng)造成抑制[10]，所以最佳提取時(shí)間為75 min，作為后續(xù)試驗(yàn)參數(shù)。

2.1.3 提取溫度對(duì)茶多酚提取率的影響 由圖3可知，隨著浸取溫度的提高，毛尖茶中茶多酚的提取率呈上升趨勢(shì)。在浸取溫度達(dá)到55 ℃時(shí)，茶多酚提取率達(dá)到最大值，是該體系的最佳反應(yīng)溫度。通過升高溫度可以促進(jìn)酶解作用，所以茶多酚提取率在這一段時(shí)間內(nèi)不斷提高；但55 ℃以后，提取率明顯開始下降，這是因?yàn)槌^酶活性溫度后，部分或者全部酶失去活性，從而酶促反應(yīng)受到抑制。

2.1.4 pH值對(duì)茶多酚提取率的影響 由圖4可知，隨著pH值的增大，茶多酚提取率呈上升趨勢(shì)。在pH值為5.5時(shí)，提取率達(dá)到最高值，之后茶多酚提取率開始下降。與溫度對(duì)茶多酚提取率類似，酶活性受pH值影響較大，每種酶都有最適pH值，當(dāng)偏離最適值時(shí)，都會(huì)使酶蛋白活力降低或者變性。

2.1.5 料液比對(duì)茶多酚提取率的影響 由圖5可知，隨著料液比的增加，茶多酚提取率呈上升趨勢(shì)。這是因?yàn)樘崛∪軇┝康脑龃螅梢蕴岣卟枞~粉末與水溶液間的茶多酚濃度差，更有利于茶多酚向水溶液中擴(kuò)散。在料液比為1 g ∶120 mL后茶多酚溶出速率明顯降低，繼續(xù)增加溶劑會(huì)給后期提取過程造成負(fù)擔(dān)，不易濃縮；因此選料液比為1 g ∶120 mL作為最佳值。

2.2 響應(yīng)面分析法確定重要因素的最佳水平

2.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果 根據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)方案設(shè)計(jì)3因素3水平共17個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)進(jìn)行響應(yīng)面分析，試驗(yàn)安排及結(jié)果見表2。

對(duì)模型方程進(jìn)行方差分析得知（表3），P=0.000 2表明試驗(yàn)所選的模型極度顯著；失擬項(xiàng)P= 0.762 1>0.05，表明失擬項(xiàng)差異不顯著，說明回歸模型與試驗(yàn)數(shù)據(jù)擬合度較高；回歸模型決定系數(shù)R2=0.968 0，校正決定系數(shù)R2Adj=0.926 9，表明實(shí)測(cè)值與預(yù)測(cè)值高度相關(guān)，回歸模型與實(shí)測(cè)值能夠較好地?cái)M合。模型方程的一次項(xiàng)C影響極顯著（P<0.01）；二次項(xiàng)A2、B2影響均顯著（P<0.05）；交互項(xiàng)AB、AC影響不顯著（P>0.05），交互項(xiàng)BC影響顯著（P<0.05）；此結(jié)果表明各因素對(duì)茶多酚提取率的影響不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系。同時(shí)由表3可知，響應(yīng)面優(yōu)化酶法提取茶多酚的工藝參數(shù)中，所選各因素水平范圍內(nèi)，影響茶多酚提取率的因素按主次順序排列為：溫度>時(shí)間>pH值。

2.2.2 響應(yīng)面圖分析 由圖6至圖8可知，每個(gè)因素在特定的取值范圍內(nèi)，曲面圖和等高線圖都存在響應(yīng)峰值；并且可以從圖中直觀地了解各因素的交互作用對(duì)茶多酚提取率的影響是否顯著。從3組圖中可知，三維曲面都為凸曲面，最高點(diǎn)落在所選區(qū)域內(nèi)，說明選擇因素水平合理；茶多酚提取率隨pH值（A）、提取時(shí)間（B）和提取時(shí)間（C）的增加均呈現(xiàn)先增后降的二次關(guān)系，等高線的疏密及形狀反映提取時(shí)間（B）和提取溫度（C）交互作用對(duì)茶多酚提取率影響顯著，pH值（A）和提取時(shí)間（B）、pH值（A）和提取溫度（C）的交互作用對(duì)茶多酚提取率影響不顯著。

2.3 模型驗(yàn)證

根據(jù)Design-Expert 8.0.6軟件的優(yōu)化功能得到最佳提取工藝條件為： pH值、提取時(shí)間和提取溫度分別為5.50、7088 min和60 ℃時(shí)，茶多酚提取率預(yù)測(cè)最大值達(dá)到24.623 4%。為更方便操作，最佳提取工藝參數(shù)修正為：pH值為5.50、提取時(shí)間為70 min和提取溫度為60 ℃；在此條件下進(jìn)行3組平行試驗(yàn)，測(cè)得實(shí)際茶多酚平均提取率為22.39%，說明此方程模型能夠真實(shí)反映所篩選因素對(duì)茶多酚提取率的影響。

3 結(jié)論

通過單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面法對(duì)茶多酚提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，建立了pH值、提取時(shí)間和提取溫度3個(gè)因素對(duì)茶多酚提取率的二次回歸模型，經(jīng)驗(yàn)證此模型準(zhǔn)確有效；優(yōu)化后的茶多酚提取工藝條件為pH值5.5、提取時(shí)間70 min和提取溫度 60 ℃，在此條件下茶多酚提取率為22.39%。

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