氨氮和亞硝酸氮對(duì)偏頂蛤的急性毒性研究

張曉森，寧軍號(hào)，常亞青，李 磊，李開(kāi)全

(大連海洋大學(xué)，農(nóng)業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧大連 116023)

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氨氮和亞硝酸氮對(duì)偏頂蛤的急性毒性研究

張曉森，寧軍號(hào)，常亞青*，李 磊，李開(kāi)全

(大連海洋大學(xué)，農(nóng)業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧大連 116023)

摘要[目的]研究氨氮和亞硝酸氮對(duì)偏頂蛤的急性毒性，為合理調(diào)控偏頂蛤水體中氨氮與亞硝酸氮提供參考價(jià)值。[方法]采用常規(guī)生物毒性試驗(yàn)方法，研究偏頂蛤?qū)Π钡蛠喯跛岬拘缘哪褪芰Α結(jié)果]氨氮對(duì)偏頂蛤的半致死濃度96 h LC50為158.85 mg/L，安全濃度(SC)為15.89 mg/L；非離子氨對(duì)偏頂蛤半致死濃度96 h LC50為14.06 mg/L，安全濃度(SC)為1.41 mg/L。亞硝酸氮對(duì)試驗(yàn)蛤的半致死濃度96 h LC50為54.20 mg/L，安全濃度(SC)為5.42 mg/L。[結(jié)論]與亞硝酸鹽相比，偏頂蛤?qū)偘钡拘缘哪褪芰Ω鼜?qiáng)，非離子氨對(duì)偏頂蛤的毒性最強(qiáng)。

關(guān)鍵詞偏頂蛤；非離子氨；亞硝酸氮；耐受力

偏頂蛤(ModiolusmodiolusLinnaéus)俗稱(chēng)毛海紅，隸屬軟體動(dòng)物門(mén)瓣鰓綱貽貝目貽貝科偏頂蛤?qū)佟?0世紀(jì)80年代偏頂蛤在我國(guó)黃海、渤海資源十分豐富，自潮間帶下區(qū)到水深50 m的淺海均有分布。偏頂蛤個(gè)體大、肉質(zhì)鮮美、高蛋白、低脂肪，具有較高的市場(chǎng)價(jià)值和開(kāi)發(fā)潛力[1-2]。

近年來(lái)，我國(guó)海產(chǎn)貝類(lèi)增養(yǎng)殖業(yè)快速發(fā)展，但對(duì)其自然資源缺乏系統(tǒng)管理和保護(hù)，加上海域污染、種質(zhì)退化日趨嚴(yán)重，偏頂蛤、厚殼貽貝(Mytiluscoruscus)、翡翠貽貝(Pernaviridis)的自然儲(chǔ)存量已大幅度減少[2-3]。貝類(lèi)人工繁育與室內(nèi)工廠(chǎng)化養(yǎng)殖是解決其資源匱乏的主要措施，而養(yǎng)殖水體是制約貝類(lèi)生產(chǎn)實(shí)踐的重要因素[4-5]。研究表明，氨氮與亞硝酸氮是養(yǎng)殖水環(huán)境中制約水產(chǎn)動(dòng)物生長(zhǎng)和發(fā)育的主要因子之一，當(dāng)其濃度超標(biāo)時(shí)，不僅會(huì)對(duì)養(yǎng)殖動(dòng)物產(chǎn)生直接毒害，而且能誘發(fā)多種疾病[6]。尤其在高密度養(yǎng)殖過(guò)程中，大量殘餌、排泄物和尸體等含氮有機(jī)物經(jīng)過(guò)微生物分解產(chǎn)生氨氮、亞硝酸氮等有毒物質(zhì)，且隨著養(yǎng)殖時(shí)間的增加不斷積累。因此，氨氮和亞硝酸氮在海產(chǎn)貝類(lèi)集約化養(yǎng)殖過(guò)程中普遍存在，并限制著貝類(lèi)增養(yǎng)殖業(yè)的進(jìn)一步發(fā)展[7]。筆者以成體偏頂蛤?yàn)檠芯繉?duì)象，研究了氨氮和亞硝酸氮對(duì)偏頂蛤的急性毒性效應(yīng)，旨在為其養(yǎng)殖業(yè)的健康穩(wěn)定發(fā)展提供理論參考。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料試驗(yàn)用偏頂蛤采自大連黑石礁海域，殼長(zhǎng)(81.32 ± 6.20)mm，殼高(45.97 ±3.87)mm，殼寬(39.27 ± 3.02)mm，濕質(zhì)量(93.79 ± 8.13)g，運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室暫養(yǎng)。暫養(yǎng)期間投喂金藻，輔以螺旋藻，早晚各投喂1次/d，投餌前換水1/2。暫養(yǎng)7d后進(jìn)行毒性試驗(yàn)，試驗(yàn)前24h停止投喂，試驗(yàn)期間不投餌。海水經(jīng)過(guò)3級(jí)沙濾，溫度19～20 ℃，鹽度31.20%，pH為8.20。

試劑所用分析純NH4Cl和NaNO2(藥品均由天津市大茂化學(xué)試劑廠(chǎng)生產(chǎn)，相對(duì)分子量分別為53.49和69.00)，烘干至恒重，用海水溶解后配制成20g/L的母液，避光冷藏保存，備用。

1.2試驗(yàn)方法預(yù)試驗(yàn)初步確定試驗(yàn)蛤?qū)Π钡蛠喯跛岬哪褪苣芰Α８鶕?jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，用移液管吸取一定量配制的母液，總氨濃度分別為67.29、84.45、106.32、134.58、168.22、212.30、267.48mg/L；亞硝酸氮濃度分別設(shè)為23.67、42.67、75.00、133.33、236.67、420.67mg/L。每個(gè)濃度組設(shè)置3個(gè)平行，每個(gè)平行14只偏頂蛤，同時(shí)設(shè)置3組不添加NH4Cl和NaNO2的空白對(duì)照組，每組14只偏頂蛤。試驗(yàn)用50L藍(lán)色聚乙烯塑料水槽為容器，每個(gè)水槽注入上述配制的試驗(yàn)液40L。

試驗(yàn)期間不投喂、不充氣，以保證NH4Cl和NaNO2濃度相對(duì)穩(wěn)定，每24h全部更換試驗(yàn)液1次。每天觀察偏頂蛤的中毒癥狀、活動(dòng)和死亡情況，記錄24、48、72、96h的死亡數(shù)。偏頂蛤貝殼大開(kāi)，刺激不能閉合，放入正常海水中5h不能閉合，則判定為死亡。

1.3數(shù)據(jù)處理試驗(yàn)數(shù)據(jù)使用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)與分析，采用直線(xiàn)內(nèi)插法計(jì)算96h半數(shù)致死濃度和95%置信區(qū)間。使用以下公式計(jì)算96h半致死濃度及安全濃度[8]：

LC50=C1+(P1-50%)×(C2-C1)/(P1-P2)

(1)

SC=0.1×96hLC50

(2)

式中，C1和C2分別表示成活率最接近50%的低濃度和高濃度，P1和P2分別表示C1和C2濃度對(duì)應(yīng)的成活率。

按照以下公式計(jì)算非離子態(tài)氮濃度：

CNH3-Nm=CNH3-Nt/[10(pKa-pH)+ 1]

(3)

式中，pKa= 0.090 18 +2 729.92/T，pKa為NH4-N表觀電離常數(shù)的負(fù)對(duì)數(shù)，T為開(kāi)氏溫度，T= 273 +t(℃)，t為試驗(yàn)時(shí)海水溫度；CNH3-Nm和CNH3-Nt分別表示非離子氨和總氨氮濃度。水體中總氨氮濃度與非離子濃度的對(duì)應(yīng)關(guān)系如表1所示。

表1　水體中總氨氮濃度與非離子氨濃度的對(duì)應(yīng)關(guān)系

2結(jié)果與分析

2.1氨氮對(duì)偏頂蛤的急性毒性根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果繪制氨氮濃度對(duì)數(shù)值與死亡率的關(guān)系曲線(xiàn)(圖1)。從圖1和表2可以看出，在海水溫度19～20 ℃、鹽度31.20‰、pH 8.20的條件下，不同氨氮濃度下偏頂蛤72 h死亡率均較低，低于20%。96 h，試驗(yàn)蛤死亡率隨氨氮濃度的升高而增加，總氨氮濃度267.48 mg/L的處理組偏頂蛤全部死亡。偏頂蛤?qū)偘焙头请x子氨的96 h半致死濃度分別為158.85和14.06 mg/L，相應(yīng)的安全濃度分別為15.89和1.41 mg/L。

2.2亞硝酸氮對(duì)偏頂蛤的急性毒性根據(jù)測(cè)定的不同亞硝酸鹽濃度下偏頂蛤的死亡率，繪制濃度對(duì)數(shù)值與死亡率的關(guān)系曲線(xiàn)(圖2)。從圖2和表3可以看出，不同濃度亞硝酸氮對(duì)偏頂蛤的毒性效果明顯。相同時(shí)間內(nèi)，亞硝酸氮濃度越高，毒性越強(qiáng)，試驗(yàn)蛤的死亡率就越高；不同濃度亞硝酸氮處理組試驗(yàn)蛤死亡率隨脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)而增加。偏頂蛤?qū)喯跛岬?6 h半致死濃度為54.20 mg/L，相應(yīng)的安全濃度為5.42 mg/L。

圖1　不同總氨氮濃度對(duì)偏頂蛤死亡率的影響Fig.1　Effects of total ammonia nitrogen concentration on mortality rate of M.modiolus

氮存在形式Formsofnitrogen回歸方程RegressionequationR值RvalueLC50mg/L95%置信區(qū)間95%confidenceinterval安全濃度Safeconcentration∥mg/LNH3-NtY=4.118X-3.970.924158.85133.97～197.2415.89NH3-NmY=4.121X+0.3610.92414.0611.86～17.461.41

圖2　不同亞硝酸氮濃度對(duì)偏頂蛤死亡率的影響Fig.2　Effects of nitrite nitrogen concentration on mortality rate of M. modiolus

3討論與結(jié)論

3.1氨氮與亞硝酸氮的來(lái)源及對(duì)偏頂蛤致死機(jī)理相關(guān)研究表明，海產(chǎn)貝類(lèi)氨排泄量占總排泄量的70%左右[9]。自然條件下，偏頂蛤常附著在低潮下區(qū)礁石和海底礫石上，喜群聚生活[10]。因此，偏頂蛤人工增養(yǎng)殖過(guò)程中大量殘餌、排泄物易堆積；加之養(yǎng)殖水環(huán)境定期使用消毒藥物，殺滅病原微生物的同時(shí)，有益微生物隨之消失或減少，大量積累的氨氮硝化過(guò)程受抑制，導(dǎo)致養(yǎng)殖水體中氨氮和亞硝酸氮等有害物質(zhì)含量增加[6]。自然水體中亞硝酸氮濃度較低，對(duì)海產(chǎn)貝類(lèi)的毒害作用較小，但在高密度集約化養(yǎng)殖過(guò)程中氨氮積累、硝化細(xì)菌活力降低和硝化作用失衡都可能引起亞硝酸氮濃度升高[11]。

氨氮在水體中以離子氨和非離子氨2種形式存在，二者可相互轉(zhuǎn)化，當(dāng)pH小于7時(shí)主要以離子氨形式存在，毒性小；當(dāng)pH大于7時(shí)，大多以分子氨形式存在；當(dāng)pH大于11時(shí)，幾乎以分子氨形式存在。分子氨有較強(qiáng)的脂溶性，易穿透脂質(zhì)性細(xì)胞膜，改變貝類(lèi)體內(nèi)滲透壓，破壞鰓組織；分子氨進(jìn)入血液，抑制血液載氧能力，嚴(yán)重時(shí)可引起偏頂蛤窒息甚至死亡[10，12]。

表3　亞硝酸氮對(duì)偏頂蛤的半致死濃度(LC50)及95%置信區(qū)間

亞硝酸氮可降低體內(nèi)抗氧化酶(如酚氧化酶、溶菌酶)的活力，降低水產(chǎn)動(dòng)物的免疫力，誘發(fā)多種疾病[13]。亞硝酸氮進(jìn)入血液，可將血紅蛋白分子的亞鐵離子氧化為三價(jià)鐵離子，破壞載氧蛋白結(jié)構(gòu)和功能，降低其載氧能力，造成組織缺氧、代謝紊亂、神經(jīng)麻痹甚至死亡[13-15]。養(yǎng)殖水體中亞硝酸氮進(jìn)入蝦類(lèi)血液，可將氧合血藍(lán)蛋白轉(zhuǎn)化為脫氧血藍(lán)蛋白，降低血淋巴運(yùn)氧能力，從而使貝類(lèi)機(jī)體缺氧甚至致死[16]。

3.2偏頂蛤?qū)Π钡蛠喯跛岬哪褪苣芰?/p>

3.2.1中毒癥狀。該試驗(yàn)結(jié)果表明，高濃度組氨氮和亞硝酸氮對(duì)偏頂蛤均具有較強(qiáng)的毒害作用，其中毒癥狀相似。24 h內(nèi)絕大多數(shù)偏頂蛤可正常開(kāi)閉殼，受刺激時(shí)閉殼迅速，足伸出活動(dòng)；24 h后試驗(yàn)蛤多數(shù)閉殼，少數(shù)開(kāi)殼刺激緩慢閉合。偏頂蛤貝殼大、閉殼肌強(qiáng)大有力，主動(dòng)閉殼機(jī)制增強(qiáng)其對(duì)毒性的耐受力，這與泥蚶(Tegillarcagranosa)能耐受較高濃度氨氮毒性的機(jī)理一致[17]。隨著攻毒時(shí)間的延長(zhǎng)，偏頂蛤貝殼張開(kāi)，反應(yīng)遲鈍；足無(wú)力伸長(zhǎng)，刺激收縮慢或不收縮；內(nèi)臟團(tuán)開(kāi)始脫水萎縮，外套膜和鰓絲開(kāi)始腐爛；出現(xiàn)雌雄產(chǎn)卵排精現(xiàn)象，精卵排放后不擴(kuò)散。氨氮低濃度組，偏頂蛤短時(shí)間內(nèi)(24 h)不出現(xiàn)中毒癥狀，隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸表現(xiàn)出中毒癥狀；低濃度亞硝酸氮組偏頂蛤中毒癥狀較早出現(xiàn)。

3.2.2毒性比較。該試驗(yàn)結(jié)果表明，偏頂蛤?qū)偘钡?6 h半致死濃度是亞硝酸氮的2.95倍，而偏頂蛤?qū)喯跛岬?6 h半致死濃度是非離子氨的3.83倍，表明非離子氨對(duì)偏頂蛤的毒性遠(yuǎn)大于亞硝酸氮的毒性，因此非離子氨毒性在偏頂蛤增養(yǎng)殖過(guò)程中應(yīng)著重考慮。王娟等[18]研究亞硝酸鹽和氨氮對(duì)中國(guó)對(duì)蝦(Fenneropenaeuschinensis)急性毒性效應(yīng)得出了相似的結(jié)論。與氨氮毒性相比，偏頂蛤?qū)Φ蜐舛葋喯跛岬拘愿鼮槊舾校瑩?jù)此推測(cè)這可能與偏頂蛤生存水體中高氨氮低亞硝酸氮有關(guān)。

3.3氨氮和亞硝酸氮的防控措施養(yǎng)殖水體中氨氮和亞硝酸氮對(duì)生物有機(jī)體的毒性受多種因子的影響，如pH、溫度、鹽度、溶解氧、受試動(dòng)物規(guī)格和生理狀態(tài)[19-24]。相關(guān)研究表明，鹽度越低，氨氮和亞硝酸氮毒性越強(qiáng)[20-21，23]，適當(dāng)增加鹽度有助于緩解養(yǎng)殖水體中氨氮和亞硝酸氮的毒性。海水pH對(duì)氨氮毒性的影響顯著，pH越高，氨氮毒性越強(qiáng)。相關(guān)研究表明，pH升高1.0，則氨氮毒性增強(qiáng)近10倍[20]；海水中亞硝酸氮的毒性隨pH的升高而降低[22]。因此，維持養(yǎng)殖水環(huán)境中適宜pH十分關(guān)鍵，高密度養(yǎng)殖水產(chǎn)動(dòng)物時(shí)應(yīng)做到長(zhǎng)期監(jiān)測(cè)，定期調(diào)整。同時(shí)，適當(dāng)增加溶解氧可以有效降低水體中氨氮和亞硝酸氮的毒性[24]。因此，水產(chǎn)動(dòng)物養(yǎng)殖過(guò)程中應(yīng)保證養(yǎng)殖水體充足的曝氣時(shí)間，維持較高的溶氧量。此外，控制水產(chǎn)動(dòng)物放養(yǎng)密度，以減少自身污染，使用生態(tài)制劑來(lái)改良水質(zhì)，定期倒池、清塘消毒等均可以有效降低養(yǎng)殖水環(huán)境中氨氮和亞硝酸氮的毒性。

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Acute Toxicity of Ammonia Nitrogen and Nitrite toModiolusmodiolus

ZHANG Xiao-sen, NING Jun-hao, CHANG Ya-qing*et al

(Key Laboratory of Mariculture & Stock Enhancement in North China’s Sea, Ministry of Agriculture, Dalian Ocean University, Dalian, Liaoning 116023)

Abstract[Objective] To research the acute toxicity of ammonia nitrogen and nitrite to Modiolus modiolus, and to provide references for the rational adjustment of ammonia nitrogen and nitrite nitrogen in M. modiolus. [Method] Conventional biological toxicity test was used to research the tolerance of M. modiolus to ammonia nitrogen and nitrite.[Result] The 96 h LC50of total ammonia nitrogen, non-ionic ammonia nitrogen and nitrite nitrogen to M. modiolus were 158.85, 14.06 and 54.20 mg/L, respectively. And the safe concentrations (SC) of total ammonia nitrogen, non-ionic ammonia nitrogen and nitrite nitrogen to the mussels were 15.89, 1.41 and 5.42 mg/L, respectively. [Conclusion] M. modiolus has stronger tolerance to total ammonia nitrogen toxicity than nitrite nitrogen, and the high toxicity occurs in non-ionic ammonia nitrogen.

Key wordsModiolus modiolus; Non-ionic ammonia nitrogen; Nitrite nitrogen; Tolerance

基金項(xiàng)目國(guó)家海洋局海洋公益項(xiàng)目(201505016)；遼寧省科技攻關(guān)重大項(xiàng)目(2015203003)。

作者簡(jiǎn)介張曉森(1991- )，男，河北邢臺(tái)人，碩士研究生，研究方向：水產(chǎn)動(dòng)物繁育。*通訊作者，教授，博士，博士生導(dǎo)師，從事海洋生物學(xué)及水產(chǎn)動(dòng)物繁育方面的研究。

收稿日期2016-02-19

中圖分類(lèi)號(hào)S 912

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A

文章編號(hào)0517-6611(2016)08-115-03