雷帕霉素對RAW264.7細胞6種miRNAs表達的影響及miR-20a對ATG16L1的靶向調控作用①

趙　瑾　劉宏鵬　段相國　張愛君　丁淑琴　徐廣賢

(寧夏醫科大學檢驗學院,銀川750004)

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·生物治療·

雷帕霉素對RAW264.7細胞6種miRNAs表達的影響及miR-20a對ATG16L1的靶向調控作用①

趙瑾劉宏鵬段相國張愛君丁淑琴徐廣賢

(寧夏醫科大學檢驗學院,銀川750004)

[摘要]目的：探討雷帕霉素對miR-17-92簇中的6種miRNAs表達的影響，及miR-20a對ATG16L1基因的靶向調控作用。方法：利用qRT-PCR檢測雷帕霉素對RAW264.7細胞miR-17-92簇中的miR-20a等6種miRNAs的表達水平；通過雙熒光素酶報告系統、Western blot，驗證miR-20a對ATG16L1的靶向調控關系。結果：與正常組相比，雷帕霉素組RAW264.7細胞的miR- 17、miR-18a、miR-20a表達水平顯著上調(P<0.05)；3-MA組RAW264.7細胞的miR-20a表達水平顯著下調(P<0.05)。雙熒光素酶報告系統結果顯示，miR-20a可靶向ATG16L1-3′-UTR，抑制其表達；Western blot結果顯示，miR-20a能明顯抑制ATG16L1蛋白的表達，說明miR-20a可靶向抑制ATG16L1的表達，參與調控細胞自噬過程。結論：miR-20可靶向抑制Atg16L1的表達，參與調控RAW264.7細胞自噬過程。

[關鍵詞]miR-20a;靶向調控；細胞自噬

微小RNA(microRNA,miRNA)是一類進化保守的非編碼小RNA，在轉錄后水平對其靶向mRNA進行降解或抑制其表達。目前研究顯示microRNAs可以通過調控一些基因信號分子(例如生長因子、轉錄因子、前程序性死亡細胞基因等)，進而實現其對細胞生長、發育、分化、增殖和死亡的調控功能[1]。

自噬(Autophagy)是一種生物學代謝機制，主要功能就是降解蛋白等物質。即細胞吞噬自身胞質蛋白或細胞器，通過這個功能實現細胞本身的代謝需要，也實現某些細胞器的更新，從而維持細胞微環境和細胞功能的穩定。大量研究發現，自噬作為一種重要的免疫防御機制，對抵抗多種細胞內病原微生物感染起著積極作用[2]。

目前研究已經報道自噬的調控與許多miRNA相關。如miR-30a[3]可靶向作用于重要的自噬相關基因beclin 1，進而抑制細胞自噬；miR-375在肝癌細胞中通過靶向ATG7而抑制細胞自噬[4]，揭示了miRNA與細胞自噬間存在著一些潛在的關系。本課題通過生物信息學分析預測發現，miR-17-92簇中的miR-20a與自噬相關基因ATG16L1存在著潛在的靶向調控關系。進一步經實時定量PCR (real-time quantitative PCR， qRT-PCR)、雙熒光素酶報告系統檢測及Western blot對靶向關系進行驗證，將為深入研究 miR-20a、細胞自噬及后期與結核分枝桿菌之間的相互作用及其機制提供理論依據和研究思路。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1主要材料T4 DNA連接酶、MluⅠ、HindⅢ限制性內切酶購自NEB公司；DNA凝膠回收試劑盒、質粒小提試劑盒購自天根(Qiangen)生化科技有限公司；反轉錄試劑盒購自Thermo Scientific公司；2×SYBR Green I Mix購自Life technology公司；RNAiso for Small RNA購自大連TaKaRa公司；雷帕霉素、3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine，3-MA)購自Sigma公司；DMEM高糖培養基、PBS、胎牛血清購自Hyclone公司；雙熒光素酶檢測試劑盒購自Promega公司；轉染試劑購自北京全式金生物技術有限公司；兔抗ATG16L1抗體購自Abgent公司；miR-17、miR-18a、miR-20a、miR-19a、miR-19b、miR-92a、ATG16L1及ATG16L1/mut引物序列由上海生工生物有限公司合成;miR-20a mimic/inhibitor引物序列由上海吉瑪(GenePharma)有限公司合成。

1.1.2引物設計與合成依據成熟的miRNA序列來自miRBase數據庫，依據該數據庫中的miRNA序列分別設計miR-17-92簇中6種miRNA的莖環引物及其各自特異性上游檢測引物(表 1、2) ，Real-Time PCR通用下游引物:CTCAACTGGTGTC-GTGGA；以U6作為內參并根據NCBI中U6的成熟序列設計U6的特異性引物。內參基因U6上游引物：CTCGCTTCGGCAGCACA；U6下游引物：AACGCTTCACGAATTTGCGT。所有引物及DNA測序均由上海生工生物有限公司合成。

1.2方法

1.2.1細胞以2×106ml-1的密度接種于25 cm2培養瓶中，當細胞生長匯合至80%～90% 時，細胞分別按以下方法進行處理:雷帕霉素處理細胞2 h、3-甲基腺嘌呤(3-MA)處理細胞12 h，正常對照組細胞不作處理，各組細胞于37℃、50 ml/L CO2條件下細胞培養箱中培養。

1.2.2RNA的提取與cDNA合成利用大連TaKaRa公司的RNAiso for SmallRNA試劑分別提取雷帕霉素組、3-MA組及正常對照組的RNA，并以此RNA為模板，利用miR-17、miR-18a、miR-20a、miR-19a、miR-19b、miR-92a 的莖環引物，經42℃，60 min；85℃，5 min完成反轉錄過程，合成其相應的cDNA。

1.2.3miRNA表達量的檢測采用熒光定量PCR(qRT- PCR) 檢測雷帕霉素組、 3-MA組及正常對照組等各組中上述6種miRNAs的表達量，同時檢測各組U6的表達量作為內參，每組設3個平行復孔，結果采用相對定量法，公式:2-△△Ct，其中△△Ct=(待測樣本Ct-待檢測樣本U6Ct)-(正常組Ct-正常組U6Ct)，計算6種miRNA的相對表達量，并取三平行復孔的平均值

表2Real-time PCR上游檢測引物

Tab.2List of primers used for qRT-PCR

NameSequences(5'-3')miR-17ACACTCCAGCTGGGCAAAGTGCTTACAGTGCAGGmiR-18aACACTCCAGCTGGGTAAGGTGCATCTAGTGCAGAmiR-19aACACTCCAGCTGGGTGTGCAAATCTATGCAAAACmiR-20aACACTCCAGCTGGGTAAAGTGCTTATAGTGCAGGmiR-19bACACTCCAGCTGGGTGTGCAAATCCATGCAAAACmiR-92aACACTCCAGCTGGGTATTGCACTTGTCCCGGCCTG

表1莖環引物

Tab.1List of primers used for reverse transcription

NameSequences(5'-3')miR-17CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGCTACCTGCmiR-18aCTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGCTATCTGCACTAGATGmiR-19aCTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGTCAGTTTTGCATAmiR-20aCTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGCTACCTGCACTATAAGmiR-19bCTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGTCAGTTTTGCATGmiR-92aCTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGCAGGCCGG

1.2.4生物信息學分析預測應用PicTar、RNA22、Target Scan、miRanda等生物信息學軟件及網站進行miR-20a的靶基因的預測及甄選。

1.2.5載體構建構建pMIR-Report-ATG16L1-3′UTR及pMIR-Report-ATG16L1-3′UTR-mut重組質粒。

1.2.6miR-20a與自噬相關基因ATG16L1靶向關系的驗證

1.2.6.1雙熒光素酶報告系統分析將miR-20a mimic和空白對照NC分別與pMIR-Report-Atg16L1、pMIR-Report-ATG16L1 mut(突變體)重組質粒共轉染至RAW264.7細胞中，各組均共轉染海腎熒光素酶(PRL-TK)作為內對照，48 h后根據雙熒光素酶檢測試劑說明操作，利用微孔板發光分析儀檢測各組中螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶報告基因的活性，每組試驗重復3次，并計算其平均值。

1.2.6.2ATG16L1蛋白表達水平的檢測轉染miR-20a mimic、NC和miR-20a inhibitor至RAW264.7細胞中，構建miR-20a過表達/抑制表達的細胞模型，分別提取各組細胞的蛋白質，BCA法測定各組蛋白質濃度，并利用Western blot法檢測各組中ATG16L1蛋白表達情況。

2結果

2.2生物信息學分析及驗證miRBase檢索成熟 miR-20a序列，應用生物信息學軟件進行miR-20a的靶基因預測(圖 2)。成功將ATG16L1-3′UTR及其突變體插入pMIR-Report載體中，構建pMIR-Report-ATG16L1-3′ UTR及pMIR-Report-ATG16L1-3′ UTR-mut重組質粒，并經DNA測序驗證 (圖2) 。

2.3miR-20a與ATG16L1 靶向關系的驗證

2.3.1miR-20a的相對表達量檢測利用實時熒光定量PCR檢測可知， miR-20a mimic組中的miR-20a表達水平與正常對照組相比，上調約8.75倍，而 miR-20a inhibitor 組中的miR-20a表達水平下調約2倍(圖3)，說明miR-20a mimic 及miR-20a inhibitor 轉染成功。

2.3.2雙熒光素酶報告系統檢測分析雙熒光素酶分析與正常對照組相比，轉染miR-20a mimic組明顯抑制ATG16L1的相對熒光素酶活性，下降約1.8倍 (P<0.05) ；而ATG16L1-mut組相對熒光素酶活性沒有明顯變化(圖4)。表明miR-20a能靶向作用于ATG16L1-3′UTR的特異位點，抑制其表達。

圖1　細胞自噬模型中6種miRNA的相對表達水平Fig.1　Results of expression of 6 kinds of miRNA in model of cell autophagyNote: 1.NC;2.Treated by rapamycin(50 ng/ml) for 2 h;3.Treated by 3-MA(10 nmol/L) for 12 h.*.P<0.05.

圖2　miR-20a靶基因預測及重組質粒pMIR-Report-ATG16L1-3′UTR及其突變體測序驗證Fig.2　Interaction sites of miR-20a with predicted target gene ATG16L1-3′UTR and sequencing results of pMIR-Report-ATG16L1-3′UTR plasmid

圖3　實時熒光定量PCR檢測miR-20a相對表達水平Fig.3　To detect relative expression level of miR-20a with real-time PCRNote: 1.NC；2.miR-20a mimic；3.miR-20a inhibitor；*.P<0.05.

圖4　雙熒光素酶報告系統驗證miR-20a與ATG16L1靶向抑制作用Fig.4　To varify targeted inhibition between miR-20a and ATG16L1 with luciferase reporter systemNote: 1,3.miR-20a mimic；2,4.NC；*.P<0.05.

圖5　Western blot法檢測ATG16L1蛋白表達水平Fig.5　To detect protein expression level of ATG16L1 with Western blot analysis Note: β-actin as an internal reference.1.miR-20a mimic；2.miR-20a inhibitor；3.NC.

2.4Western blot法檢測ATG16L1蛋白的表達通過Western blot法檢測ATG16L1在蛋白水平上的表達，與正常對照組相比，轉染miR-20a mimic 組能顯著降低ATG16L1的表達量;而轉染 miR-20a inhibitor組ATG16L1蛋白表達量又明顯升高(P<0.05，圖5) 。

3討論

成熟的microRNA(miRNA) 是一種長約22nt的內源性非編碼RNA，能夠通過對其靶基因靶向降解或抑制其翻譯起到調控靶基因的表達作用[5]。miR-17-92是一個高度保守的miRNA簇，位于人類第13號染色體上初級轉錄本C13orf25基因的第三個內含子上[6]，編碼6個成熟的miRNA ：miR-17、miR-18a、miR-19a、 miR-20a、miR-19b和miR-92a。據已有報道研究顯示，miR-17-92簇對腫瘤細胞的生長[7,8]、增殖[9,10]、分化[9]、凋亡[10]過程起著重要作用。

最近研究顯示腫瘤、感染、神經退行性病變等疾病可能與細胞自噬異常有關[11]。已經報道的自噬與許多miRNA相關，如：miR-130a可以通過作用于靶基因ATG2B和DICER1調節自噬的發生，對慢性淋巴細胞白血病細胞的存活起到反饋調節的作用[12]； miR-199a-5p在不同細胞中可以抑制或者促進DRAM1和Beclin1基因的表達，使乳腺癌細胞對輻射更加敏感，在癌癥生物學機制和癌癥治療過程中起到重要作用[13]。因此miRNA可為某些由于自噬異常引起的免疫等相關疾病的治療提供新的思路。雷帕霉素作為細胞自噬發生常用的誘導劑之一，能夠抑制mTOR途徑，從而誘導自噬的發生[14]。3-MA可抑制PI3K，是一種常見的自噬抑制劑[15]。

近年來研究顯示，巨噬細胞的自噬作為固有免疫和適應性免疫的重要組成部分可參與胞內感染病原體的清除。在結核分枝桿菌感染的巨噬細胞內，誘導自噬的發生能促進吞噬體和溶酶體的融合，從而抑制胞內結核分枝桿菌(Mtb)的存活[16,17]。而同時結核分枝桿菌分泌的蛋白可抑制吞噬小體與溶酶體的融合，從而使其能在巨噬細胞內長期存活造成潛伏感染[18,19]。

然而miRNA如何調控巨噬細胞自噬，進一步影響結核分枝桿菌胞內存活的機制目前尚不完全明確，因此本課題研究為下一步探究miR-20a在巨噬細胞中結核分枝桿菌的免疫調控作用及其機制，提供一定的研究基礎和理論依據，對結核病預防與治療的研究起到推動作用。

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[收稿2015-09-10修回2015-09-28]

(編輯倪鵬)

Effects of rapamycin on expression of six kinds miRNAs in RAW264.7 macrophages and research on miR-20a′s targeted regulation of ATG16L1 gene expression

ZHAOJin,LIUHong-Peng,DUANXiang-Guo,ZHANGAi-Jun,DINGShu-Qin,XUGuang-Xian.

InstituteofLaboratoryMedicine,NingxiaMedicalUniversity，Yinchuan750004，China

[Abstract]Objective:To detect the influence of rapamycin on the expression of 6 kind of miRNAs of miR-17-92 cluster in macrophages.To study the relationship of miR-20a and ATG16L1 gene.Methods: The expression of miR-17,miR-18a,miR-20a,miR-19a,miR-19b and miR-92a was detected by Real-Time PCR.The targeting effect of miR-20a on ATG16L1 gene was verified by the dual-luciferase reporter assay system and Western blot.Results: After RAW264.7 cells was treated by rapamycin for 2 h，the expression of miR-17,miR-18a,miR-20a increased (P<0.05);After RAW264.7 cells was treated by 3-MA for 12 h，miR-20a was down regulated (P<0.05).The dual-luciferase reporter assay system and Western blot demonstrated that miR-20a could suppress ATG16L1 expression by targeting the specific 3′-untranslated region (3′ UTR) sequence of ATG16L1 gene．Conclusion: miR-20a can directly inhibit the autophagy-related gene ATG16L1 expression and participate in the regulation of autophagy process.It is negatively regulated at the post-transcriptional level.

[Key words]miR-20a;Target regulation;Cell autophagy

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2016.05.019

作者簡介：趙瑾(1990年-) ，女，碩士，主要從事臨床病原微生物與免疫學方面的研究，E-mail:524198608@qq.com。通訊作者及指導教師：徐廣賢( 1973年-) ，男，博士，教授，碩士生導師， 主要從事臨床病原微生物與免疫學方面的研究， E-mail:xuguangxian@nxmu.edu.cn。

中圖分類號R392.12

文獻標志碼A

文章編號1000-484X(2016)05-0687-05

①本文為國家自然科學基金項目(31472168)。