基于MALDI-TOF-MS質(zhì)譜技術(shù)對(duì)蜂蜜中芽孢桿菌的鑒定與分型

宗 凱， 周莉質(zhì)， 李云飛， 陳雪嬌， 孫娟娟， 鄭海松， 余曉峰

(安徽出入境檢驗(yàn)檢疫局，安徽合肥 230022)

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基于MALDI-TOF-MS質(zhì)譜技術(shù)對(duì)蜂蜜中芽孢桿菌的鑒定與分型

宗 凱， 周莉質(zhì)， 李云飛， 陳雪嬌， 孫娟娟， 鄭海松， 余曉峰*

(安徽出入境檢驗(yàn)檢疫局，安徽合肥 230022)

摘要[目的]對(duì)分離自不同產(chǎn)地和品種的蜂蜜中的芽孢桿菌屬進(jìn)行鑒定分型，探索利用蜂蜜中芽孢桿菌特征指紋圖譜對(duì)蜂蜜產(chǎn)地和品種進(jìn)行溯源的可行性。[方法] 從44種不同產(chǎn)地和品種蜂蜜中分離出44株芽孢桿菌，3株銅綠假單胞菌。采用基質(zhì)輔助激光解析-電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)條件對(duì)分離的芽孢桿菌進(jìn)行鑒定分型和聚類分析。[結(jié)果] 44株芽孢桿菌中鑒定出蠟樣芽孢桿菌(B.cereus )31株，短小芽孢桿菌(B.pumilus)5株，枯草芽孢桿菌(B.subtilis)3株，地衣芽孢桿菌(B.licheniformis)2株，炭疽芽孢桿菌(B.anthracis)1株，土壤短芽孢桿菌(Brevibacillus agri.)2株。通過多次重復(fù)試驗(yàn)，表明從同一份樣品或同一品牌蜂蜜樣品中能穩(wěn)定分離到芽孢桿菌，獲得的蛋白指紋圖譜具有極好的穩(wěn)定性。[結(jié)論]MALDI-TOF-MS可根據(jù)獲得的芽孢桿菌蛋白指紋圖譜將芽孢桿菌劃分為不同類型，可作為一種新的根據(jù)蜂蜜中芽孢桿菌的特征指紋圖譜進(jìn)行溯源的方法。

關(guān)鍵詞基質(zhì)輔助激光解析-電腦飛行時(shí)間質(zhì)譜;芽孢桿菌;鑒定分析

蜂蜜的成分復(fù)雜，營養(yǎng)豐富，是人類傳統(tǒng)的天然營養(yǎng)保健品。我國是蜂蜜生產(chǎn)、銷售和出口大國，隨著蜂產(chǎn)品市場日益繁榮，蜂產(chǎn)品的質(zhì)量安全問題逐漸突顯。蜂蜜產(chǎn)品的溯源檢測技術(shù)在蜂蜜溯源體系中起到了極為重要的技術(shù)支持作用。目前，溯源分析中涉及的檢測技術(shù)主要有色譜、質(zhì)譜、光譜和分子生物學(xué)等。其中，質(zhì)譜檢測技術(shù)作為溯源檢測技術(shù)的重要組成部分，在溯源分析中發(fā)揮了極為重要的作用。目前采用質(zhì)譜技術(shù)對(duì)蜂產(chǎn)品進(jìn)行溯源主要是對(duì)蜂蜜中有機(jī)成分、 揮發(fā)性物質(zhì)、 特征化合物和同位素比率等進(jìn)行分析檢測，從而對(duì)不同種類的蜂蜜進(jìn)行溯源分析。筆者主要研究了多個(gè)產(chǎn)地和品種的蜂蜜中芽孢桿菌的特征蛋白質(zhì)指紋峰，建立蜂蜜中芽孢桿菌蛋白質(zhì)指紋圖譜庫對(duì)蜂蜜產(chǎn)品進(jìn)行溯源，開拓了蜂蜜溯源技術(shù)的新思路。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1蜂蜜樣品。供試樣品為不同產(chǎn)地不同品種的蜂蜜，均由安徽省阜陽市百和食品有限公司提供。樣品采集后置于4 ℃冰箱保存。

1.1.2培養(yǎng)基。營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基。

1.1.3MALDI-TOF-MS基質(zhì)和溶液系統(tǒng)?；|(zhì)：α-氰基-4-羥基肉桂酸(α-cyan o-4-hydroxycinnamic acid，CHCA)， 島津公司。溶劑：檢測樣品配制基質(zhì)的溶劑為乙腈∶乙醇∶ 水 (1∶1∶1) 。以大腸桿菌ATCC8739作為標(biāo)準(zhǔn)菌株，用來校準(zhǔn)儀器。MALDI-TOF-MS基質(zhì)溶液是用溶劑將基質(zhì)配成飽和溶液，基質(zhì)溶液現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.1.4儀器與設(shè)備?；|(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜儀，日本島津公司confidence，儀器參數(shù)為：線性操作模式，正離子，基質(zhì)抑制偏轉(zhuǎn)模式，脈沖離子提取時(shí)間350 ns，質(zhì)量范圍1 500～15 000 D，激光點(diǎn)擊數(shù)為20。每次試驗(yàn)前都要處理好的大腸桿菌ATCC8739的標(biāo)準(zhǔn)峰圖在采集數(shù)據(jù)的質(zhì)量范圍內(nèi)(1 500～15 000 D) 進(jìn)行質(zhì)量校正，校正完畢后方可進(jìn)行質(zhì)譜圖數(shù)據(jù)的采集。

1.2方法

1.2.1從蜂蜜中分離芽孢桿菌。稱取1 g蜂蜜，加入配制好的營養(yǎng)肉湯中，37 ℃培養(yǎng)24～48 h，然后劃線于血平板上，將劃線后血平板37 ℃培養(yǎng)24 h，挑單菌落再劃線于新的血平板上培養(yǎng)24 h。

1.2.2MALDI-TOF-MS質(zhì)譜上樣前處理。無菌操作挑取100 mg左右血平板上菌落于1.5 mL EP管中(1.5 mL EP管預(yù)先加入0.5 mL生理鹽水)，振蕩1 min后離心，將底部菌落用300 μl 蒸餾水轉(zhuǎn)于EP管中， 加900 μL無水乙醇，振蕩2 min后12 000 r/min離心2 min，棄去上清液，室溫放置10 min,沉淀中加30 μL 70%甲酸，振蕩混勻，超聲15 min,加30 μL乙腈，振蕩混勻， 8 000 r/min再次離心1 min后迅速將上清液轉(zhuǎn)入新的EP管中。取0.5 μL置于MALDI-TOF-MS樣品靶盤上，室溫晾干后迅速用0.5 μL基質(zhì)溶液覆蓋，在空氣中晾干。作為校準(zhǔn)用的大腸桿菌ATCC8739培養(yǎng)及前處理過程與蜂蜜樣品中芽孢桿菌分離培養(yǎng)及前處理相同。每個(gè)樣品各點(diǎn)3個(gè)平行孔。

2結(jié)果與分析

2.1MALDI-TOF-MS對(duì)蜂蜜中分離菌株的鑒定 比對(duì)44個(gè)不同產(chǎn)地和品種蜂蜜中分離的44株芽孢桿菌和3株銅綠假單胞菌。44株芽孢桿菌中鑒定出蠟樣芽孢桿菌(B.cereus)31株，短小芽孢桿菌(B.pumilus)5株，枯草芽孢桿菌(B.subtilis)3株，地衣芽孢桿菌(B.licheniformis)2株，炭疽芽孢桿菌(B.anthracis)1株，土壤短芽孢桿菌(Brevibacillusagri.)2株。鑒定的代表性圖譜，具體統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)見表1。

表1　蜂蜜樣品產(chǎn)地和品種信息

由表1可以看出，分離自44個(gè)不同產(chǎn)地和品種的蜂蜜的44張芽孢桿菌質(zhì)量圖譜，既存在相似的離子峰，也大多數(shù)有各自的特征離子峰，且通過多次重復(fù)取樣試驗(yàn)，這種差異特征離子峰檢測重復(fù)性和穩(wěn)定都非常好，因此可以把這些特征峰代表的特征指紋圖譜作為某一產(chǎn)地和品種品牌蜂蜜的參考標(biāo)記峰，作為蜂蜜產(chǎn)地、品種甚至品牌的溯源根據(jù)。

圖2　蠟樣芽孢桿菌 31 株菌的聚類分析Fig.2　Cluster analysis of 31 strains of Bacillus cereus

2.2MALDI-TOF-MS對(duì)芽孢桿菌的分型將所得31株蠟樣芽孢桿菌的蛋白指紋圖譜導(dǎo)入微生物鑒定數(shù)據(jù)庫，通過軟件自帶TAXMONY功能將蠟樣芽孢桿菌31株菌的蛋白質(zhì)指紋圖譜進(jìn)行聚類分析(圖2),按照65%相似性作為判定水平，170001_2G3、220002_2A4、1600001_2C1、240001_2A1、210001_2G1菌株肽指紋圖譜較為相近，140001_2F1、470002_2C4、250001_2H1、46-20001_2E3、330002_2E4、161-20001_2E3、190001_2H3、430002_2E2菌株肽指紋圖譜較為相近。

3討論

蜂蜜主要成分為糖類物質(zhì)，其中主要是葡萄糖和果糖，在高糖的環(huán)境下僅有部分微生物能存活，其中芽孢桿菌因?yàn)槠淠褪艿难挎唧w的存在而廣泛存在于蜂蜜中。通過試驗(yàn)，從44種蜂蜜中(包括40種原蜜和4種商品蜜)均分離到了芽孢桿菌，其中主要為蠟樣芽孢桿菌，其次為枯草芽孢桿菌，還有些是短小芽孢桿菌等。通過對(duì)這些芽孢桿菌多次劃板分離得到其純培養(yǎng)物，采用簡單前處理獲得較高的鑒定率。從表1 中可以看到，從各類蜂蜜中分離出來的芽孢桿菌的鑒定率基本上在80%以上，為可信結(jié)果(>75%)。每株從各類蜂蜜中分離出來的芽孢桿菌圖譜除存在共有峰外，還存在各自的特征峰，且穩(wěn)定性和重復(fù)性好。

基于單菌落的 MALDI-TOF-MS 技術(shù)用于芽孢桿菌鑒定,與目前的細(xì)菌鑒定方法[1-2]相比，其原理和操作均存在差異，無需復(fù)雜的前處理，只需獲得某細(xì)菌純培養(yǎng)物，進(jìn)行簡單前處理甚至不需要進(jìn)行任何的前處理，只需將極少量的純培養(yǎng)物涂抹于靶板表面，再覆蓋少量基質(zhì),即可上機(jī)鑒定，獲得穩(wěn)定的細(xì)菌肽指紋圖譜，圖譜數(shù)據(jù)自動(dòng)分析、檢索與比對(duì),實(shí)現(xiàn)了一種高通量和高效率的鑒定方法。在應(yīng)用MALDI-TOF-MS分析全細(xì)菌時(shí),獲取的全細(xì)菌指紋圖譜還具有很好的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性[3-4]。

島津公司MALDI-TOF-MS confidence型號(hào)質(zhì)譜所帶的微生物數(shù)據(jù)庫中，蠟樣芽孢桿菌普通圖譜僅有19份，超級(jí)圖譜僅有5份，枯草芽孢桿菌普通圖譜僅有20份，超級(jí)圖譜僅有6份。該研究從蜂蜜中分離的各類芽孢桿菌十分豐富，通過鑒定后均可將其肽指紋圖譜加入微生物數(shù)據(jù)庫中，以豐富數(shù)據(jù)庫中芽孢桿菌的標(biāo)準(zhǔn)圖譜數(shù)量。

參考文獻(xiàn)

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Identification and Analysis ofBacillusin Honey Based on MALDI-TOF-MS

ZONG Kai, ZHOU Li-zhi, LI Yun-fei,YU Xiao-feng*et al

(Anhui Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau, Hefei, Anhui 230022)

Abstract[Objective] The species of the genus Bacillus isolated from different habitats and species honey were identified. The feasibility of using Bacillus characteristic fingerprint in honey to trace the origin and species of honey was explored. [Method] Forty-four strains of Bacillus and three strains of Pseudomonas aeruginosa were isolated from forty-four different varieties of honey. Using matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF-MS), cluster analysis and typing of Bacillus isolated from honey was conducted. [Result] Thirty-one strains of Bacillus cereus, five strains of Bacillus pumilus, three strains of Bacillus subtilis, two strains of Bacillus licheniformis, one strain of Bacillus anthracis, and two strains of Brevibacillus agri. were identified from forty-four strains of Bacillus. The result from repeated experiments indicated that stabilized Bacillus could be isolated from the same one or brand of honey so that obtained proteome profiles were more stabilized. [Conclusion] MALDI-TOF-MS can divide Bacillus into different types on the basis of the proteome profiles of obtained Bacillus and as a new method to trace the origin of honey based on the characteristic fingerprint of honey.

Key wordsMALDI-TOF-MS; Bacillus; Identification and analysis

作者簡介宗凱(1985- )，男，安徽安慶人，工程師，碩士，從事植物檢疫研究。

收稿日期2016-01-29

中圖分類號(hào)S 896.1

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A

文章編號(hào)0517-6611(2016)08-107-03