羧甲基茯苓多糖對腫瘤壞死因子-α調控體外Caco-2細胞系生物學特性的影響①

張金衛　盧　月　鐘曉琴　何鈺華　韓　凌

(廣州中醫藥大學第二附屬醫院/廣東省中醫藥科學院，廣州510006)

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羧甲基茯苓多糖對腫瘤壞死因子-α調控體外Caco-2細胞系生物學特性的影響①

張金衛盧月鐘曉琴何鈺華②韓凌

(廣州中醫藥大學第二附屬醫院/廣東省中醫藥科學院，廣州510006)

[摘要]目的：體外實驗研究羧甲基茯苓多糖(Carboxytmethylpachymaran, CMP)對腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-alpha,TNF-α)調控體外Caco-2細胞系生物學特性的影響，并初步探討其機理。方法：TNF-α誘導Caco-2細胞建立損傷模型，100 μg/ml CMP干預上述模型，分別從細胞單層跨膜電阻(TER)、酚紅透過率、緊密連接蛋白Claudin-1表達量以及分布方面評價造模情況和CMP干預情況。結果：TNF-α誘導Caco-2細胞TER明顯下降(P<0.01)，酚紅透過率明顯升高(P<0.01)，Claudin-1蛋白表達降低、Claudin-1蛋白分布毛糙、鋸齒樣改變、熒光強度變弱，提示造模成功； CMP干預后，TER明顯升高(P<0.01)，酚紅透過率明顯降低(P<0.01)，Claudin-1蛋白的表達量升高，Caudin蛋白的分布變得光滑、熒光強度增強。結論：CMP能夠有效的逆轉TNF-α調控的體外Caco-2細胞系生物學特性，可能與恢復Claudin-1蛋白表達和分布有關， CMP可能是治療炎癥性腸病的潛在有效藥物。

[關鍵詞]羧甲基茯苓多糖；腸道黏膜屏障；炎癥性腸病；緊密連接

炎癥性腸病(Inflammatory bowel disease,IBD)是由腸道黏膜免疫調節紊亂、腸道黏膜屏障異常、腸道持續感染、環境與遺傳等因素共同參與的病因、病機未完全闡明的非特異性反復發作性慢性腸道炎癥，包括潰瘍性結腸炎(Ulcerative colitis,UC)和克羅恩病(Crohn′s disease,CD)[1-5]。目前，仍沒有徹底治愈IBD的有效方法，尋找治療IBD的特效藥物一直是醫學界的研究熱點。茯苓，是多孔菌科真菌茯苓的干燥菌核，具有健脾除濕的功效，是“四君八珍”之一，臨床常用治療胃腸疾病，但其作用機理仍缺乏深入研究。茯苓的主要成分為茯苓多糖，包括β-茯苓聚糖、葡萄糖、蔗糖和果糖等。β-茯苓聚糖占茯苓菌核干重的93%，其在堿性條件下與氯乙酸反應生成水溶性的羧甲基茯苓多糖(Carboxytmethy-lpachymaran, CMP)(圖 1)。大量臨床與實驗研究表明，茯苓和茯苓多糖對胃腸疾病具有良好的治療、預防作用，但是，對水溶性良好的 CMP研究較少，基于此，本研究以腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis factor-alpha TNF-α)誘導Caco-2細胞建立損傷模型，觀察CMP對TNF-α調控的體外Caco-2細胞系生物學特性的影響，并探討其分子機制以及用于治療炎癥性腸病的潛在能力。

圖1　羧甲基茯苓多糖結構(CMP)Fig.1　Structure of CMP

1材料與方法

1.1細胞株和主要試劑人結腸腺癌細胞株Caco-2購自武漢大學細胞庫；DMEM培養基，胎牛血清，非必須氨基酸，雙抗等細胞培養試劑購自GIBCO公司；TNF-α購自Pepro Tech公司；CMP購自恒綠源科技有限公司；酚紅購自源葉公司；MILLIcell ERS-2購自millipore公司；Claudin-1抗體、FITC標記的羊抗兔IgG等購自Sigma公司。

1.2實驗方案

1.2.1細胞培養人結腸腺癌細胞株Caco-2用含10%胎牛血清、1%非必需氨基酸、1%雙抗的高糖DMEM培養基，放置于37℃、5%CO2恒溫培養箱中培養，每1～2 d更換新鮮培養基。當細胞融合70%～80%時，用0.25%EDTA將其消化，用于傳代或種板。

1.2.2細胞分組將細胞隨機分為3組，即正常組(C)、模型組(M)和給藥組(D)。當細胞適合造模和給藥時，C組用常規的培養基培養，M組和D組用含有100 ng/ml TNF-α的完全培養基培養，24 h后C組和M組更換常規培養基，D組更換為含有100 μg/ml CMP的完全培養基，培養24 h。

1.2.3單層跨膜電阻實驗(TER)Caco-2細胞接種在Transwell板中，隔天更換新鮮培養基，細胞生長到10天電阻值穩定時，按照細胞分組的方法分組和給藥，并用細胞電阻儀檢測電阻值。

1.2.4酚紅透過率實驗檢測Transwell板中細胞電阻后，移除培養液，用PBS(1×)清洗兩次，向外孔加入600 μl純水，內孔加入100 μl 20 mg/L的酚紅，放置于37℃、5%CO2恒溫培養箱中培養4 h。取外孔溶液150 μl與50 μl 600 μmol/L NaOH溶液混合，用酶標儀檢測波長570 nm的OD值。

1.2.5免疫印跡實驗Caco-2細胞接種在6孔板中，隔天更換新鮮培養液，當細胞長成單層屏障時，按照細胞分組的方法分組和給藥，并移除培養基，用PBS(1×)清洗3次，RIPA裂解液冰上裂解30 min，12 000 r/min，4℃離心10 min取上清，BCA法檢測蛋白濃度，SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉膜，5%脫脂奶粉封閉1 h，Claudin-1抗體(1∶2 500)孵育4℃過夜，TBST(1×)洗滌，10 min/次，3次，羊抗兔IgG二抗孵育1 h，TBST(1×)洗滌，10 min/次，3次，化學顯影，檢測蛋白表達。以GAPDH為內參照計算相對灰度值，進行統計學分析。

1.2.6免疫熒光實驗Caco-2細胞接種在24孔板中，隔天更換新鮮培養液，當細胞長成單層屏障時，按照細胞分組的方法分組和給藥，并移除培養基，用PBS(1×)清洗3次，4%多聚甲醛溶液固定30 min，移除多聚甲醛，PBS(1×)清洗3次，加入Claudin-1抗體，室溫孵育60 min，移除Claudin-1抗體，PBS(1×)清洗，10 min×3次，加入FITC標記的羊抗兔IgG，室溫避光孵育60 min,PBS(1×)清洗，10 min×3次，熒光顯微鏡下觀察、拍照。

2結果

2.1CMP升高TNF-α損傷的Caco-2細胞跨膜電阻值(TER)100 ng/ml TNF-α誘導Caco-2細胞24 h，TER值明顯下降，與正常組比較有統計學意義(P<0.01)圖2，表明TNF-α損傷了Caco-2細胞，成功建立了損傷模型；加入100 μg/ml CMP后，逆轉了TNF-α的損傷作用，給藥組與模型組比較具有統計學意義(P<0.01,圖2)，表明CMP有效逆轉了TNF-α對Caco-2細胞的損傷作用。

2.2CMP逆轉TNF-α損傷的Caco-2細胞酚紅透過率(transmittance)TNF-α誘導Caco-2細胞的酚紅透過性明顯升高，與正常組比較差異有統計學意義(P<0.01，圖3)，表明TNF-α使細胞與細胞之間的間隙增大； CMP修復了TNF-α損傷的細胞間隙，給藥組與模型組比較具有統計學意義(P<0.01，圖3)。這與單層細胞跨膜電阻實驗結果一致，都表明TNF-α損傷了Caco-2細胞， CMP對其損傷具有明顯的修復作用。

圖2　CMP升高TNF-α損傷的Caco-2細胞跨膜電阻值Fig.2　CMP increaces TER of Caco-2 cell induced by TNF-αNote: C.Normal group;M.Induced with 100 ng/ml TNF-α;D.Treat with 100 μg/ml CMP for 24 hours.*.P<0.01,M vs.C;#.P<0.01,D vs.M

圖3　CMP逆轉TNF-α損傷的Caco-2細胞酚紅透過率Fig.3　Repair effect of CMP to phenol red transmittance of Caco-2 cell induced by TNF-αNote: C.Normal group;M.Induced with 100 ng/ml TNF-α;D.Treat with 100 μg/ml CMP for 24 hours.*.P<0.01,M vs.C;#.P<0.01,D vs.M.

2.3CMP修復TNF-α損傷的Caco-2細胞Claudin-1蛋白表達100 ng/ml TNF-α誘導Caco-2細胞24 h，Claudin-1蛋白表達明顯下降，與正常組比較有統計學意義(P<0.01，圖4A)，表明TNF-α破壞了緊密連接，成功建立了Caco-2細胞緊密連接損傷模型；加入100 μg/ml CMP后，逆轉了TNF-α的損傷作用，給藥組與模型組比較具有統計學意義(P<0.05，圖4B)，表明 CMP有效修復了TNF-α對Caco-2細胞緊密連接蛋白Claudin-1的損傷。

2.4CMP修復TNF-α損傷的Caco-2細胞Claudin-1蛋白表達正常對照組 Claudin-1 蛋白沿著細胞膜呈蜂巢樣線性分布，熒光強度很強(圖5C)。

圖4　Claudin-1蛋白表達Fig.4　Expression of Claudin-1 proteinNote: A.Claudin-1 protein expression in different groups;B.Relative expression ratio of claudin-1 protein with GAPDH.C.Normal group;M.Induced with 100 ng/ml TNF-α;D.Treat with 100 μg/ml CMP for 24 hours.*.P<0.01,M vs.C;#.P<0.05,D vs.M.

圖5　CMP修復TNF-α損傷的Caco-2細胞claudin-1蛋白分布Fig.5　Repair effect of CMP to clauidn-1 protein′s distribution of Caco-2 cell induced by TNF-αNote: C.Normal group;M.Induced with 100 ng/ml TNF-α;D.Treat with 100 μg/ml CMP for 24 hours.

TNF-α誘導的腸道黏膜屏障損傷組，Claudin-1蛋白的分布變得毛糙、鋸齒樣改變、熒光強度變弱(圖5,M)，提示TNF-α損傷了Caco-2細胞Claudin-1蛋白的分布。給予 CMP干預后，逆轉了TNF-α的損傷，Claudin-1蛋白分布變得光滑，熒光信號強度較強(圖5D)，表明 CMP修復了Claudin-1蛋白的表達。

3討論

IBD在國外是常見的疾病，患病率約為40/10萬～100/10萬。在我國，該病的患病率有逐年增加的趨勢[6]，但其確切的發病機制尚未明確。由腸道黏膜免疫系統紊亂所致的炎癥反應在IBD的發生、發展以及轉歸中發揮著重要的作用[7]。腸黏膜屏障主要由腸黏膜表層的黏液層、上皮細胞層、黏膜基底膜構成，主要包括機械屏障、化學屏障、生物屏障和免疫屏障，其阻止腸腔內細菌、食物抗原等物質與腸黏膜固有層免疫細胞接觸，預防固有層免疫細胞激活[8,9]。腸黏膜細胞間的連接復合體包括緊密連接(Tightjunction,TJ)、黏附連接(Adhesion junction,AJ)、縫隙連接(Gapjunction,GJ)及橋粒(Desmosome)等，其中TJ位于靠近頂側的細胞側面，由多種動態變化的蛋白組成，對維持腸黏膜屏障功能起著重要作用。TJ一旦受到損傷，腸腔內的細菌等有毒大分子物質穿過黏膜屏障進入體循環，引起包括炎癥性腸病在內的許多疾病。研究表明TNF-α等細胞因子調控著緊密連接的動態變化[10]。本實驗以TNF-α誘導Caco-2細胞，其跨膜電阻值降低、酚紅透過率升高，表明使Caco-2細胞間的空隙增大，成功建立了損傷模型。在TNF-α誘導下，Claudin-1蛋白表達降低，Claudin-1蛋白分布毛糙、鋸齒樣改變、熒光信號強度變弱，同時證明了造模成功，并且表明這種對Caco-2細胞損傷與TJ上的Claudin-1蛋白表達和分布有關。

四君子湯出自宋代《太平惠民和劑局方》，由黨參、白術、茯苓、甘草組成，是益氣健脾，補益正氣的經典方劑，對消化系統、免疫系統具有很好的調節作用。隨著對四君子湯研究的深入，發現茯苓具有較好治療胃腸疾病、調節免疫系統的作用。 CMP是茯苓的有效成分β-茯苓聚糖在堿性條件下與氯乙酸反應的產物，其與茯苓、茯苓多糖、β-茯苓聚糖相比水溶性良好，因此更有利于臨床應用。張曉丹等[11]研究發現，茯苓能夠部分恢復脾氣虛大鼠模型胃腸脹氣、胃腸壁變薄、大腸充血水腫，并能升高小腸推進率，對脾氣虛腹瀉大鼠胃腸形態及水液代謝皆有改善作用。韓凌等[12,13]發現，茯苓多糖對大鼠小腸上皮細胞株IEC-6細胞具有促增殖抗遷移的作用。雖然茯苓和茯苓多糖已經證明能夠有效治療、預防胃腸疾病，但是 CMP治療胃腸疾病的研究仍是空白。本實驗以 CMP干預TNF-α誘導的Caco-2細胞損傷模型為中心展開研究。 CMP上調損傷模型中單層跨膜電阻值和降低酚紅的透過率，表明 CMP有可能減小Caco-2細胞與細胞間的空隙，有效的阻止腸腔內細菌、內毒素等有害物質穿過屏障與腸黏膜固有層免疫細胞接觸，引發固有層免疫細胞激活，從而可以有效避免IBD的發生、發展。為了進一步研究 CMP干預的作用機理，我們進一步做了TJ結構上Claudin-1蛋白的免疫印跡和免疫熒光實驗，結果表明 CMP修復了TNF-α損傷的TJ結構上Claudin-1的表達和分布，使其表達增加，分布變得光滑、熒光強度增強。因此，我們認為 CMP能夠有效逆轉TNF-α調控的體外Caco-2細胞系生物學特性，可能與Caco-2細胞TJ結構上Claudin-1蛋白表達和分布有關，是治療IBD的潛在藥物。

腸上皮細胞間的TJ由50多種蛋白構成，分為結構蛋白(Claudin、Occludin、JAM等)和功能蛋白(E鈣黏素、肌動蛋白、肌球蛋白、Cingulin、胞內連接蛋白Z0-1等)，結構蛋白構成細胞的結構骨架，功能蛋白連接細胞骨架和膜蛋白，并傳遞信號[14,15]。本實驗初步證明， CMP具有有效修復受損的腸道黏膜屏障的作用，這一作用與恢復TJ結構上Claudin-1蛋白有關。我們將繼續研究 CMP對TJ的其它蛋白的影響以及信號通路的機制。

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[收稿2015-10-24修回2015-11-06]

(編輯許四平)

Effect of Carboxytmethylpachymaran on tumor necrosis factor alpha′s control in vitro Caco-2 cell biological characteristics

ZHANGJin-Wei,LUYue,ZHONGXiao-Qin,HEYu-Hua,HANLing.

TheSecondAffiliatedHospitalofGuangzhouUniversityofTCM/GuangdongProvinceAcademyofTraditionalChineseMedicine,Guangzhou510120,China

[Abstract]Objective:To research the effect of Carboxytmethylpachymaran on tumor necrosis factor alpha′s control in vitro Caco - 2 cell biological characteristics and to preli minary discussion on its mechanism.Methods: Tumor necrosis factor-alpha(TNF-α) induce Caco-2 cells to establish damaged model,and then 100 μg/ml CMP intervenes the above model.So we evaluatod model and CMP intervention from TER,phenol red transmittance,tight junction protein claudin-1 expression and distribution.Results: TNF-α induced Caco-2 cells TER decreased obviously(P<0.01),phenol red transmittance increased obviously(P<0.01),expression of claudin-1 protein decreases and protein of claudin-1 changed in distribution was breaked,fluorescence intensity weaken,suggesting building success.TER increased obviously(P<0.01),phenol red transmittance decreases obviously(P<0.01),expression of claudin-1 protein decreases(P<0.05),protein of claudin-1 becomes smooth and stronger fluorescence intensity with CMP intervenes.Conclusion: CMP can effectively repair Caco-2 cells′ damage,which may be associated with recovery claudin-1 protein expression and distribution,and CMP could be potentially effective drugs for the treatment of inflammatory bowel disease.

[Key words]CMP;Intestinal mucosal barrier;IBD;TJ

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2016.05.014

作者簡介：張金衛(1988年-)，男，在讀碩士，主要從事免疫相關研究。通訊作者及指導教師：韓凌(1974年-)，女，博士，副研究員，博士生導師，主要從事補益藥的免疫藥理相關研究，E-mail:linghan36@163.com。

中圖分類號R285.5

文獻標志碼A

文章編號1000-484X(2016)05-0665-04

①本文受國家自然科學基金(81202635)資助。

②廣州中醫藥大學中藥學院，廣州510006。