腎小管上皮及腎臟局部病理改變對腎結(jié)石形成的臨床價值分析

姚林 吳軍

腎小管上皮及腎臟局部病理改變對腎結(jié)石形成的臨床價值分析

姚林 吳軍

目的 分析腎小管上皮及腎臟局部病理改變對腎結(jié)石形成的臨床價值。方法 （1）取腎結(jié)石患者腎乳頭活檢標本（n=37），鏡下觀察其病理特點，并對比檢測腎結(jié)石患者腎組織（n=37）及健康腎組織（n=21）骨橋蛋白、骨形成蛋白-2（BMP-2）、Ⅱ型膠原表達；（2）體外培養(yǎng)腎小管上皮細胞，以10 mM草酸或10 mM草酸+200 mg/L一水草酸鈣（COM）結(jié)晶作用12 h，行Western Blotting檢測其EN01及Cofilin-1蛋白的表達。結(jié)果 （1）腎乳頭標本中鈣斑出現(xiàn)率83.8%（31/37）、局部鈣鹽沉積出現(xiàn)率94.6%（35/37）；腎結(jié)石患者骨橋蛋白陽性表達，腎結(jié)石患者與健康人群腎組織BMP-2及Ⅱ型膠原均呈陰性。（2）10 mM草酸作用12 h后，腎小管上皮細胞EN 01表達明顯上升、Cofilin-1表達明顯下降（P＜0.05），10 mM草酸聯(lián)合COM結(jié)晶作用后，上述變化更為明顯（P＜0.05）。結(jié)論 腎臟局部鈣鹽沉積可能是腎結(jié)石形成的主要途徑，且該途徑與動脈鈣化機制不同；草酸及COM結(jié)晶可能對腎小管上皮細胞產(chǎn)生毒性作用，影響其EN 01及Cofilin-1的表達，可能促進腎結(jié)石的形成。

腎結(jié)石；腎小管上皮細胞；鈣鹽沉積；腎臟

腎結(jié)石發(fā)病率約占5%[1]，隨碎石技術(shù)的發(fā)展，其診治均取得了有效突破，但約占1/2患者可能于8年內(nèi)復發(fā)[2]，這表明現(xiàn)階段臨床尚缺乏有效的腎結(jié)石預防方案，而其根本原因可能與腎結(jié)石的形成機制尚不明確有關(guān)。既往有研究認為鈣鹽沉積、腎鈣斑沉積可能與腎結(jié)石的發(fā)生與發(fā)展有關(guān)[3]，但鈣鹽沉積的具體機制尚不明確?；诖耍狙芯恐攸c探討了腎結(jié)石患者的鈣鹽沉積特點，并分析了高濃度尿石成分對腎小管上皮細胞的損傷對鈣鹽沉積的促進作用，具體報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 腎乳頭活檢標本及腎組織標本采集自2013年1月～2013年12月間上饒市立醫(yī)院收治的37例腎結(jié)石患者，男女比例25︰12，年齡9～77歲，平均（43.5±10.2）歲；健康腎組織采集自21例腎癌患者，同期入院，男女比例17︰4，年齡44～71歲，平均（53.9±10.1）歲。人腎小管上皮細胞HK-2細胞株均購自華中科技大學同濟醫(yī)學院。

1.2 主要試劑與器械 （1）小鼠抗人OPN抗體、BMP-2抗體、Ⅱ型膠原抗體，均購自Sigma公司；SP試劑盒，DAB試劑盒購自武漢博士德；Vector 22紅外光譜儀，購自Bruker；壓片機，購自北京先鋒世紀；（2）DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清、胰蛋白酶等，均購自GIBCO公司；草酸、一水草酸鈣等，均購自上海國藥；二氧化碳孵育箱，購自美國Forma；高速離心機，購自上海安亭；酶標儀，購自芬蘭LABSYSTEMS。

1.3 試驗方法

1.3.1 局部病理觀察 （1）所有腎結(jié)石患者行經(jīng)皮腎鏡取石碎石術(shù)治療，于術(shù)中直視取腎乳頭活檢標本，先后行HE及茜素紅染色，鏡下分析鈣鹽沉積情況；（2）所有腎組織石蠟包埋切片，行免疫組化SP法檢測其骨橋蛋白、BMP-2及Ⅱ型膠原表達情況，統(tǒng)計陽性率。

1.3.2 腎小管上皮病理改變 取HK-2細胞株體外培養(yǎng)，細胞長滿后，培養(yǎng)液更換為無血清含鈣DMEM培養(yǎng)液，劃分為3組，各18份，分別不做特殊處理、加入終濃度10 mM草酸、同時加入10 mM草酸及200 mg/LCOM結(jié)晶，12 h后行Western Blotting檢測EN 01及Cofilin-1濃度。

1.4 統(tǒng)計學方法 應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計學軟件處理數(shù)據(jù)，計量資料采用“±s”表示，多組間對比行F檢驗及q檢驗；計數(shù)資料以百分數(shù)和例數(shù)表示，組間比較采用χ2檢驗；以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 局部病理觀察

2.1.1 鏡下觀察 腎結(jié)石患者腎乳頭標本中鈣斑出現(xiàn)率、局部鈣鹽沉積出現(xiàn)率均明顯高于健康腎組織，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表1。鈣鹽沉積特點：在鈣斑部位沉著淺、聚集多，遠離鈣斑部位及深部髓質(zhì)沉著量明顯較少；鈣鹽沉積少，則集中見于腎小管基底膜，部分向腎間質(zhì)蔓延；電鏡下可見鈣鹽沉積嚴重位置，其周圍細胞超微結(jié)構(gòu)破壞。

表1 鈣斑及局部鈣鹽沉積情況對比[n（%）]

2.1.2 免疫組化分析 腎結(jié)石患者腎臟組織均呈骨橋蛋白陽性表達，陽性率明顯高于健康腎臟組織（P＜0.05）；2組均未見BMP-2及Ⅱ型膠原陽性表達。見表2。

表2 腎臟組織骨橋蛋白、BMP-2及Ⅱ型膠原陽性表達情況[n（%）]

2.2 腎小管上皮病理改變 經(jīng)草酸或草酸+COM結(jié)晶處理，腎小管上皮細胞EN 01表達明顯上升，Cofilin-1表達明顯下降（P＜0.05），且草酸+COM結(jié)晶處理后，上述蛋白表達量與單用草酸處理，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表3。

表3 腎小管上皮細胞EN 01和Cofilin-1半定量檢測結(jié)果（xs）

表3 腎小管上皮細胞EN 01和Cofilin-1半定量檢測結(jié)果（xs）

注：與對照組相比，aP＜0.05；與單用草酸處理，bP＜0.05

處理方案例數(shù)EN 01Cofilin-1對照組180.22±0.030.78±0.04草酸180.54±0.03a0.29±0.05a草酸+COM結(jié)晶180.63±0.04ab0.18±0.03abF值25.31131.325 P值0.0000.000

3 討論

腎結(jié)石病因復雜，目前多認為其可能與遺傳、代謝、尿路局部因素、氣候等多種因素有關(guān)[4]，且指出尿液中游離顆粒只有轉(zhuǎn)換為固定顆粒，固定于尿管之中，才可形成結(jié)石，即腎結(jié)石的形成需要一個原發(fā)病灶[5]。有假說認為鈣鹽沉積是腎結(jié)石的早期病變，鈣鹽沉積形成腎鈣斑可為結(jié)石提供生長基礎(chǔ)，且腎鈣斑穿透腎小管上皮細胞后，還可進一步促進結(jié)石的形成[6]。

該假說具備一定的科學性，但并未有效揭示含鈣物質(zhì)在腎臟局部沉積的機制?？紤]到腎乳頭的鈣化成分與動脈硬化斑塊成分相似，均多為羥基磷灰石，有學者認為腎臟的鈣鹽沉積可能與動脈粥樣硬化機制相同，均為成骨反應(yīng)[7]。但本研究并不支持此輪點，本例中腎結(jié)石患者腎組織中僅骨橋蛋白陽性，但BMP-2及Ⅱ型膠原均陰性，而后兩者均為成骨性細胞標志蛋白。由此推測，腎局部鈣鹽沉積可能僅與骨橋蛋白的過表達有關(guān)，該蛋白確有一定成骨作用，在腎臟中多由亨利氏襻、近曲小管等分泌，在健康機體內(nèi)有抑制腎臟結(jié)晶沉淀的功能[7]。然而腎結(jié)石患者腎小管上皮多受損傷，表面富含草酸鈣晶體，過飽和的草酸鈣晶體可能將骨橋蛋白包裹進去，形成潛在的晶體成核位點，導致腎結(jié)石的形成[8]。

由此推測，腎結(jié)石形成的主要原因之一可能為：高濃度尿石成份導致腎小管上皮細胞損傷，進一步導致上皮細胞分泌成骨樣蛋白，或分泌特異因子，或在局部促發(fā)成骨性反應(yīng)，導致鈣鹽沉積，再導致腎結(jié)石形成。雖然前述分析提示了局部促發(fā)成骨性反應(yīng)的機制之一，但本研究同時顯示，草酸及COM結(jié)晶還可導致腎小管上皮異常分泌釋放其它蛋白，如EN 01及Cofilin-1。EN 01表達的上調(diào)可能表明細胞受損[9]，需要通過增加無氧代謝以自我保護；Cofilin-1則為細胞分裂必須蛋白，有解聚收縮環(huán)、促進細胞分裂的功能，其含量下降，表明腎臟局部細胞分裂存在缺陷[10]。然而上述蛋白是否間接影響腎結(jié)石的形成，尚需深入探討，不過本研究結(jié)論已能夠直接證實，尿中草酸及COM結(jié)晶能夠使腎小管上皮細胞產(chǎn)生病理性改變，異常釋放多種蛋白。

總之，本研究表明腎小管上皮及腎臟局部病理改變可能與腎結(jié)石的形成與發(fā)展有一定關(guān)系，值得深入探討。

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10.3969/j.issn.1009-4393.2016.2.008

江西 334000 江西省上饒市立醫(yī)院外一科 （姚林 吳軍）