重組hIL-10聯(lián)合MTX對AA大鼠IL-1β、TNF-α含量變化和影像學變化研究①

杜聯(lián)峰　陳昆濤　丁立珉　唐艷麗　孫萬邦

(遵義醫(yī)學院珠海校區(qū)/貴州省免疫學研究生教育創(chuàng)新基地,珠海519041)

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重組hIL-10聯(lián)合MTX對AA大鼠IL-1β、TNF-α含量變化和影像學變化研究①

杜聯(lián)峰陳昆濤丁立珉唐艷麗孫萬邦②

(遵義醫(yī)學院珠海校區(qū)/貴州省免疫學研究生教育創(chuàng)新基地,珠海519041)

[摘要]目的：以重組人白細胞介素-10(human interleukin-10，hIL-10)及其聯(lián)合甲氨碟呤(MTX)作用佐劑性關節(jié)炎大鼠模型，檢測血清IL-1β、TNF-α含量的變化情況，研究重組hIL-10聯(lián)合MTX治療佐劑性關節(jié)炎大鼠的效果。方法：AA大鼠造模后，用測量體重、足腫脹度、關節(jié)炎指數(shù)及組織病理學來評價造模是否成功， 各藥物處理AA大鼠模型后，用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測大鼠血清IL-1β、TNF-α的含量。用放射學檢查來評估AA大鼠后足關節(jié)損傷的程度。 結果：各治療組IL-1β、TNF-α含量比模型組水平明顯下降，各治療組與模型組比較有顯著性差異(P<0.05)，聯(lián)合用藥組對AA大鼠血清IL-1β、TNF-α有明顯的抑制作用，影像學檢查提示IL-1β、TNF-α水平與大鼠足骨關節(jié)的損傷程度成正相關，聯(lián)合用藥組治療后骨侵蝕評分最低。結論：各治療組對佐劑性關節(jié)炎大鼠血清中細胞因子IL-1β、TNF-α有抑制作用，這種抑制作用與骨關節(jié)影像學改變顯著相關。聯(lián)合用藥組能有效降低AA大鼠的IL-1β、TNF-α水平，改善AA大鼠足關節(jié)損傷的治療作用。

[關鍵詞]重組人白介素-10；佐劑性關節(jié)炎；IL-1β；TNF-α

類風濕關節(jié)炎(Rheumatoid arthritis,RA)是一種常見的以關節(jié)滑膜慢性炎癥病變?yōu)橹饕憩F(xiàn)的自身免疫性疾病，最終導致逐步和不可逆轉的關節(jié)破壞，目前病因尚不清楚，發(fā)病率高[1]。近年研究證實RA發(fā)生與免疫調節(jié)功能紊亂有關，最新的研究表明在RA發(fā)生和發(fā)展中細胞因子IL-1β和TNF-α發(fā)揮了非常重要的作用[2,3]，IL-1β和TNF-α是重要的炎癥介質，能促進骨髓釋放中性粒細胞，誘導單核細胞和多核粒細胞趨化浸潤到炎癥局部，在局部釋放溶酶體酶；能引起嗜堿粒細胞和肥大細胞脫顆粒，釋放炎癥介質，IL-1β和TNF-α是促使RA病理發(fā)展的重要細胞因子，在類風濕性關節(jié)炎的關節(jié)腔中可檢出IL-1β和TNF-α含量的增加[4]。甲氨蝶呤(MTX)是治療類風濕性關節(jié)炎的一種重要的改善病情的抗風濕藥，臨床上已普遍引用，既往研究發(fā)現(xiàn)MTX主要是通過其細胞內代謝產生多聚谷氨酸化甲氨蝶呤(MTXPG)發(fā)揮治療作用及導致不良反應的發(fā)生[5]。最新研究發(fā)現(xiàn)甲氨蝶呤可以通過阻止激活腺苷A2A受體，增加細胞內腺苷(Adenosine)濃度，增加cAMP水平來抑制TNF、IL-1、IL-6等炎性細胞因子的分泌和細胞吞噬來減輕骨關節(jié)炎癥[6]。但是，MTX治療類風濕性關節(jié)炎存在很大的副作用，主要是消化道癥狀以及減少血液的白細胞、血小板的數(shù)量以及影響肝功能等。最新的研究表明白細胞介素10是一種體內重要免疫負向調控的細胞因子，IL-10能夠抑制活化及效應性T細胞、巨噬細胞功能，介導免疫抑制作用[4,5]。研究發(fā)現(xiàn)在類風濕性關節(jié)炎患者中IL-10水平降低。IL-10在RA中主要由關節(jié)部位巨噬細胞和T細胞產生，其可通過抑制炎性細胞因子的分泌，減輕關節(jié)的腫脹和炎性細胞浸潤及炎性滲出物的產生，具有明顯的免疫抑制功能，目前發(fā)現(xiàn)IL-10可以作為一種輔助治療類風濕性關節(jié)炎的新型細胞因子，來減輕MTX在治療RA患者時的副作用。本研究擬應用重組hIL-10及其聯(lián)合甲氨碟呤作用于佐劑性關節(jié)炎大鼠模型，檢測大鼠血清中IL-1β和TNF-α水平的變化情況，同時通過后足的影像學檢查來評估AA大鼠關節(jié)損傷的程度，為重組IL-10在治療類風濕關節(jié)炎的應用提供實驗數(shù)據。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1動物健康SPF級SD大鼠40只，雌性，由廣東省實驗大鼠中心提供[許可證號SCXK(粵)2008-0002]。在遵義醫(yī)學院珠海校區(qū)動物實驗中心飼養(yǎng)。

1.1.2主要試劑與實驗儀器弗氏完全佐劑，Rat IL-1β ELISA Kit和Rat TNF-α ELISA Kit購自欣博盛生物科技有限公司，MTX 購自廣東嶺南制藥有限公司，重組人IL-10購自PeproTech生物公司， ELx-800型酶標儀等。

1.2實驗方法

1.2.1動物分組及動物模型的建立40只SD大鼠編號以后按隨機數(shù)字表法分為兩組，空白對照組8只SD大鼠，AA大鼠模型組32只SD大鼠，AA大鼠模型組造模：將卡介苗于80℃滅活后加入弗氏不完全佐劑中充分乳化混勻配成(10 mg/ml)的弗氏完全佐劑，于左側足底皮下注射0.1 ml建立AA模型。20 d后同法加強免疫1次，加強免疫后15 d后造模成功，隨機分為四組，既模型對照組、IL-10治療組、MTX治療組、IL-10與MTX聯(lián)合治療組，每組8只。三個治療組自造模成功日起再給藥15 d。給藥劑量及具體方法見表1。

1.2.2實驗大鼠體重變化觀測AA大鼠模型分別在造模前與治療終止時，稱量并記錄大鼠造模前及治療后的體重變化，作為慢性炎癥的度量指標。

1.2.3AA大鼠模型排水法檢測足腫脹度在造模后7、14、21、28、35 d，對每組大鼠足跖部用排水法進行測量，將大鼠后肢放入裝滿水的刻度玻璃容器中，剛好沒過大鼠踝關節(jié)，重復測量3次，記錄每次排水量，取平均值。

1.2.4AA大鼠模型關節(jié)炎指數(shù)評定 在造模后7、14、21、28、35 d，根據關節(jié)紅腫程度進行關節(jié)炎指數(shù)(AI)的評定，關節(jié)炎指數(shù)評定標準如下：0分：正常無紅腫；1分：單個足趾發(fā)紅、腫脹； 2分：多個足趾和足底出現(xiàn)腫脹；3分：踝關節(jié)以下全部腫脹；4分：踝關節(jié)以上受累且不能負重。AI=四肢關節(jié)評分之和。大鼠關節(jié)評分AI≥6分被認定造模成功。

1.2.5AA大鼠模型關節(jié)滑膜病理學改變取正常大鼠與AA模型大鼠處死，打開關節(jié)腔，完整剝離滑膜組織，置新鮮配制的4%多聚甲醛固定，滑膜組織石蠟包埋后切片作HE染色。

1.2.6血清IL-1β和TNF-α檢測各組末次給藥后通過內眥采血2 ml，分離血清，ELISA法檢測血清中細胞因子IL-1β和TNF-α含量。

1.2.7病理學及影像學檢測骨關節(jié)損傷程度AA大鼠治療組分別在治療前與治療終止時，通過DR X射線對原發(fā)側左后足進行攝片(攝片條件為25 KV，1.0 S，電流4 mA)，對關節(jié)破壞和關節(jié)周圍侵蝕性變化的程度進行測量[7]，X光片的得分從0～4表示不同的骨侵蝕度：0分=正常無骨質破壞；1分=疑似或者1個微小局部病灶；2分=2個局部病灶或者病灶總面積≤50%，輕度至中度關節(jié)破壞；3分=3個以上病灶或者病灶總面積≥50，中度關節(jié)破壞；4分=關節(jié)面完全被破壞或者可見骨縮小，具有明顯的關節(jié)周圍糜爛性改變的嚴重關節(jié)破壞。所有的分數(shù)計算以影像學人員判定為準。同時，AA大鼠治療組分別在治療前與治療終止后，取滑膜組織，用4%多聚甲醛固定，滑膜組織石蠟包埋后切片作HE染色。

表1AA大鼠造模成功后實驗分組及給藥方案(n=8)

Tab.1Grouping and dosing regimen after AA rats model succeed(n=8)

GroupsDoseAdministereddays(d)RouteofadministrationFrequencyofadministrationNormalNS1ml/kg15EnterocoeliaEveryotherdayModelNS1ml/kg15EnterocoeliaEveryotherdayIL-105μg/kg15EnterocoeliaEveryotherdayMTX1mg/kg15EnterocoeliaEveryotherdayJoint3μg/kgIL-10+1mg/kgMTX15EnterocoeliaEveryotherday

2結果

2.1大鼠佐劑性關節(jié)炎模型結果

2.1.1實驗大鼠體重變化如表2所示，AA大鼠模型組發(fā)生了體重減輕，而正常對照組大鼠體重隨飼養(yǎng)時間的增加逐漸在增加，各治療組小鼠的體重和模型對照組相比較明顯的增加，說明治療組能夠減輕佐劑性關節(jié)炎所引起的體重減輕。

2.1.2AA大鼠足腫脹度結果模型組大鼠于注射弗氏完全佐劑24 h后注射側開始出現(xiàn)輕、中度紅腫，第14天注射側足腫脹度達到高峰，在第21天檢測注射側足腫脹度與第14天相比出現(xiàn)了下降，但是在第20天加強免疫后，第28天檢測時足腫脹度又達到高峰。對照組未出現(xiàn)上述表現(xiàn)。在造模35 d過程中，模型組大鼠足腫脹度與正常對照組比較明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，結果見圖1。

2.1.3實驗大鼠關節(jié)炎指數(shù)在造模35 d觀察過程中，模型組大鼠與正常對照組比較，造模14 d后，大鼠主要表現(xiàn)為原發(fā)側關節(jié)炎指數(shù)變化明顯增加，出現(xiàn)關節(jié)紅腫變化。造模14 d后關節(jié)炎指數(shù)均大于6，結果見圖2，說明造模成功。

2.1.4AA大鼠模型關節(jié)滑膜病理學變化滑膜組織切片，經HE染色，顯微鏡下觀察組織病理改變。結果顯示：正常組大鼠滑膜組織主要由疏松結締組織組成，表面可見滑膜絨毛，結構正常，無炎性細胞浸潤。AA大鼠模型組滑膜組織血管增生充血，可見大量淋巴細胞、巨噬細胞及嗜酸性細胞等慢性炎細胞浸潤，但關節(jié)軟骨未見明顯破壞，結果見圖3。

GroupsBodyweight(g)Modelingago(0d)Aftertreatment(45d)Numberofweightchange(g)Normalgroup189.12±2.64250.15±6.7361.24±6.73Modelgroup186.16±3.18189.12±2.361)3.10±3.361)IL-10group190.50±2.89245.60±5.002)55.08±5.042)MTXgroup187.14±2.48239.26±4.322)42.60±3.322)Jointgroup186.51±3.47245.23±2.412)58.50±3.412)

Note：Compared with normal group,1)P<0.05；compared with model group ，2)P<0.05.

2.2各治療組對AA大鼠血清中IL-1β、TNF-α的影響模型組的大鼠血清中IL-1β、TNF-α含量明顯升高，與正常對照組相比差異顯著(P<0.05)，說明這兩種細胞因子對佐劑關節(jié)炎大鼠發(fā)揮重要的致炎作用，各治療組與模型組相比血清中IL-1β、TNF-α含量明顯下降，說明各治療組對佐劑性關節(jié)炎大鼠血清中IL-1β、TNF-α有一定的抑制作用。經組間比較發(fā)現(xiàn)聯(lián)合用藥組IL-1β、TNF-α水平下降最多，與IL-10組和MTX組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，MTX組的治療效果優(yōu)于IL-10組(P<0.05)，聯(lián)合用藥組的治療效果最好。見表3。

圖1　AA大鼠造模后足腫脹度的變化Fig.1　Changes swelling of paw on AA rats modelNote: Compared with model group,*.P<0.05.

圖2　AA大鼠關節(jié)炎指數(shù)的變化Fig.2　Result of arthritis index on AA rats model

圖3　正常組和模型組大鼠關節(jié)滑膜組織病理結果(HE ×400)Fig.3　Synovial tissue of histopathological change in control group and model group(HE ×400)Note: A.The synovial tissue of the normal group;B.Obvious inflammatory cell infiltrate in the synovial tissue of the model group.

GroupsIL-1β(ng/L)TNF-α(ng/L)Normalgroup48.01±9.541)62.56±8.451)Modelgroup272.77±8.26407.16±8.67IL-10group133.02±9.951)258.10±9.681)MTXgroup118.87±7.081)2)127.16±7.671)2)Jointgroup64.95±6.571)2)3)101.21±6.521)2)3)

Note：Compared with model group,1)P<0.05，Compared with IL-10 group,2)P<0.05， Compard with MTX group,3)P<0.05.

圖4　AA大鼠足關節(jié)X線影像學評分結果Fig.4　Score of X-ray imaging observation on paws of AA ratsNote: Compared with model group,*.P<0.05.

2.3AA大鼠X線影像學結果根據X線影像結果，按照骨侵蝕評分指標相對進行量化比較，骨侵蝕評分MTX、聯(lián)合組分別與模型組比較，P<0.05有統(tǒng)計學差異，結果見圖4。

3討論

隨著對RA發(fā)病機制的不斷深入研究，由免疫系統(tǒng)過量產生多種細胞因子在RA的發(fā)病機理中起重要作用。其中由單核-巨噬細胞分泌的細胞因子IL-1β、TNF-α在RA發(fā)病過程中起到了非常重要的作用。IL-1β是RA發(fā)病過程中的主要促炎細胞因子，在類風濕性關節(jié)炎損傷關節(jié)的過程中，它改變軟骨細胞合成代謝，通過刺激軟骨細胞來增強誘導MAPKs的信號傳導途徑，最終導致了許多炎性介質包括基質金屬蛋白酶(MMP)的表達，如MMP-1、 MMP-3、MMP-13和蛋白聚糖酶表達上調，NO、PGE2和環(huán)氧合酶-2(COX-2)等合成增加[8]。大量的研究也證實， IL-1β在人的類風濕性關節(jié)炎中的關節(jié)軟骨、滑膜細胞、軟骨細胞中被發(fā)現(xiàn)。因此，IL-1β與類風濕性關節(jié)炎有密切的關系，被認為是導致關節(jié)軟骨變性的關鍵細胞因子。研究發(fā)現(xiàn)在佐劑性關節(jié)炎模型中早期階段的特征是一種全身性TNF-α水平含量的增加，TNF-α被認為是在炎性疾病中發(fā)揮主導作用的細胞因子，它能通過激活血管內皮細胞，使其黏附分子的表達增加，在關節(jié)發(fā)生炎癥時，血液中的白細胞正是通過與黏附分子相互作用被匯集到關節(jié)腔；刺激產生多種小分子炎性遞質，如前列腺素等；同時通過直接刺激滑膜細胞和軟骨細胞產生基質金屬蛋白酶，導致骨和軟骨的破壞。我們的研究結果顯示：各治療組與模型組相比血清中TNF-α含量明顯下降，其中重組hIL-10組的抗炎作用較MTX組和聯(lián)合用藥組弱，聯(lián)合用藥組和MTX組具有較好的抗炎作用，能有效降低血清中TNF-α含量，其中聯(lián)合用藥組的效果最好。結果表明重組hIL-10在AA大鼠模型中有一定的抗炎作用，目前大量研究也證實IL-10是在RA發(fā)病過程中起保護作用的重要細胞因子。其治療類風濕性關節(jié)炎的機制可能是IL-10可抑制MMPs產生及IL-1、IL-6、IL-8和TNF-α的釋放，并促進IL-1RA和可溶性TNF受體的產生，抑制T細胞的增殖。通過對血清中細胞因子IL-1β、TNF-α分泌水平產生明顯的抑制作用，從而阻止滑膜成纖維細胞的過度增殖，在細胞因子網絡水平上發(fā)揮免疫調控作用達到抗類風濕關節(jié)炎的目的。本文實驗結果表明，本研究在AA大鼠藥物治療15 d后，AA大鼠血清中IL-1β、TNF-α分泌水平發(fā)生不同程度的降低。各治療組組間比較，聯(lián)合組能明顯抑制IL-1β、TNF-α在血清中的含量水平，和MTX組和IL-10組對比有顯著性差異，對調節(jié)IL-1β、TNF-α分泌水平的效果最好。說明聯(lián)合用藥組能有效減少AA大鼠血清中IL-1β、TNF-α的含量水平，從而起到減輕關節(jié)炎的作用。

在骨關節(jié)炎疾病中，X射線對骨關節(jié)的照片分析，仍然是臨床和實驗中常用于評估疾病進展的重要指標方法[10，11]，本研究在AA大鼠藥物治療15 d后，MTX組、IL-10組及兩者聯(lián)合組的關節(jié)病變與模型組比較，病變程度有所減輕，X線影像顯示治療后骨侵蝕評分降低，關節(jié)面損傷有一定程度改善，藥物治療前后在軟組織腫脹、骨侵蝕的評分方面看到相同的規(guī)律，以聯(lián)合用藥組的治療效果最明顯。

甲氨蝶呤是目前治療RA首選的緩解病情藥物，也是聯(lián)合治療方案中最基礎的藥物。根據類風濕關節(jié)炎RA新的分類標準及其方法學的推薦意見[12，13]，一旦診斷明確，主張早期應用MTX，或以此為基礎進行聯(lián)合治療。本研究中使用甲氨蝶呤做對照組，結果具有可比性。本實驗結果顯示重組hIL-10聯(lián)合MTX治療AA大鼠后的各項指標都優(yōu)于單用MTX組，說明生物制劑hIL-10與化療藥MTX聯(lián)合有一定的優(yōu)勢，為進一步探討生物制劑重組hIL-10聯(lián)合化學藥物MTX治療RA提供實驗基礎數(shù)據。

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[收稿2015-08-25修回2015-10-15]

(編輯倪鵬)

Effect of recombinant hIL-10 plus MTX on change of IL-1β，TNF-α level and medical imaging of an AA rat model

DULian-Feng，CHENKun-Tao，DINGLi-Min，TANGYan-Li，SUNWan-Bang.

ZunyiMedicalCollegeCampusinZhuhai/GraduateEducationandInnovationBaseofImmunologyinGuizhouProvince，Zhuhai519041，China

[Abstract]Objective:Adjuvant arthritis(AA)rats interfered with recombinant hIL-10,methotrexate(MTX)and IL-10 plus MTX separately,we detected the changes of IL-1β and TNF-α in rat′s serum.Methods: AA rats after interfered with recombinant hIL-10,MTX and IL-10 plus MTX.The levels of IL-1β，TNF-α in serum of rats were measured by ELISA method.with radiological examination to evaluate the degree of AA paw joint damage.Results: Compared to normal control group,the IL-1β，TNF-α of treatment group was significantly decreased,there was a significant differences compared with control group(P<0.05),The Combination group had significant difference compared with MTX group and IL-10 group，radiological examinations showed IL-1β,TNF-α levels and degree of AA paw joint damage were positive correlation,the combination group therapy bone erosion score lowest.Conclusion: Marked alteration in the serum level of IL-1β,TNF-α on Each treatment group of adjuvant arthritis in rats,these alterations of cytokine levels were associated with significant radiological changes of the joints.The combined group can effectively reduce levels of IL-1β,TNF-α and improve therapeutic effect of paw joint injury in AA rats.

[Key words]Recombinant hIL-10；Adjuvant arthritis；IL-1β；TNF-α

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2016.05.004

作者簡介：杜聯(lián)峰(1976年-)，男，碩士，副教授，主要從事分子免疫學研究，E-mail：8wy149842@163.com。

中圖分類號R392.31

文獻標志碼A

文章編號1000-484X(2016)05-0624-05

①本文受貴州省教育廳自然科學項目(2008032)資助。

②通訊作者，E-mail:sunwb7224@sina.com。