維生素D對慢性乙型肝炎患者免疫功能及抗病毒療效的影響

何麗杰　王　靜　笪宇蓉

(天津醫科大學，天津300070)

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維生素D對慢性乙型肝炎患者免疫功能及抗病毒療效的影響

何麗杰王靜笪宇蓉

(天津醫科大學，天津300070)

[摘要]目的：探討25羥維生素D3對慢性乙型肝炎患者外周血T淋巴細胞免疫功能及抗病毒療效的影響。方法：收集慢性乙型肝炎患者70例。采用電化學發光法測定血清25羥維生素D、熒光定量聚合酶鏈反應技術檢測乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)血清標志物，采用免疫熒光標記法測定外周血T淋巴細胞亞群數目。根據血清維生素D水平將患者分為維生素D低水平組、中水平組和高水平組，分別對3組患者給予長效干擾素治療6個月，并于相應時間檢測T淋巴細胞亞群數目、肝功能、病毒學指標。結果：3組患者在性別、年齡兩兩比較上無統計學差異。隨著血清維生素D水平的升高，CD3+、 CD4+、CD4+/CD8+顯著性升高,而CD8+逐漸降低，組間比較差異有統計學意義(P<0.05)。干擾素的治療能明顯改善T細胞各亞群，并且高水平組改善更明顯。干擾素的治療能明顯改善患者的病毒學指標，高水平組患者能獲得較好的病毒學應答。隨著血清維生素D水平的升高，HBeAg、HBsAg陽性率以及HBV DNA的含量逐漸降低,低水平組與中等水平組、高水平兩組比較差異有統計學意義(P<0.05)。然而不同水平維生素D組，患者的肝功能無明顯差異。結論：維生素D可能參與慢性乙型病毒性肝炎免疫功能的調節并與免疫耐受的形成有關，高水平的維生素D可以獲得持續的病毒學應答，這可能為慢性乙型病毒性肝炎發病機制的研究和治療提供新的思路。

[關鍵詞]25羥維生素D3；T淋巴細胞亞群；病毒學應答

慢性乙型肝炎(慢乙肝)是全球肝病的主要原因,并且其與肝硬化和肝細胞癌的發生風險增加明顯相關。據世界衛生組織統計，目前全球曾感染過HBV的有20億人，其中3.5億人為慢性感染，每年約有100萬人死于HBV相關的肝衰竭或原發性肝癌[1]。乙肝病毒感染時病毒的消長和肝臟病變的發展取決于機體免疫應答的性質、強度和范圍，機體有效的細胞免疫應答是控制病毒感染的關鍵，目前關于HBV感染后機體免疫功能的調節機制還不明確[2]。

維生素D為類固醇衍生物，可以通過食物補充，也可以通過皮膚光照7-脫氫膽固醇異構而成；維生素D進入血液循環后與維生素D結合蛋白(VDBP)結合，生成25-羥維生素D3，作為評估機體維生素D水平最可靠的指標[3]。根據美國內分泌學會的標準[4]，血清25(OH)D3 水平低于50 nmol/L (20 ng/ml)定義為維生素缺乏(Vitamin D deficiency)，介于50～75 nmol/L(20～30 ng/ml)之間定義為維生素D不足(Vitamin D insufficiency)。近年來隨著分子生物學的發展，維生素D的很多功能逐漸被很多學者熟知以及進一步研究。研究發現，維生素D與細胞因子的作用機制類似,通過細胞信號傳導通路廣泛參與機體免疫系統的調節[5]。并且機體內某些免疫細胞，如單核巨噬細胞等，含有維生素D合成酶，可以將血清中低活性的維生素D轉換成高活性1,25-(OH)2維生素D3，進而通過自分泌或旁分泌在局部參與免疫細胞功能的調節[6]。另外還有學者研究T淋巴細胞亞群的體外試驗發現，維生素D是T淋巴細胞遷移和歸巢的重要調節因素，并且進一步參與 T淋巴細胞的分化和誘導免疫耐受的產生[7,8]。

基于近期對維生素D功能的研究，本研究通過收集未治療的慢性乙型肝炎患者血清和干擾素治療6個月后同期患者的血清，分析患者基線水平的維生素D對慢性乙型肝炎患者免疫功能以及抗病毒治療療效的影響。

1材料與方法

1.1材料μ-Quant 酶標分光光度儀(美國 Bio-Tek公司)、ELISA試劑盒(美國Abcam公司)，T淋巴細胞分選磁珠(美國 BD公司)。

1.2血清標本收集70例慢性乙型肝炎患者來自2014年6月至2015年1月天津市第五中心醫院收治的患者，男42例，女28例，患者基本信息見表1。所有患者均符合中華醫學會肝病學分會和感染病學分會2010年制訂的《乙型肝炎防治指南》 中慢性乙型病毒性肝炎標準[9]，排除合并其他病毒性肝炎、酒精性肝炎以及其他慢性肝病，無合并急慢性感染、冠心病、糖尿病、腎臟疾病等。納入患者之前均未接受任何抗病毒藥物和免疫調節劑治療，給予長效干擾素肌內注射治療，每次6 MIU，每2 d一次，分別于0個月、1個月、3個月、6個月檢測患者的CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+。同時檢測患者肝功血清谷丙轉氨酶(Alanine aminotransferase,ALT)、谷草轉氨酶(Aspartate aminotransferase,AST)、總膽紅素(Total bilirubin，TBIL)以及病毒學指標表面抗原(HBsAg)、e抗原(HBeAg)、病毒顆粒(HBV-DNA)。

1.3實驗分組根據血清25-羥維生素D，將所有患者分為3組，即低水平組：血清25-羥維生素D<20 ng/ml；中等水平組：20 ng/ml≤25-羥維生素D<30 ng/ml；高水平組：25-羥維生素D≥30 ng/ml。

1.4實驗方法所有患者在對應時間于清晨空腹采取5 ml，EDTA抗凝血，1 000 r/min，離心15min，淋巴細胞分離液分選淋巴細胞，T淋巴細胞磁珠分選相應亞群T淋巴細胞。肝功能指標ALT、AST、TBIL采用日本Olympus全自動生化分析儀檢測,試劑由羅氏診斷產品(上海)有限公司提供。病毒學指標HBsAg、HBeAg、HBV-DNA檢測采用熒光定量聚合酶鏈反應技術，儀器購自美國伯樂公司生產Icycler IQ，試劑由深圳匹基生物工程股份有限公司提供。

2結果

2.1各組基本信息統計3組患者年齡、性別、基線水平的肝功能以及病毒學指標，結果表明3組之間的年齡、性別比之間無明顯差異，治療前不同25羥維生素D3水平組患者肝功能無明顯差異，而病毒學指標HBsAg和HBeAg陽性例數以及HBV DNA 含量25羥維生素D3低水平組和中水平組較高水平組要高，有明顯差異，差異有統計學意義，見表1。

2.2各組T淋巴細胞亞群的比較流式細胞技術檢測3組T淋巴細胞比例，結果發現CD3+、CD4+隨著25羥維生素D3水平的升高，免疫細胞數量逐漸升高，高水平組較低水平組和中水平組均有明顯差異，差異有統計學意義；而CD8+亞群細胞數結果則相反，高水平組較低水平組和中水平組均有差異，差異有統計學意義；CD4+/CD8+比值隨著25羥維生素D3水平的升高逐漸增大，差異有統計學意義。患者給予長效干擾素治療后于1個月、3個月和6個月檢測患者T淋巴細胞亞群的變化，發現各細胞亞群均有不同程度的改善，CD3+、CD4+隨著治療時間的延長逐漸升高至恢復正常，而CD8+逐漸降低，分析結果發現25羥維生素D3高水平組T細胞亞群改善較其他兩組明顯。具體結果見圖1、2。

表1各組患者臨床基本資料

Tab.1Baseline characteristics of each group

LowvitaminDgroupMidvitaminDgroupHighvitaminDgroupPvaluen203416M/F11/822/129/8Years35.500±4.75033.180±5.62030.630±7.5600.440ALT88.230±7.01085.740±6.83089.340±8.7800.360AST40.310±6.24038.370±8.21039.440±6.8900.470TBIL17.230±4.72016.980±3.84017.010±4.0500.180HBsAg(positive,n)203190.001HBeAg(positive,n)173080.001HBVDNA(log10copies/ml)7.030±2.3006.450±1.8904.890±1.5600.003

Note：Pvalue：High vitamin D group vs low vitamin D group.

圖1　各組CD4+、CD8+T細胞亞群治療前和治療6個月的含量檢測流式圖Fig.1　Results of peripheral blood CD4+ and CD8+T lymphocyte subsets before and after 6 months treatment in each group

圖2　各組外周血淋巴細胞亞群檢測結果±s)Fig.2　Results of peripheral blood T lymphocyte subsets in each ±s)Note: *.P<0.01.

2.2各組治療后肝功能的變化3組患者給予長效干擾素抗病毒治療6個月后，分別與1個月、3個月和6個月復查肝功能指標ALT、AST、TBIL，3組患者肝功能較治療前均有明顯改善，各組之間ALT、AST、TBIL的變化無明顯差異，差異沒有統計學意義，見圖3。

2.3各組治療后病毒學指標的變化3組患者給予長效干擾素抗病毒治療6個月后，分別于1個月、3個月和6個月復查病毒學指標HBsAg、HBeAg和HBV DNA含量，發現隨著干擾素的治療，3組患者HBsAg和HBeAg陽性例數均有減少，并且治療6個月后高水平組e抗原陽性患者均有e抗原血清學轉換，而s抗原陽性患者有一半患者轉陰，HBV DNA含量明顯降低，有一部分患者檢測不到HBV DNA。結果見圖4、表2。

圖3　各組治療后肝功能變化Fig.3　Improvement of liver function during each group

圖4　各組的HBV DNA的變化Fig.4　Improvement of HBV DNANote: *.P<0.01.

表2各組治療后病毒學指標的變化

Tab.2Improvement of virus serological markers during each group

LowvitaminDgroupMidvitaminDgroupHighvitaminDgroupP1P2BeforetreatmentHBsAg(positive,n)203190.0010.0001HBeAg(positive,n)173080.0010.0007OnemonthHBsAg(positive,n)192870.0010.0001HBeAg(positive,n)152870.0010.0007ThreemonthsHBsAg(positive,n)172550.010.001HBeAg(positive,n)102030.010.001SixmonthsHBsAg(positive,n)162330.0010.0001HBeAg(positive,n)91500.0010.0001

Note：P1 value:High vitamin D group vs low vitamin D group;P2 value:High vitamin D group vs mid vitamin D group.

3討論

慢性乙型病毒性肝炎是一種異質性疾病，不同患者病毒復制水平高低不等，肝組織炎癥輕重各異，反映機體對病毒不同的免疫狀態[1]。乙型肝炎患者普遍存在細胞免疫功能紊亂。外周血T淋巴細胞亞群是反映機體免疫狀態和功能的指標，對某些疾病的輔助診斷、分析發病機制、觀察療效及監測預后有重要意義。乙型肝炎患者中T細胞免疫主要對HBV清除和控制、肝組織病理損傷方面發揮作用，對疾病的轉歸有重要影響[10]。

T淋巴細胞亞群是機體關鍵性免疫活性細胞，是目前臨床上最常用的反映免疫功能狀態的指標，根據T細胞表面CD分子表達可將成熟的T淋巴細胞分為CD4+和CD8+細胞兩大類，每一類均為非均一的細胞群體，進一步可分為效應性T細胞或調節性T細胞，T細胞總數或不同T細胞亞群的絕對數或比值發生改變，可視為免疫異常，可能與某些疾病的發生與發展有關，而CD4+/CD8+比值則反映了機體免疫功能有無紊亂。

目前研究發現，維生素D的水平與人體免疫功能存在一定聯系，且被認為屬于神經內分泌-免疫調節激素，能夠介導單核細胞進行分化，調控活化T細胞或使調節性T細胞遷移和歸巢，并且促進T淋巴細胞的分化和誘導免疫耐受[11,12]。研究發現機體的維生素D的水平與慢性肝病之間有一定聯系。Petta等[13]研究表明較高水平的維生素D可以預示患者抗丙肝治療能獲得較好的或是持續的病毒學應答。另外還有學者研究慢性乙型肝炎患者機體維生素D水平，發現高病毒載量患者一般機體維生素D明顯不足，甚至缺乏，同時還發現那些高水平維生素D水平患者進行抗病毒治療后能獲得更好的e抗原、s抗原的血清學轉換；然而研究發現機體維生素D的含量與慢性肝病患者肝功能的改善無明顯影響[14-16]。

本研究對25羥維生素D3對慢性乙型肝炎患者免疫功能及抗病毒療效的影響進行臨床研究。研究發現25羥維生素D3低水平組、中水平組比高水平組，CD3+、CD4+、CD4+/CD8+逐漸升高，而CD8+逐漸降低，這一結果表明慢性乙型肝炎患者機體維生素D的水平與機體的免疫狀態或是免疫異常存在一定聯系。并且給予患者長效干擾素抗病毒治療后，不同維生素D水平組患者的免疫狀態均有改善，并且高水平組改善較另外兩組明顯一些。這一結果表明機體內高水平的25羥維生素D3可能促進機體T淋巴細胞的分化、遷移，從而導致機體的免疫耐受，減少炎癥因子對機體的損傷。本研究還發現高水平組患者的病毒載量以及e抗原陽性和s抗原陽性患者數較低水平組和中水平組要低，并且隨著抗病毒的治療，我們發現高維生素D水平組患者能更好地獲得病毒學應答，HBV病毒載量明顯降低甚至有些患者檢測不到病毒載量，e抗原的血清學轉換率以及s抗原的清除率也較低水平組和中水平組高。而3組患者之間的肝功能無明顯差異，這表明維生素D的水平與慢性肝病肝功能的狀態具有相關性。這些實驗結果與以上學者研究是一致的，表明維生素D的水平可能與慢性乙型肝炎的發病機制以及抗病毒治療的病毒學應答有一定聯系。機體較高水平的25羥維生素D3患者能夠獲得較好的抗病毒治療效果，可能是因為較高的25羥維生素D3水平能夠促進T淋巴細胞向受損的以及炎癥反應較重的肝組織遷移，從而改善機體的損傷，同時較高的25羥維生素D3水平能夠誘導機體的免疫耐受，減少機體炎癥因子的釋放，減輕炎癥反應。

綜上所述，維生素D作為微量元素，具有很多功能，能夠調節機體的免疫功能，對各種疾病狀態下的免疫狀態有一定的調控作用。本研究發現25羥維生素D3對慢性乙型肝炎患者T淋巴細胞亞群和病毒學應答有一定影響，這可能為慢性乙型病毒性肝炎發病機制的研究提供新的思路。

參考文獻：

[1]Shepard CW,Simard EP,Finelli L,etal.Hepatitis B virus infection:epidemiology and vaccination[J].Epidemiol Rev,2012,28(1):112-125.

[2]Shimizu Y.T cell immunopathogenesis and immunotherapeutic strategies for chronic hepatitis B virus infection[J].World J Gastroenterol,2012,18(20):2443-2451.

[3]Heaney RP.Assessing vitamin D status[J].Curr Opin Clin Nutr Metab Care,2011,14(5):440-444.

[4]Ross AC,Manson JE,Abrams SA,etal.The 2011 report on dietary reference intakes for Calcium and vitamin D from the Institute of Medicine:what clinicians need to know[J].J Clin Endocrinol Metab,2011,96(1):53-58.

[5]Hewison M,Gacad MA,Lemire J,etal.Vitamin D as a cytokine and hematopoetic factor[J].Rev Endocr Metab Disord,2001,2(2):217-227.

[6]Baeke F,Takiishi T,Korf H,etal.Vitamin D:modulator of the immune system[J].Curr Opin Pharmacol,2010,10(4):482-496.

[7]Lovato A,Marioni G,Manzato E,etal.Elderly patients at higher risk of laryngeal carcinoma recurrence could be identified by a panel of two biomarkers (nm23-H1 and CD105) and pN+ status[J].Eur Arch Otorhinolaryngol,2015,272(11):3417-3424.

[8]Topilski I,Flaishon L,Naveh Y,etal.The anti-inflammatory effects of 1,25-dihydroxyvitamin D3 on Th2 cells in vivo are due in part to the control of integrin-mediated T lymphocyte homing[J].Eur J Immunol,2004,34(4):1068-1076.

[9]賈繼東,李蘭娟.慢性乙型肝炎防治指南(2010年版)[J].胃腸病學,2011,27(6):351-366.

[10]Guidotti LG,Isogawa M,Chisari FV.Host-virus interactions in hepatitis B virus infection[J].Curr Opin Immunol,2015,36:61-66.

[11]Joshi S,Pantalena LC,Liu XK,etal.1,25-dihydroxyvitamin D(3) ameliorates Th17 autoimmunity via transcriptional modulation of interleukin-17A[J].Mol Cell Biol,2011,31(17):3653-3669.

[12]Kang SW,Kim SH,Lee N,etal.1,25-Dihyroxyvitamin D3 promotes FOXP3 expression via binding to vitamin D response elements in its conserved noncoding sequence region[J].J Immunol,2012,188(11):5276-5282.

[13]Petta S,Grimaudo S,Marco VD,etal.Association of vitamin D serum levels and its common genetic determinants,with severity of liver fibrosis in genotype 1 chronic hepatitis C patients[J].J Viral Hepat,2013,20(7):486-493.

[14]Farnik H,Bojunga J,Berger A,etal.Low vitamin D serum concentration is associated with high levels of hepatitis B virus replication in chronically infected patients[J].Hepatology,2013,58(4):1270-1276.

[15]Mahamid M,Nseir W,Abu Elhija O,etal.Normal vitamin D levels are associated with spontaneous hepatitis B surface antigen seroclearance[J].World J Hepatol,2013,5(6):328-331.

[16]Zitt E,Sprenger-M?hr H,Knoll F,etal.Vitamin D deficiency is associated with poor response to active hepatitis B immunisation in patients with chronic kidney disease[J].Vaccine,2012,30(5):931-935.

[收稿2015-10-15修回2015-10-29]

(編輯倪鵬)

Effect of serum Vitamin D levels on cellular immunity and antiviral effects in chronic hepatitis B patients

HELi-Jie,WANGJing,DAYu-Rong.

TianjinMedicalUniversity,Tianjin300070,China

[Abstract]Objective:To study the effect of vitamin D on peripheral blood T lymphocyte subsets and antiviral effects in chronic hepatitis B patients.Methods: The clinical data for 70 patients with chronic hepatitis B were analyzed.These patients were divided into three groups based on serum 25-hydroxy vitamin D level.Serum 25-hydroxy vitamin D was determined by electrochemical luminescence,and hepatitis B virus serological markers was determined by fluorescence quantitative polymerase chain reaction.Subsets of T lymphocytes were determined by flow cytometry.Results: The age and ratio of gender had no difference during these three groups. The proportion of CD3+,CD4+T lymphocyte and the ratio of CD4+/CD8+ increased (P< 0.05) significantly as the increase of 25-hydroxy vitamin D levels,but the proportion of CD8+ decreased.Interferon treatment could improve the T cells subgroup,and high level of serum 25-hydroxy vitamin D group improved more obviously.The treatment of interferon could obviously improve the hepatitis B virus serological markers,high level group of serum 25-hydroxy vitamin D could obtain better virological response.The positive of HBeAg,HBsAg and the titer of HBV DNA decreased with the increase of serum vitamin D,and the difference between the high and low level of 25-hydroxy vitamin D groups were significant.However,there were no significant difference between 3 groups of serological markers of liver function.Conclusion: Vitamin D may play a part in the immune tolerance in the nature course of chronic HBV infection,and high levels of vitamin D may be able to achieve sustained virological response.This findings may shed light on the immunotherapy of chronic hepatitis B.

[Key words]25-hydroxy vitamin D3；T lymphocyte subsets；Virological response

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2016.05.029

作者簡介：何麗杰(1986年-)，女，在讀碩士，主要從事免疫學方面的研究,E-mail：helijie39@163.com。通訊作者及指導教師：笪宇蓉(1971年-)，女，博士，副研究員，主要從事細胞因子信號傳導通路與自身免疫性疾病，E-mail：dayr@tijmu.edu.cn。

中圖分類號R512.6+2

文獻標志碼A

文章編號1000-484X(2016)05-0729-05