microRNA-130b在結腸癌中的表達及生物學意義研究

易　敏　王　嶸　沈婷婷

(青海省第五人民醫院病理科，西寧810007)

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microRNA-130b在結腸癌中的表達及生物學意義研究

易敏王嶸①沈婷婷

(青海省第五人民醫院病理科，西寧810007)

[摘要]目的：研究微小RNA 130b(microRNA-130b，miR-130b)在結腸癌(Colonic carcinoma，CRC)中的表達情況及生物學意義。方法：收集2013年1月至2015年3月于我院普通外科行手術切除的CRC組織及對應癌旁組織共60例，運用qRT-PCR技術檢測miR-130b在CRC組織及癌旁組織中的表達水平，統計分析miR-130b表達水平與患者臨床病理資料間的相關性；采用人工合成的miR-130b模擬物轉染人結腸癌SW480細胞，分別采用CCK-8分析、BrdU檢測轉染后細胞增殖變化，流式細胞儀及Caspase3/7活性分析檢測轉染后細胞凋亡變化。結果：miR-130b在CRC組織中表達水平顯著高于對應癌旁組織(P<0.05)；miR-130b高表達與腫瘤體積增大(≥5 cm，P<0.05)及高TNM分期(Ⅲ+Ⅳ期，P<0.05)顯著相關；在人結腸癌SW480細胞中過表達miR-130b可顯著抑制細胞增殖并促進細胞凋亡(P<0.05)。結論：miR-130b在結腸癌組織中表達下調并與腫瘤惡性臨床病理特征有關，miR-130b可能通過抑制結腸癌細胞增殖、促進凋亡來抑制結腸癌的生長及發展。

[關鍵詞]MicroRNA-130b；結腸癌；增殖；凋亡

結腸癌是消化道最常見的惡性腫瘤[1]，其生物學惡性程度高，疾病進展快，早期診斷困難，極大地危害廣大人民群眾的身體健康。近年來，針對EGFR分子的西妥昔單抗[2]及針對VEGF分子的貝伐單抗[3]等分子靶向藥物在結腸癌的治療中呈現出巨大優勢。因而，尋找新的敏感而有效的腫瘤分子標志物成為提高我國結腸癌診治水平的關鍵方法之一。

MicroRNAs(miRNA)是一類短鏈的非編碼RNA，它能夠與靶基因的mRNA特異性結合進而降解mRNA單鏈或抑制其翻譯[4]。研究表明，結腸癌組織中存在多種miRNA的異常表達，如原癌性的miR-21在結腸癌組織中表達升高并與較晚的腫瘤臨床分期相關，體外實驗證實miR-21通過下調凋亡相關蛋白PDCD4(miR-21-ITGB4-PDCD4)來促進腫瘤抗凋亡作用[5]；而具有抑癌活性的miR-218可以通過降解BMI-1及CDK6等與腫瘤生長密切相關的分子來抑制腫瘤細胞增殖并促進其凋亡[6]。miR-130b已經被證實是一種重要的腫瘤調節基因，在多種人類惡性腫瘤中存在表達異常升高[7]，并與腫瘤增殖、凋亡等多種生物學行為密切相關[8]。但是，miR-130b在人結腸癌中的臨床病理意義及其具體分子機制尚不清楚。本研究通過檢測miR-130b在結腸癌及對應癌旁組織中的表達情況及其對結腸癌細胞增殖、凋亡的調控作用，研究miR-130b在結腸癌發生、發展中的臨床意義作用機制，為結腸癌的診斷與治療提供新的分子靶點。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1臨床標本本課題經我院醫學倫理委員會批準審核后開展。收集2013年1月至2015年3月間于我院普通外科行手術切除的結腸癌及對應癌旁組織標本60例，其中男42例，女18例，年齡40～75歲，平均年齡(53.1±2.2)歲。所有入組患者術前均未接受放化療。標本于離體30 min內取材，分別置于液氮或4%多聚甲醛溶液中保存。

1.1.2主要試劑Trizol試劑及脂質體2000(Lipofecta mineTM2000)購自美國Invitrogen公司；miRcute miRNA第一鏈cDNA合成試劑盒(KR201)和miRcute miRNA熒光定量檢測試劑盒(FP401)均購自北京天根生化科技有限公司；人結腸癌SW480細胞及正常人結腸FHC細胞購自中科院上海生物化學與細胞生物研究所；DMEM培養基及胎牛血清均購自美國Gibico公司；miR-130b特異性逆轉錄引物、RNU6B引物、人工合成的miR-130b抑制物(miR-130b inhibitor)及陰性對照microRNA inhibitor均購自上海吉凱基因化學技術有限公司；CCK-8試劑盒購自日本DOJINDO公司；Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒購自美國Roche公司；BrdU細胞增殖檢測試劑盒購自美國CST公司(#6813)；Apo-ONE? Homogeneous Caspase-3/7檢測試劑盒購自美國Promega公司。

1.2方法

1.2.1qRT-PCR按說明書提取結腸癌及對應癌旁組織中的RNA。先按說明書進行Poly A加尾及逆轉錄反應，合成cDNA。以2uL cDNA配制Real-time PCR體系，按如下條件進行PCR反應：預變性 94℃ 2 min,變性94℃ 20s,退火延伸 60℃ 34s,擴增40個循環。以RNU6B基因為內參，采用2-△△Ct法計算miR-130b相對表達量。每個樣本獨立重復實驗3次。

1.2.2細胞培養SW480及FHC細胞株培養于含10%胎牛血清的1×DMEM培養基中，置于37℃、5% CO2、飽和濕度下進行培養。每2～4日傳代一次，穩定傳代2～3代后，取對數生長期細胞進行實驗。

1.2.3細胞轉染SW480細胞接種于6孔板中，用含10% FBS的1×DMEM培養基培養細胞至融合度達50%左右，實驗分組及處理如下：實驗組每孔加入100 pmol miR-130b inhibitor及5 μl轉染試劑；對照組每孔加入100 pmol陰性對照(Negative Control,NC) inhibitor及5 μl轉染試劑。每孔加入不含血清的1×DMEM培養基調整終體積至2 ml，置于37℃、5% CO2、飽和濕度下培養6 h后，更換完全培養基繼續培養。獨立重復實驗3次。

1.2.4CCK-8細胞活性分析分別收集轉染0、24、48、72 h后的SW480細胞，用無血清的DMEM培養基調整細胞密度為1×105ml-1，以200 μl/孔接種于96孔板，每組設6個復孔及1個空白對照孔，置于培養箱中過夜。每孔加入10 μl CCK-8溶液，繼續孵育4 h，棄上清液，15 min內用酶標儀檢測450 nm波長下的光密度(OD)值。每個樣本獨立重復實驗3次。

1.2.5BrdU摻入試驗按試劑說明書分別配制1×洗脫緩沖液、1×檢測抗體溶液、1×HRP結合二抗溶液和10×BrdU溶液。將轉染miR-130b inhibitor的SW480細胞以5 000/孔種植于96孔板，培養箱孵育24 h，加入1/10體積培養基的10×BrdU溶液，培養箱孵育24 h后，以300 g離心10 min，棄培養基，加入100 μl/孔的固定變形溶液，室溫孵育30 min，移除固定液，加入100 μl/孔1×檢測抗體溶液，室溫孵育1 h，棄抗體檢測溶液，1×洗脫緩沖液沖洗平板3次。加入100 μl/孔=1×HRP結合二抗溶液，室溫孵育30 min，棄二抗工作液，1×洗脫緩沖液沖洗平板3次。加入100 μl TMB底物，室溫孵育30 min后加入100終止溶液。30 min內450 nm吸光度進行檢測。

1.2.6流式細胞儀檢測取轉染72 h后的SW480細胞，冷PBS溶液洗滌細胞2次，胰酶消化細胞，1 500 r/min離心5 min后棄去上清，1×Binding Buffer重懸細胞，調整細胞數為1×106ml后每管加入細胞懸液500 μl，再加入10 μl PI及5 μl Annexin V-FITC和10 μl PI檢測細胞凋亡?；靹蚝螅覝叵卤芄夥磻?0 min，進行流式細胞儀檢測。每組樣本獨立重復實驗3次。

1.2.7Caspase3/7活性分析將轉染72 h后的SW480細胞接種于96孔板，并設置3個空白孔。室溫解凍100×Caspase底物和Apo-ONE? Caspase-3/7緩沖液，渦旋混勻。取100 μl底物加入9 900 μl緩沖液中配置Apo-ONE? Caspase-3/7試劑。每孔加入100 μl Apo-ONE? Caspase-3/7試劑，搖床輕微混勻30 s。室溫孵育2 h，使用ELISA平板計數器測量490 nm細胞熒光強度。

2結果

2.1結腸癌組織及對應癌旁組織中miR-130b的相對表達量經qRT-PCR技術檢測，60例結腸癌組織中miR-130b的平均相對表達量為(6.643±0.201)，而對應癌旁組織中miR-130b的平均相對表達量為(2.337±0.057)。統計學檢驗證明，miR-130b在結腸癌組織中的表達顯著升高(P<0.05)。

圖1　miR-130b在結腸癌及對應癌旁組織中的表達Fig.1　Relative expression of miR-130b in CRC and tumor adjacent tissuesNote: *.P<0.05.

表1miR-130b表達與結腸癌患者臨床病理特征的關系(n=60)

Tab.1Clinical Correlation of miR-130b expression in CRC (n=60)

FeaturesClassificationmiR-130bexpressionlevelPAge<50year6.341±0.2110.337≥50year6.731±0.142GenderMale6.813±0.1210.408Female6.321±0.237Tumorvolume<5cm4.135±0.1070.0021)≥5cm8.137±0.132Numberofnodules16.641±0.2410.407≥26.801±0.172HistopathologicalG1～G26.217±0.1070.073GradeG36.791±0.129LymphaticNO5.398±0.0910.058MetastasisYES6.741±0.110Ⅰ～Ⅱ4.703±0.1020.0031)TNMstageⅢ～Ⅳ7.714±0.121

Note：1)P<0.05

2.2miR-130b表達與結腸癌臨床病理特征間的相關性分析將結腸癌中miR-130b的平均相對表達量與患者年齡、性別、腫瘤體積、腫瘤數量、組織學分級、有無淋巴結轉移及TNM分期等臨床病理資料間的相關性進行統計學分析。統計學結果表明，結腸癌組織中miR-130b高表達與腫瘤體積增大(≥5 cm)及高TNM分期(Ⅲ+Ⅳ期)呈正相關(P<0.05)，提示腫瘤組織中高表達的miR-130b可能影響腫瘤的生長及轉移過程。

2.3下調結腸癌細胞中miR-130b的表達通過qRT-PCR分別檢測結腸癌細胞SW480及正常結腸上皮細胞FHC中ZNF217的表達水平。結果發現，SW480中miR-130b的表達量均較FHC細胞顯著升高(P<0.05，圖2A)。我們在SW480細胞中轉染入miR-130b抑制物(miR-130b inhibitor)，qRT-PCR檢測證實miR-130b inhibitor可顯著下調SW480細胞中miR-130b的表達水平(P<0.05，圖2B)。

2.4下調miR-130b抑制SW480細胞增殖為研究抑制miR-130b表達對SW480增殖能力的影響，首先采用CCK-8法檢測轉染miR-130b inhibitor后24、48及72 h SW480細胞活力的變化，結果如圖3A所示，與NC組相比，轉染miR-130b inhibitor后可顯著降低SW480細胞活力(P<0.05)。然后，我們將BrdU摻入轉染細胞中，通過細胞免疫熒光染色，酶標儀分析發現miR-130b inhibitor轉染后SW480細胞DNA合成能力顯著降低[(117.290±7.541)vs(43.716±5.071)，P<0.05，圖3B]，提示細胞增殖受到抑制。

2.5下調miR-130b促進SW480細胞凋亡腫瘤生長是細胞增殖和細胞凋亡共同作用的過程，因而，我們進一步通過流式細胞儀檢測下調miR-130b表達對SW480細胞凋亡的作用。結果證實，在miR-130b inhibitor轉染72 h后，miR-130b組細胞凋亡比例較NC組顯著升高[(12.214±2.073)vs(28.974±2.805)，P<0.05,圖4A、B]。Caspase3/7活性分析結果顯示，下調miR-130b表達后SW480細胞內凋亡相關的酶活性顯著增強[(115.718±11.314)vs(217.235±20.083)，P<0.05，圖4C]。

圖2　miR-130b inhibitor下調結腸癌細胞中miR-130b的表達水平Fig.2　miR-130b inhibitor down-regulated miR-130b expressionNote: A.Relative expression of miR-130b in FHC and SW480 cells；B.miR-130b inhibitor down-regulated miR-130b expression in SW480 cells.

圖3　下調miR-130b抑制SW480細胞增殖能力Fig.3　Down-regulation of miR-130b inhibited SW480 cell proliferationNote: A.Down-regulation of miR-130b inhibited cell viability in SW480 cells (*.P<0.05)；B.Down-regulation of miR-130b inhibited DNA synthesis in SW480 cells (*.P<0.05).

圖4　下調miR-130b對SW480細胞凋亡能力的影響Fig.4　Down-regulation of miR-130b enhanced SW480 cell apoptosisNote: A.Down-regulation of miR-130b increased cell apoptosis in SW480 cells (*.P<0.05)；B:Down-regulation of miR-130b enhanced Caspase 3/7 activity in SW480 cells (*.P<0.05).

3討論

結腸癌是最常見的消化道腫瘤之一，國最新癌癥5年生存率調查報告指出，結腸癌的5年生存率僅為47.2%[9]。目前，根治性手術及術后規范放、化療是治療結腸癌的主要方法[10]，但結腸癌早期診斷困難、易發生淋巴及遠處轉移，常使患者就診時已失去根治性手術機會，對放化療敏感性的個體差異也是導致部分患者術后早期復發、轉移的主要原因。因而，尋找敏感而有效的結腸癌分子標志物及生物治療靶點，成為提高結腸癌診療水平的重要方法之一。

結腸癌組織中存在大量microRNA異常表達，并在腫瘤的發生、發展中發揮重要作用[11]。例如，miR-218在結腸癌組織及細胞系中表達量均顯著降低，體外過表達miR-218可通過抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路的激活而顯著抑制結腸癌細胞的遷移及侵襲能力[12]；而結腸癌組織中處于高表達狀態的miR-191能夠通過抑制轉錄因子—正CCAAT/增強子結合蛋白β(CCAAT/Enhancer binding protein beta，C/EBP β) 的表達而促進細胞增殖和對5-Fu的化療抵抗作用[13]。本課題通過研究證實，miR-130b在結腸癌組織中的表達水平顯著高于對應癌旁組織，并且其高表達狀態與腫瘤體積增大及高TNM分期等惡性臨床病理特征密切相關。提示miR-130b在結腸癌生長中具有重要的調控作用。為了進一步證實miR-130b對結腸癌細胞的生長調控作用，應用人工合成的miR-130b抑制物在人結腸癌SW480細胞中下調miR-130b的表達水平，通過CCK-8分析及BrdU結合試驗證實了下調miR-130b的表達能夠有效抑制腫瘤細胞的增殖能力。流式細胞儀分析表明抑制miR-130b表達后，發生凋亡的腫瘤細胞比例顯著提高；同時，細胞內凋亡相關酶caspase3/7的活性也顯著增強。上述結果一致表明，miR-130b對結腸癌的生長具有一定的促進作用。

作為一種重要的原癌性microRNA，miR-130b可通過下調腫瘤中多個抑癌基因的表達水平來發揮促腫瘤作用，如在肝細胞癌中下調過氧化物酶體增殖物激活受體γ(Peroxisome proliferator-activated receptor γ，PPAR-γ)的表達來促進肝癌細胞侵襲[14]，在卵巢癌中下調多耐藥基因1(Multidrug resistance 1，MDR1)的轉錄而誘導其對紫杉醇和順鉑耐藥[15]等。值得注意的是，在前列腺癌中，miR-130b卻呈現低表達狀態，并且，在體外過表達miR-130b能夠通過下調基質金屬蛋白酶2(Matrix met allopeptidase 2，MMP2)來抑制腫瘤的轉移。可見，miR-130b作為一種潛在的靶向治療分子，其組織特異性和多靶點性對腫瘤個體化治療提出了更高的要求。

總之，miR-130b在結腸癌組織中高表達，并且與腫瘤生長等惡性臨床病理特征明顯相關，下調

結腸癌細胞中miR-130b的表達能夠顯著抑制細胞增殖并促進其凋亡。因而，miR-130b作為一種潛在的靶向治療分子在結腸癌的生物治療中具有重要臨床意義。

參考文獻：

[1]Keenan JE,Speicher PJ,Thacker JK,etal.The preventive surgical site infection bundle in colorectal surgery:an effective approach to surgical site infection reduction and health care cost savings[J].JAMA Surg,2014,149 (10):1045-1052.

[2]Zhang X,Xu J,Liu H,etal.Predictive biomarkers for the efficacy of cetuximab combined with cisplatin and capecitabine in advanced gastric or esophagogastric junction adenocarcinoma:a prospective multicenter phase 2 trial[J].Med Oncol,2014,31 (10):226.

[3]Han K,Jin J,Maia M,etal.Lower exposure and faster clearance of bevacizumab in gastric cancer and the impact of patient variables:analysis of individual data from AVAGAST phase III trial[J].AAPS J,2014,16 (5):1056-1063.

[4]Dvinge H,Git A,Graf S,etal.The shaping and functional consequences of the microRNA landscape in breast cancer[J].Nature,2013,497 (7449):378-382.

[5]Ferraro A,Kontos CK,Boni T,etal.Epigenetic regulation of miR-21 in colorectal cancer:ITGB4 as a novel miR-21 target and a three-gene network (miR-21-ITGBeta4-PDCD4) as predictor of metastatic tumor potential[J].Epigenetics,2014,9 (1):129-141.

[6]Tu K,Li C,Zheng X,etal.Prognostic significance of miR-218 in human hepatocellular carcinoma and its role in cell growth[J].Oncol Rep,2014,32 (4):1571-1577.

[7]Chang YY,Kuo WH,Hung JH,etal.Deregulated microRNAs in triple-negative breast cancer revealed by deep sequencing[J].Mol Cancer,2015,14 (1):36.

[8]Lin YH,Wu MH,Liao CJ,etal.Repression of microRNA-130b by thyroid hormone enhances cell motility[J].J Hepatol,2015，(62)：1328-1340.

[9]Zeng H,Zheng R,Guo Y,etal.Cancer survival in China,2003-2005:a population-based study[J].Int J Cancer,2015,136 (8):1921-1930.

[10]Loupakis F,Cremolini C,Masi G,etal.Initial therapy with FOLFOXIRI and bevacizumab for metastatic colorectal cancer[J].N Engl J Med,2014,371 (17):1609-1618.

[11]褚以忞,彭海霞,李吉,等.微小RNA-145調控c-myc表達對胃癌的影響[J].上海醫學,2014,37(11):953-956.

[12]Zhang X,Shi H,Tang H,etal.miR-218 inhibits the invasion and migration of colon cancer cells by targeting the PI3K/Akt/mTOR signaling pathway[J].Int J Mol Med,2015,35 (5):1301-1308.

[13]Zhang XF,Li KK,Gao L,etal.miR-191 promotes tumorigenesis of human colorectal cancer through targeting C/EBPbeta[J].Oncotarget,2015,6 (6):4144-4158.

[14]Tu K,Zheng X,Dou C,etal.MicroRNA-130b promotes cell aggressiveness by inhibiting peroxisome proliferator-activated receptor gamma in human hepatocellular carcinoma[J].Int J Mol Sci,2014,15 (11):20486-20499.

[15]Zong C,Wang J,Shi TM.MicroRNA 130b enhances drug resistance in human ovarian cancer cells[J].Tumour Biol,2014,35 (12):12151-12156.

[收稿2015-08-20修回2015-08-28]

(編輯許四平)

Expression and biological significance of microRNA-130b in human colonic carcinoma

YIMin,WANGRong,SHENTing-Ting.

TheFifthPeople′sHospitalofQinghaiProvince,Xining810007，China

[Abstract]Objective:To investigate the expression and biological significance of microRNA-130b in human colonic carcinoma(CRC).Methods: qRT-PCR was applied to detect the relative expression of miR-130b in 60 paired colonic carcinoma in comparison to the tumor adjacent tissues.Student-t test was used to analyze the relationship between the miR-130b expression and clinical features.We transfected the miR-130b inhibitor into SW480 cells,CCK-8 and BrdU incorporation assay were used to analyze cell proliferation,and flow cytometry and caspase3/7 activity assay were used to analyze cell apoptosis.Results: The relative expressions of miR-130b was significantly down-regulated in CRC tissues compared to those of the matched normal tumor-adjacent tissues(P<0.05).Low expression of miR-130b was significantly associated with large tumor size(≥5 cm,P<0.05) and advanced TNM stage(Ⅲ+Ⅳ,P<0.05).Overexpression of miR-130b in SW480 cells could significantly suppress cell proliferation and induce cell apoptosis(P<0.05).Conclusion: Low expression of miR-130b is related to the malignant clinicopathological features in CRC tissues,and miR-130b suppress colonic carcinoma growth and progression through inhibiting proliferation and enhancing apoptosis.

[Key words]MircoRNA-130b;Colonic carcinoma;Proliferation;Apoptosis

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2016.05.011

作者簡介：易敏(1975年-)，女，病理科主任，主要從事消化道腫瘤、乳腺腫瘤及婦科腫瘤的研究，E-mail:yimin359@163.com。

中圖分類號R735.3+5

文獻標志碼A

文章編號1000-484X(2016)05-0652-05

①青海省第五人民醫院腫瘤三科,西寧810007。