縫隙連接蛋白Cx43介導高糖誘導的氣道上皮結構受損①

余紅梅　楊　娟　周向東　肖　謙　呂　洋　夏　麗

(重慶醫科大學附屬第一醫院老年病科，重慶400016)

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縫隙連接蛋白Cx43介導高糖誘導的氣道上皮結構受損①

余紅梅楊娟②周向東③肖謙呂洋夏麗

(重慶醫科大學附屬第一醫院老年病科，重慶400016)

[摘要]目的：探討縫隙連接蛋白(Connexin43，Cx43)在高糖(High glucose，HG)誘導氣道上皮結構受損的相關調節機制。方法：構建突變的Cx43磷酸化載體pEGFP-N1-Cx43279-MU、pEGFP-N1-Cx43365-MU和pEGFP-N1-Cx43368-MU，轉染正常人支氣管上皮細胞16HBE，給予高糖刺激，Western blot 法、Real-time PCR 法測定Cx43的蛋白及mRNA 水平，Western blot法測定緊密連接蛋白(Zonula occludens-1， ZO-1)及黏附連接蛋白(E-cadherin)的表達，激光共聚焦檢測ZO-1的表達及定位。結果：與對照組相比，HG刺激后Cx43 mRNA 表達及蛋白含量均降低，ZO-1及E-cadherin的表達亦明顯降低，均低于對照組(P<0.05)。轉染Cx43磷酸化突變載體pEGFP-N1-Cx43279-MU、pEGFP-N1-Cx43365-MU和pEGFP-N1 -Cx43368-MU 的細胞經HG刺激后，Cx43表達明顯增強，顯著高于單純HG組(P<0.05)，同時伴隨ZO-1及E-cadherin的表達的增強(P<0.05)。結論：縫隙連接蛋白Cx43參與了HG誘導的氣道上皮結構受損，是氣道上皮機械防御屏障的重要調控分子。

[關鍵詞]縫隙連接蛋白43；高糖；氣道上皮；受損

肺部感染是糖尿病患者的常見并發癥，且為常見致死病因。糖尿病患者易致結核菌感染以及各類病毒、細菌等所致的肺部炎癥，而慢性阻塞性肺部疾病患者并發糖尿病時其急性加重的發生率與機體長期高血糖狀態有著密切相關性[1,2]。氣道上皮細胞層結構的完整性是氣道防御屏障的關鍵，因上皮細胞是維持黏膜表面微環境穩定的核心，一旦上皮完整性破壞，氣道黏膜表面有序的微環境也不復存在，氣道機械防御屏障結構性和功能性破壞，從而導致氣道炎癥或感染的發生。Cx43是Cx家族最主要的成員，在氣道上皮細胞、肺泡Ⅰ型及Ⅱ型細胞、肺內皮細胞及平滑肌細胞等均有大量表達[3]。高血糖可能引起Cx43的高磷酸化及表達量的變化，致晶狀體上皮細胞、主動脈平滑肌細胞及微血管內皮細胞等細胞間有序組織及結構的完整性受損或消失及各靶器官功能障礙[4]。故此推測，Cx43是否與氣道上皮結構完整性有關? 是否參與高糖致其受損的過程? 本研究以高糖(High glucose，HG)作為刺激因素，探討Cx43在高糖致氣道上皮結構受損中的作用，以期明確高糖致氣道炎性反應的潛在機制。

1材料與方法

1.1材料人氣道上皮16HBE 細胞株(上海復祥生物科技有限公司)；pEGFP-N1 空載體(Clontech 公司)；DEME/Ham′s F12 培養基、HEPES、Trizol 和小牛血清(Sigma 公司)；兔抗ZO-1、兔抗Cx43、兔抗E-cadherin(美國Abcam公司)；轉染試劑FuGENE 6(瑞士Roche公司)；HRP-羊抗兔抗體(Santa Cruz 公司)；其余產品為國產試劑。

1.2方法

1.2.1重組質粒的雙酶切鑒定構建人Cx43重組質粒pEGFP-N1-Cx43，以該重組質粒為模板，設計突變型PCR擴增引物，構建磷酸化位點突變基因表達載體，獲得突變的Cx43載體pEGFP-N1-Cx43279-MU、pEGFP-N1-Cx43365-MU和pEGFP-N1-Cx43368-MU(分別作用于Cx43的S279、S365及S368等絲氨酸位點，突變載體模擬被遏制磷酸化的Cx43)。提取純化各組質粒，分別以限制性內切酶EcoRⅠ及BamHⅠ加入反應體系進行酶切。用T4 DNA連接酶將回收片段連接過夜，后轉化入感受態細胞，轉化過程設置陰性及陽性對照組，將轉化平板置于37℃過夜孵育，挑選陽性克隆，加入液體培養基及卡那霉素搖菌。12 h后提取質粒酶切鑒定分析。

1.2.2轉染常規培養16HBE細胞，待細胞匯合至90%左右進行轉染，操作步驟按FuGENE 6說明書進行。轉染設空白對照組、空質粒組及重組質粒組。轉染后24～48 h在熒光顯微鏡下觀察熒光，以此鑒定轉染是否成功及轉染效率。

1.2.3細胞分組于6孔板中培養16HBE細胞，常規培養換液，待細胞匯合至70%～80%時傳代，將細胞分為6組，每組3個復孔：①對照組：在無胎牛血清無雙抗的DEME/Ham′s F12 培養基中繼續培養細胞；②HG刺激組：無血清培養液中加入終濃度為30 mmol/L的HG；③HG+pEGFP-N1-Cx43279-MU組：進行pEGFP-N1-Cx43279-MU轉染，同時給予終濃度30 mmol/L的HG刺激；④HG+pEGFP-N1-Cx43365-MU組：進行pEGFP-N1-Cx43365-MU轉染，同時給予終濃度30 mmol/L的HG刺激；⑤HG+ pEGFP-N1-Cx43368-MU組：進行pEGFP-N1-Cx43368-MU轉染，同時給予終濃度30 mmol/L的HG刺激；⑥pEGFP-N1轉染組：進行pEGFP-N1轉染，但不給予刺激。繼續培養后分別收集上清和細胞進行相關指標檢測，每組實驗重復4次。

1.2.4四甲基偶氮唑鹽(MTT)法檢測各組細胞的活力96 孔板中每孔按濃度1 ×104個/ml加入200 μl細胞懸液，每組各6 個復孔，37℃、5% CO2濕度培養箱孵育，分別取10、20、30 和60 min 時間點行MTT 測定。自動酶標讀數儀以570 nm 波長測定各孔吸光度(A)值。

1.2.5實時熒光定量PCR(real-time)法檢測Cx43 mRNA水平Trizol 法分別提取各組細胞內總RNA，經鑒定，樣品A260/A280比值均介于1.8 ～2.0，初步定量后保存于-20℃備用。兩步法行RT-PCR。cDNA 反轉錄反應按PrimeScript 反轉錄試劑盒說明進行。Cx43上游引物:5′-TTCAAGGGCGTTAAGGAT-3′，下游引物:5′-CCAGGAGGAGACAT-AGGC-3′。GAPDH 上游引物:5′-TCCCATCACCATCTTCCAG-3′，下游引物:5′-GAGTCCTTCCACGATACCAA-3′。反應參數:94℃ 預變性3 min，后緊隨35 個循環，循環參數：94℃ 45 s，58℃ 30 s，70℃ 60 s，后72℃延伸5 min采用2-△△CT方法分析目的基因mRNA 相對表達量。CT 是熒光達到熒光閾值的循環數，△△Ct=(CT目的基因-CT 管家基因)實驗組-(CT目的基因-CT管家基因)對照組。

1.2.6Western blot法檢測細胞內各氣道上皮結構蛋白的相對含量棄培養液后加入細胞裂解液，冰浴20 min，4℃ 12 000 r/ min離心15 min，測定蛋白濃度。取各組細胞蛋白10 g經含15%的SDS-PAGE電泳分離，轉移至硝酸纖維素膜上，5%脫脂牛乳封閉1 h，加入兔抗ZO-1、兔抗Cx43、兔抗E-cadherin(1∶1 000)孵育2 h，再用HRP標記的羊抗兔IgG(1∶10 000)孵育2 h。洗膜后經ECL顯色，暗室曝光2 min。結果以與內參照β-actin產物條帶的密度面積積分比值作為Cx43、ZO-1及E-cadherin蛋白的相對含量。

1.2.7激光共聚焦掃描顯微鏡觀察ZO-1蛋白的胞內表達吸棄培養液，4%多聚甲醛固定30 min，0.3%的Triton-100透化處理20 min，加入羊血清室溫下封閉30 min，去血清，加兔抗ZO-1單克隆抗體1∶200，置濕盒內4℃過夜，再加二抗(FITC標記的羊抗兔IgG 1∶50)，置濕盒內室溫下2 h，50%的甘油封片，顯微鏡下觀察，成像并行圖像分析。

2結果

2.1各Cx43磷酸化位點突變基因表達載體的酶切鑒定及轉染各重組質粒pEGFP-N1-Cx43279-MU、pEGFP-N1-Cx43365-MU和pEGFP-N1-Cx43368-MU經EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ雙酶切鑒定構建成功(圖1)，符合預期目標。重組質粒轉染16HBE細胞36 h后在熒光倒置顯微鏡下觀察，質粒發出較強綠色熒光，證實轉染成功(圖2)。

2.2各組中細胞增殖的變化各處理因素對細胞的增殖活力無明顯影響(表1)。

圖1　Cx43磷酸化突變體酶切電泳圖Fig.1　Restriction enzyme identification of recombin-ant constructsNote: 1.pEGFP-N1；2.pEGFP-N1-Cx43279-MU；3.pEGFP-N1-Cx43365-MU；4.pEGFP-N1-Cx43368-MU.

圖2　Cx43磷酸化突變體轉染圖(×200)Fig.2　Transfection of recombinant constructs(× 200)Note: A.pEGFP-N1；B.pEGFP-N1-Cx43279-MU；C.pEGFP-N1-Cx43365-MU；D.pEGFP-N1-Cx43368-MU.

2.3不同磷酸化突變載體對高糖刺激的氣道上皮Cx43表達水平的影響HG刺激可明顯降低氣道上皮Cx43的mRNA及蛋白的表達(P<0.05)，而轉染pEGFP-N1-Cx43279-MU、pEGFP-N1-Cx43365-MU和pEGFP-N1-Cx43368-MU后再予以HG刺激，Cx43的mRNA及蛋白的表達水平較前明顯增加(P<0.05，圖3、5)。而轉染空質粒pEGFP-N1對Cx43基因及蛋白水平無明顯影響(P>0.05)。

圖3　HG及轉染Cx43突變載體對Cx43 mRNA表達水平的影響Fig.3　Effects of HG and recombinant constructs on Cx43 mRNA expressionNote: *.P<0.05，compared with control group；#.P<0.05,compared with HG group；1.pEGFP-N1-Cx43279-MU；2.pEGFP-N1-Cx43365-MU；3.pEGFP-N1-Cx43368-MU；4.pEGFP-N1.

圖4　免疫熒光檢測各組ZO-1蛋白的表達(× 800)Fig.4　Expression of ZO-1 protein detected by immunofluorescence(× 800)Note: A.Control；B.HG；C.HG+pEGFP-N1-Cx43279-MU；D.HG+pEGFP-N1-Cx43365-MU；E.pEGFP-N1-Cx43368-MU.

Groups10min20min30min60minControl0.152±0.0080.175±0.0130.352±0.0140.379±0.011HG0.142±0.0100.165±0.0090.323±0.0090.356±0.015HG+pEGFP-N1-Cx43279-MU0.148±0.0070.172±0.0110.401±0.0110.421±0.0HG+pEGFP-N1-Cx43365-MU0.139±0.0090.159±0.0120.415±0.0120.409±0.017HG+pEGFP-N1-Cx43368-MU0.150±0.0110.181±0.0130.423±0.0130.411±0.012pEGFP-N10.143±0.0120.174±0.0100.394±0.0100.401±0.009

圖5　HG及轉染Cx43突變載體對氣道上皮各結構蛋白表達水平的影響Fig.5　Effects of HG and recombinant constructs on protein expressions of Cx43,ZO-1 and E-cadherinNote: *.P<0.05，compared with control group；#.P<0.05,compared with HG group；1.pEGFP-N1-Cx43279-MU；2.pEGFP-N1-Cx43365-MU；3.pEGFP-N1-Cx43368-MU；4.pEGFP-N1.

2.4不同磷酸化突變載體對高糖刺激ZO-1、E-cadherin蛋白表達的影響HG刺激后 ZO-1及E-cadherin的表達較對照組明顯降低(P<0.05)，而轉染Cx43磷酸化突變體后pEGFP-N1-Cx43279-MU、pEGFP-N1-Cx43365-MU和pEGFP-N1-Cx43368-MU可抑制高糖對上述蛋白表達的作用(P<0.05，圖4、5)。

3討論

氣道上皮細胞之間的連接方式有三種：緊密連接、粘附連接和縫隙連接。緊密連接位于上皮細胞頂端，主要由Zonula occludens-1(ZO-1)等蛋白構成。粘附連接位于緊密連接基面，與肌動蛋白及粗肌絲共同支撐并調控細胞形態，包括E-cadherin及(α,β)-catenin 。縫隙連接(Gapjunction， GJ)是直接連接相鄰細胞細胞質的細胞間通道，介導縫隙連接細胞間通訊(Gapjunction intercellular communication，GJIC)，由連接蛋白(Connexins，Cxs)構成，連接蛋白根據其分子量命名，如Cx43[5]。在氣道上皮細胞層結構完整的基礎上，氣道運行其有效的粘液纖毛清除功能，即能有效維護氣道機械防御機能以抵御各種外界刺激特別是病原菌的侵入。正常氣道分泌物中葡萄糖濃度約為血漿中濃度的1/10，而在高血糖狀態下氣道分泌物中的葡萄糖濃度急劇上升，氣道分泌物的正常穩態被打破。因此，高血糖狀態可致氣道局部葡萄糖濃度的改變，引起氣道一系列病理生理變化致正常氣道防御屏障受損，由此易引起外界刺激物特別是病原菌的侵入。本研究結果顯示，高糖刺激可降低氣道上皮細胞各連接蛋白Cx43、ZO-1及E-cadherin的表達水平，使正常氣道上皮結構受損，故而使氣道易于受到病原菌入侵。那么高血糖如何破壞氣道上皮結構？參與其中的靶點分子是什么？

Cx43是Cx家族最主要的成員，在氣道上皮細胞、肺泡Ⅰ型及Ⅱ型細胞、肺內皮細胞及平滑肌細胞等均有大量表達。近些年在對高血糖致全身各系統靶器官損害的大量研究中發現，縫隙連接蛋白Cx43起著重要的介導作用[4,6]。從Cx43基因敲除小鼠的研究中發現，其晶狀體上皮細胞間的特征性連接及有序排列消失，致細胞間有序組織及結構的完整性受損或消失。在對糖尿病視網膜病變及血管病變的研究中發現，高血糖可致Cx43的高磷酸化及降解，血管內皮細胞結構的紊亂致血-視網膜屏障的破壞，主動脈平滑肌細胞及微血管內皮細胞結構紊亂致血管損害，破壞心血管系統的穩態致功能障礙。Cx43的主要功能調節位點為位于其C端的S279、S365及S368等絲氨酸磷酸化位點[7]。本研究顯示，高糖刺激可降低Cx43的表達水平，而轉染突變的Cx43磷酸化載體pEGFP-N1-Cx43279-MU、pEGFP-N1-Cx43365-MU和pEGFP-N1-Cx43368-MU到正常人支氣管上皮細胞16HBE后，再給予高糖刺激，細胞中Cx43的表達明顯增加。表明在高糖致氣道上皮結構受損過程中，Cx43的磷酸化可影響Cx43在細胞內的表達，具有關鍵的調節作用。

在對氣道上皮縫隙連接蛋白的大量研究中發現，連接蛋白可與緊密連接、黏附連接及細胞骨架蛋白等結構發生作用以維護氣道上皮結構的完整性。研究發現，連接蛋白Cx43可參與維護氣道上皮結構的完整性[8]。Cx43的C端可與ZO-1的PDZ2位點結合定位于氣道上皮細胞胞膜，Cx43的突變體及高磷酸化則使其與ZO-1結合減少，致縫隙連接通道正常結構的改變及氣道上皮細胞膜ZO-1的減少[9]。免疫電鏡分析顯示連接蛋白Cxs、E-cadherin及catenin共沉淀于縫隙連接形成過程中細胞間的相互作用點上[10]。本研究結果顯示，高糖刺激可降低ZO-1及E-cadherin的表達水平，而轉染突變的Cx43磷酸化載體pEGFP-N1-Cx43279-MU、pEGFP-N1-

Cx43365-MU和pEGFP-N1-Cx43368-MU到正常人支氣管上皮細胞16HBE后使ZO-1及E-cadherin表達明顯增加。說明在高糖刺激氣道上皮細胞以后，Cx43的磷酸化可引起緊密連接及粘附連接蛋白表達量的降低，致氣道上皮結構受損。

本研究初步確認了縫隙連接蛋白Cx43在高血糖致氣道上皮結構受損中的關鍵靶點作用，為臨床治療糖尿病患者肺部感染提供了新的思路。

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[收稿2016-02-19修回2016-04-07]

(編輯許四平)

High glucose impaired airway epithelium regulated by connexin43

YUHong-Mei,YANGJuan,ZHOUXiang-Dong,XIAOQian,LüYang,XIALi.

DepartmentofGeriatrics,FirstAffiliatedHospitalofChongqingMedicalUniversity,Chongqing400016,China

[Abstract]Objective:To explore the mechanism of connexin43(Cx43)in regulating impaired airway epithelium induced by high glucose.Methods: pEGFP-N1-Cx43279-MU，pEGFP-N1-Cx43365-MU and pEGFP-N1-Cx43368-MU were constructed and transfected into 16HBE cells.Cells were stimulated by high glucose(HG).The levels of Cx43 protein and mRNA were detected by Western blot and real-time PCR respectively.The protein levels of ZO-1 and E-cadherin were detected by Western blot and immunofluorescence.Results: Compared with the control group,there was an obvious decrease of Cx43,ZO-1 and E-cadherin in cells exposed to HG.Compared with the single HG group,the levels of Cx43,ZO-1 and E-cadherin were increased in the cells transfected with pEGFP-N1-Cx43279-MU,pEGFP-N1-Cx43365-MU and pEGFP-N1-Cx43368-MU.Conclusion: Cx43 regultes airway epithelum impared by HG,and it is a critical factor regulating airway epithelial integrity.

[Key words]Connexin43;High glucose;Airway epithelium;Impaired

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2016.05.003

作者簡介：余紅梅(1982年-)，女，博士，主治醫師，講師，主要從事氣道炎癥性疾病的防控研究，E-mail：yhm920@126.com。

中圖分類號R563

文獻標志碼A

文章編號1000-484X(2016)05-0620-05

①本文為國家自然科學基金資助項目(81200005)、重慶市科技惠民計劃項目(cstc2015jcsf10001-01-04)、國家臨床重點專科老年病學建設項目(國衛辦醫函〔2013〕544號)。

②重慶醫科大學附屬第二醫院呼吸內科，重慶400010。

③海南醫學院附屬醫院呼吸內科，海口570102。