p21蛋白激活激酶4在三陰乳腺癌增殖中的作用及機制研究①

王子航　陳麗艷　米旭光

(延邊大學臨床學院，延吉133002)

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p21蛋白激活激酶4在三陰乳腺癌增殖中的作用及機制研究①

王子航陳麗艷②米旭光③

(延邊大學臨床學院，延吉133002)

[摘要]目的：探討p21蛋白激活激酶4(PAK4)在三陰乳腺癌細胞增殖存活中的作用機制。方法：在三陰乳腺癌BT549和MDA-MB-231細胞中轉染PAK4干擾載體，熒光定量法和免疫印跡分析檢測PAK4 mRNA和蛋白質表達量變化；MTT法檢測轉染PAK4干擾載體對三陰乳腺癌細胞存活率的影響；細胞周期分析檢測，轉染PAK4干擾載體對三陰乳腺癌細胞細胞周期的影響；免疫印跡分析，轉染PAK4干擾載體對三陰乳腺癌細胞對細胞信號通路的影響。結果：干擾內源PAK4表達后，三陰乳腺癌BT549和MDA-MB-231細胞的增殖率分別下降(36.51±4.24)%和(38.54±5.43)%，G0/G1期細胞所占比例顯著增加到(66.40±2.82)%和(72.01±3.13)%，ERK1/2磷酸化顯著降低；ERK通路抑制劑PD98059處理后，三陰乳腺癌BT549細胞的增殖率顯著下降(46.41±7.16)%。結論：PAK4在三陰乳腺癌增殖中發揮關鍵作用，其促增殖作用是通過ERK通路實現的。

[關鍵詞]三陰乳腺癌；PAK4；增殖；ERK

三陰乳腺癌具有侵襲性強、進展快、生存時間短的臨床特點[1]，并且雌激素受體、孕激素受體和人表皮生長因子受體2在三陰乳腺癌中表達均為陰性[2]，因此內分泌治療和分子靶向治療無效，化療是其主要的治療手段，僅約20%的三陰乳腺癌患者對化療敏感[3]。由此可見，三陰乳腺癌預后較差可能與其缺乏有效的治療手段有關，因此針對三陰乳腺癌治療的新靶點尋找及相應藥物的開發顯得尤為重要。本文旨在探討PAK4作為三陰乳腺癌細胞治療靶點的可能性及相應的抑癌機制。

1材料與方法

1.1主要實驗試劑耗材細胞周期與細胞凋亡檢測試劑盒(碧云天生物技術研究所，中國)、Lipofecta-mineTM2000(Life Technologies公司，美國)、PVDF膜(Millipore，德國)、鼠抗PAK4、GAPDH和HRP標記羊抗鼠二抗(CST，美國)、pRNAT-U6.1/Hygro-PAK4干擾載體為本實驗室構建、MTT(Sigma-Aldrich公司，美國)、SYBR GREEN Master mix(Roche，瑞典)、其他常規試劑(北京化工，中國)。

1.2方法

1.2.1細胞培養三陰乳腺癌MDA-MB-231細胞、BT549細胞，含10%新生牛血清(四季青生物公司，中國)的DMEM培養基(Invitrogen，USA)，添加含青霉素 100 U/ml，鏈霉素 100 μg/ml)，37℃5%CO2條件下培養， 細胞生長至對數期時傳代。

1.2.2細胞的轉染(脂質體法)在轉染前24 h，1×106/孔在6孔細胞培養板中接種細胞。轉染前將細胞培養液換成不含抗生素不含血清的不完全培養液。將待轉染質粒按說明書加入到250 μl無雙抗血清培養液中，吹打混勻。同時，將5～10 μl脂質體加入到250 μl無雙抗血清培養液中，吹打混勻。室溫靜置5 min后，將兩者混勻。室溫孵育20 min后，將混合液加入到待轉孔中并混勻。培養5 h后，將細胞培養液換成完全培養液。

1.2.3免疫印跡分析提取細胞總蛋白后，進行常規SDS-PAGE電泳轉膜，TBST配制的脫脂奶粉封閉液封閉24 h，標記鼠抗PAK4一抗(1∶1 000)室溫1.5 h，TBST清洗3次，標記HRP標記羊抗鼠二抗(1∶1 000)，TBST清洗3次，ECL顯影。

1.2.4熒光定量分析以Trizol法提取細胞RNA，逆轉錄成cDNA，以SYBR熒光染料定量檢測PAK4表達量。根據試劑說明書添加各組分后，95℃預變性30 s，然后40循環的擴增反應(95℃ 5 s，60℃ 34 s)，同時融解曲線分析。結果與內參β-actin作比表示mRNA拷貝數。定量檢測引物序列：PAK4-F：5′-TCCCCCTGAGCCATTGTG-3′，PAK4-R:5′-TGACC-TGTCT CCCCA TCCA-3′；β-actin-F：5′-CCAACCGTGAAAAG-3′，β-actin-R：5′-GGCATACAGGGACA-3′。

1.2.5細胞增殖分析將處于生長對數期的細胞消化成單細胞懸液，以0.5×104～1×104個細胞/孔接種于96孔細胞培養板中。過夜培養后，更換新鮮培養基，每孔100 μl。按轉染方法向細胞中加入脂質體-待轉質粒混合物，每組設三個復孔，同時設對照組，5 h后更換培養基。培養48 h后，每孔加入20 μl MTT溶液(MTT濃度為5 μg/ml的PBS溶液)，37℃避光培養4 h后，移除培養液，每孔加入100 μl DMSO，水平振蕩10 min，放入酶標儀中檢測波長570 nm處的光吸收值。代入下述公式計算細胞存活率：細胞存活率(%)=(實驗組吸光值-空白孔吸光值)/(對照組吸光值-空白孔吸光值)×100%。實驗獨立重復三次后，將各轉染組的細胞存活率導入SPSS軟件，計算P值。

1.2.6細胞周期分析將PBS清洗過的待測細胞收集到15 ml尖底離心管中，1 000 r/min離心5 min。棄上清液后用70%乙醇重懸細胞，4℃固定24 h。1 000 r/min離心5 min，移除固定液，加入PI染液，重懸細胞。室溫避光30 min后用流式細胞儀進行細胞周期分析。

2結果

2.1干擾PAK4表達抑制三陰乳腺癌細胞增殖在三陰乳腺癌BT549和MDA-MB-231細胞中，轉染PAK4干擾載體24 h后，分別通過熒光定量和免疫印跡分析PAK4 mRNA和蛋白質表達量變化，PAK4 mRNA(圖1A)和蛋白質(圖1B)表達量均顯著降低(P<0.01)。干擾內源PAK4表達后，三陰乳腺癌BT549和MDA-MB-231細胞的增殖率分別下降(36.51±4.24)%(圖2A)和(38.54±5.43)%(圖2B)，均顯著低于對照組(P<0.01)。

2.2干擾PAK4表達對三陰乳腺癌細胞周期的影響轉染PAK4干擾載體24 h后，對三陰乳腺癌BT549和MDA-MB-231細胞的細胞周期進行檢測。PAK4干擾組G0/G1期細胞所占比例為(66.40±2.82)%和(72.01±3.13)%，與對照組(49.35±0.95)%和(51.89±0.96)%相比均顯著上升(圖3)，P<0.01，說明抑制PAK4表達可以將三陰乳腺癌細胞阻滯在G0/G1期。

2.3干擾PAK4表達抑制三陰乳腺癌細胞增殖的分子機制有研究顯示PAK4通過激活MEK，進而促進ERK1/2的磷酸化。因此我們在三陰乳腺癌BT549細胞中，轉染PAK4干擾載體24 h后，檢測p-ERK1/2表達變化，與對照相比PAK4干擾組p-ERK1/2 表達顯著降低(圖4A)；進一步，應用MEK激酶MEK1和MEK2的高效選擇性抑制劑PD98059處理后，三陰乳腺癌BT549細胞的增殖率下降(46.41±7.16)%(圖4B)，與對照組差異顯著，P<0.01。

圖1　PAK4在三陰乳腺癌BT549和MDA-MB-231細胞中表達量Fig.1　Expression of PAK4 in BT549 and MDA-MB-231 cell after PAK4 knockdownNote: mRNA(A)and protein(B)expression of PAK4 in BT549 and MDA-MB-231 cells transfected with siRNA(si-PAK4)or control siRNA(NC),*.P<0.01.

圖2　干擾PAK4表達抑制三陰乳腺癌細胞增殖Fig.2　PAK4 knockdown suppressed proliferation of breast cancerNote: A.BT549 cells；B.MDA-MB-231 cells;*.P<0.01.

圖3　干擾PAK4表達對三陰乳腺癌細胞周期的影響Fig.3　Cell-cycle(G0/G1,S and G2/M)analysis of breast cancer after PAK4 knockdownNote: A.BT549 cells；B.MDA-MB-231 cells.*.P<0.01.

圖4　干擾PAK4表達抑制三陰乳腺癌細胞增殖的分子機制Fig.4　Mechanism of inhibition effect of PAK4 knockd-own in TNBC cellsNote: A.Protein expression of p-ERK1/2 in BT549 cells transfected with siRNA(si-PAK4)or control siRNA(NC).B.PD98059 suppressed the proliferation of BT549 cells,*.P<0.05

3討論

乳腺癌發病率位居大城市女性腫瘤的第一位，并且其死亡率也增長迅速，目前乳腺癌已成為對婦女健康威脅最大的疾病[4]。隨著乳腺癌分子生物研究的深入，開發了針對不同分子分型的乳腺癌的分子靶向藥物，其臨床應用大大提高了乳腺癌的治療效果。目前臨床以雌激素受體、孕激素受體、人表皮生長因子受體2及Ki67將乳腺癌分成4種亞型，采用不同治療策略，取得了良好的治療效果。主要手段是針對雌激素受體、孕激素受體陽性采用內分泌治療[5]；人表皮生長因子受體2陽性，采用抗HER2的分子靶向治療[6]。然而，三者均為陰性的乳腺癌，內分泌治療和分子靶向治療均無效，主要治療手段是化療，但其臨床特點為分級高、侵襲性強和進展快，又缺乏有效治療手段，預后較差[3]。目前，三陰乳腺癌新治療靶點為國內外研究熱點，如表皮生長因子受體及趨化因子受體抑制劑的開發[7,8]，但仍存在較多問題，所以新型靶點的開發對三陰乳腺癌未來的治療策略具有重要意義。

p21蛋白激活激酶(PAK)為一類保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，目前被認為在腫瘤細胞信號調控網中發揮關鍵作用[9]。PAK4是Ⅱ類PAK中最具有代表性的成員，其N末端不含自我抑制域(AID)[10]。PAK4在多數組織中具有表達，并且在多種腫瘤細胞系中過表達。在正常乳腺組織中低水平表達，在大多數乳腺癌中異常高表達，促進了乳腺腫瘤惡性進展，與腫瘤發生的多種標志現象密切相關，如非停泊性生長、促進腫瘤細胞存活、轉移和侵襲等[11]。最新報道顯示PAK4高表達是乳腺腫瘤細胞惡性轉化的關鍵基因，還是上皮來源乳腺癌去腺泡樣等上皮特征的原因，但是其在三陰乳腺癌中的作用機制尚不明確[12]。因此，本研究首先選擇了三陰乳腺細胞株MDA-MB-231和BT549細胞，轉染了PAK4的SiRNA干擾載體，抑制了細胞內源的PAK4表達，通過熒光定量和免疫印跡分析PAK4 mRNA和蛋白質表達量均顯著降低(圖1)。MTT分析發現，干擾內源PAK4表達顯著抑制三陰乳腺癌BT549和MDA-MB-231細胞的增殖(圖2)，說明PAK4在三陰乳腺癌細胞的增殖存活中發揮重要作用。進一步，通過流式細胞術分析發現PAK4被抑制表達后，三陰乳腺癌細胞被阻滯在G0/G1期，細胞周期進程停滯(圖3)。有研究顯示PAK4通過激活ERK通路發揮促增殖作用[13]。因此，利用免疫印跡檢測p-ERK1/2表達量發現，干擾PAK4表達被抑制ERK通路的激活(圖4A)。但是，PAK4是否通過ERK通路在三陰乳腺癌細胞中發揮促增殖作用。我們進一步利用ERK通路激活抑制劑PD98059處理三陰乳腺癌細胞后發現，增殖同樣受到抑制(圖4B)。這些結果說明PAK4通過激活ERK通路，在三陰乳腺癌細胞增殖中發揮關鍵作用，抑制內源PAK4表達，可以抑制三陰乳腺癌增殖，這也提示PAK4可能是三陰乳腺癌治療的新靶點，針對PAK4表達的抑制劑可能具有抑制三陰乳腺癌的臨床價值。

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[收稿2016-01-20修回2016-02-19]

(編輯許四平)

Effect of PAK4 on cell proliferation of TNBC cells

WANGZi-Hang,CHENLi-Yan,MIXu-Guang.

YanbianUniversityMedicalCollege,Yanji133002,China

[Abstract]Objective:To analyze the mechanism of p21 Protein Activated Kinase 4(PAK4)on cell proliferation of triple negative breast cancer(TNBC)cells.Methods: The mRNA and protein expression of PAK4 was detected by qRT-PCR and western blot in TNBC cells transfected with siRNA PAK4;The proliferation of TNBC cells transfected with PAK4 Si were analysed by MTT assay;The related signaling pathways was detected by western blot in TNBC cells transfected with siRNA PAK4.Results: PAK4 knockdown could suppress the proliferation of BT549 and MDA-MB-231 cells.Comparing with normal control,the proliferation rate were down to(36.51±4.24)% and(38.54±5.43)%,the present of G0/G1 phase cells were uPto(66.40±2.82)% and(72.01±3.13)% and the expression of p-ERK1/2 was reduced.Treated with PD98059,ERK pathway inhibitor,the proliferation rate of BT549 cells were down to(46.41±7.16)%.Conclusion: PAK4 plays a key role in the proliferation of TNBC,and its promoting proliferation effect associated with activating ERK pathway.

[Key words]TNBC;p21 Protein Activated Kinase 4;Proliferation;ERK

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2016.05.007

作者簡介：王子航(1994年-)，男，臨床醫學專業2012級本科，主要從事抗腫瘤機制的研究，E-mail:1456825616@qq.com。通訊作者及指導教師：陳麗艷(1974年-)，女，博士，教授，主要從事腫瘤分子病理學的研究，E-mail:lychen@ybu.edu.cn。

中圖分類號R735.7

文獻標志碼A

文章編號1000-484X(2016)05-0636-04

①本文為吉林省科技廳青年基金項目(No. 20150520047JH)。

②延邊大學醫學院生物化學與分子生物學教研室，延吉133002。

③吉林省人民醫院醫學診治實驗中心，長春130021。