氨氮和亞硝酸氮對偏頂蛤的急性毒性研究

張曉森，寧軍號，常亞青，李 磊，李開全

(大連海洋大學，農業部北方海水增養殖重點實驗室，遼寧大連 116023)

?

氨氮和亞硝酸氮對偏頂蛤的急性毒性研究

張曉森，寧軍號，常亞青*，李 磊，李開全

(大連海洋大學，農業部北方海水增養殖重點實驗室，遼寧大連 116023)

摘要[目的]研究氨氮和亞硝酸氮對偏頂蛤的急性毒性，為合理調控偏頂蛤水體中氨氮與亞硝酸氮提供參考價值。[方法]采用常規生物毒性試驗方法，研究偏頂蛤對氨氮和亞硝酸氮毒性的耐受力。[結果]氨氮對偏頂蛤的半致死濃度96 h LC50為158.85 mg/L，安全濃度(SC)為15.89 mg/L；非離子氨對偏頂蛤半致死濃度96 h LC50為14.06 mg/L，安全濃度(SC)為1.41 mg/L。亞硝酸氮對試驗蛤的半致死濃度96 h LC50為54.20 mg/L，安全濃度(SC)為5.42 mg/L。[結論]與亞硝酸鹽相比，偏頂蛤對總氨氮毒性的耐受力更強，非離子氨對偏頂蛤的毒性最強。

關鍵詞偏頂蛤；非離子氨；亞硝酸氮；耐受力

偏頂蛤(ModiolusmodiolusLinnaéus)俗稱毛海紅，隸屬軟體動物門瓣鰓綱貽貝目貽貝科偏頂蛤屬。20世紀80年代偏頂蛤在我國黃海、渤海資源十分豐富，自潮間帶下區到水深50 m的淺海均有分布。偏頂蛤個體大、肉質鮮美、高蛋白、低脂肪，具有較高的市場價值和開發潛力[1-2]。

近年來，我國海產貝類增養殖業快速發展，但對其自然資源缺乏系統管理和保護，加上海域污染、種質退化日趨嚴重，偏頂蛤、厚殼貽貝(Mytiluscoruscus)、翡翠貽貝(Pernaviridis)的自然儲存量已大幅度減少[2-3]。貝類人工繁育與室內工廠化養殖是解決其資源匱乏的主要措施，而養殖水體是制約貝類生產實踐的重要因素[4-5]。研究表明，氨氮與亞硝酸氮是養殖水環境中制約水產動物生長和發育的主要因子之一，當其濃度超標時，不僅會對養殖動物產生直接毒害，而且能誘發多種疾病[6]。尤其在高密度養殖過程中，大量殘餌、排泄物和尸體等含氮有機物經過微生物分解產生氨氮、亞硝酸氮等有毒物質，且隨著養殖時間的增加不斷積累。因此，氨氮和亞硝酸氮在海產貝類集約化養殖過程中普遍存在，并限制著貝類增養殖業的進一步發展[7]。筆者以成體偏頂蛤為研究對象，研究了氨氮和亞硝酸氮對偏頂蛤的急性毒性效應，旨在為其養殖業的健康穩定發展提供理論參考。

1材料與方法

1.1試驗材料試驗用偏頂蛤采自大連黑石礁海域，殼長(81.32 ± 6.20)mm，殼高(45.97 ±3.87)mm，殼寬(39.27 ± 3.02)mm，濕質量(93.79 ± 8.13)g，運回實驗室暫養。暫養期間投喂金藻，輔以螺旋藻，早晚各投喂1次/d，投餌前換水1/2。暫養7d后進行毒性試驗，試驗前24h停止投喂，試驗期間不投餌。海水經過3級沙濾，溫度19～20 ℃，鹽度31.20%，pH為8.20。

試劑所用分析純NH4Cl和NaNO2(藥品均由天津市大茂化學試劑廠生產，相對分子量分別為53.49和69.00)，烘干至恒重，用海水溶解后配制成20g/L的母液，避光冷藏保存，備用。

1.2試驗方法預試驗初步確定試驗蛤對氨氮和亞硝酸氮的耐受能力。根據預試驗結果，用移液管吸取一定量配制的母液，總氨濃度分別為67.29、84.45、106.32、134.58、168.22、212.30、267.48mg/L；亞硝酸氮濃度分別設為23.67、42.67、75.00、133.33、236.67、420.67mg/L。每個濃度組設置3個平行，每個平行14只偏頂蛤，同時設置3組不添加NH4Cl和NaNO2的空白對照組，每組14只偏頂蛤。試驗用50L藍色聚乙烯塑料水槽為容器，每個水槽注入上述配制的試驗液40L。

試驗期間不投喂、不充氣，以保證NH4Cl和NaNO2濃度相對穩定，每24h全部更換試驗液1次。每天觀察偏頂蛤的中毒癥狀、活動和死亡情況，記錄24、48、72、96h的死亡數。偏頂蛤貝殼大開，刺激不能閉合，放入正常海水中5h不能閉合，則判定為死亡。

1.3數據處理試驗數據使用SPSS17.0統計軟件進行統計與分析，采用直線內插法計算96h半數致死濃度和95%置信區間。使用以下公式計算96h半致死濃度及安全濃度[8]：

LC50=C1+(P1-50%)×(C2-C1)/(P1-P2)

(1)

SC=0.1×96hLC50

(2)

式中，C1和C2分別表示成活率最接近50%的低濃度和高濃度，P1和P2分別表示C1和C2濃度對應的成活率。

按照以下公式計算非離子態氮濃度：

CNH3-Nm=CNH3-Nt/[10(pKa-pH)+ 1]

(3)

式中，pKa= 0.090 18 +2 729.92/T，pKa為NH4-N表觀電離常數的負對數，T為開氏溫度，T= 273 +t(℃)，t為試驗時海水溫度；CNH3-Nm和CNH3-Nt分別表示非離子氨和總氨氮濃度。水體中總氨氮濃度與非離子濃度的對應關系如表1所示。

表1　水體中總氨氮濃度與非離子氨濃度的對應關系

2結果與分析

2.1氨氮對偏頂蛤的急性毒性根據試驗結果繪制氨氮濃度對數值與死亡率的關系曲線(圖1)。從圖1和表2可以看出，在海水溫度19～20 ℃、鹽度31.20‰、pH 8.20的條件下，不同氨氮濃度下偏頂蛤72 h死亡率均較低，低于20%。96 h，試驗蛤死亡率隨氨氮濃度的升高而增加，總氨氮濃度267.48 mg/L的處理組偏頂蛤全部死亡。偏頂蛤對總氨和非離子氨的96 h半致死濃度分別為158.85和14.06 mg/L，相應的安全濃度分別為15.89和1.41 mg/L。

2.2亞硝酸氮對偏頂蛤的急性毒性根據測定的不同亞硝酸鹽濃度下偏頂蛤的死亡率，繪制濃度對數值與死亡率的關系曲線(圖2)。從圖2和表3可以看出，不同濃度亞硝酸氮對偏頂蛤的毒性效果明顯。相同時間內，亞硝酸氮濃度越高，毒性越強，試驗蛤的死亡率就越高；不同濃度亞硝酸氮處理組試驗蛤死亡率隨脅迫時間的延長而增加。偏頂蛤對亞硝酸氮的96 h半致死濃度為54.20 mg/L，相應的安全濃度為5.42 mg/L。

圖1　不同總氨氮濃度對偏頂蛤死亡率的影響Fig.1　Effects of total ammonia nitrogen concentration on mortality rate of M.modiolus

氮存在形式Formsofnitrogen回歸方程RegressionequationR值RvalueLC50mg/L95%置信區間95%confidenceinterval安全濃度Safeconcentration∥mg/LNH3-NtY=4.118X-3.970.924158.85133.97～197.2415.89NH3-NmY=4.121X+0.3610.92414.0611.86～17.461.41

圖2　不同亞硝酸氮濃度對偏頂蛤死亡率的影響Fig.2　Effects of nitrite nitrogen concentration on mortality rate of M. modiolus

3討論與結論

3.1氨氮與亞硝酸氮的來源及對偏頂蛤致死機理相關研究表明，海產貝類氨排泄量占總排泄量的70%左右[9]。自然條件下，偏頂蛤常附著在低潮下區礁石和海底礫石上，喜群聚生活[10]。因此，偏頂蛤人工增養殖過程中大量殘餌、排泄物易堆積；加之養殖水環境定期使用消毒藥物，殺滅病原微生物的同時，有益微生物隨之消失或減少，大量積累的氨氮硝化過程受抑制，導致養殖水體中氨氮和亞硝酸氮等有害物質含量增加[6]。自然水體中亞硝酸氮濃度較低，對海產貝類的毒害作用較小，但在高密度集約化養殖過程中氨氮積累、硝化細菌活力降低和硝化作用失衡都可能引起亞硝酸氮濃度升高[11]。

氨氮在水體中以離子氨和非離子氨2種形式存在，二者可相互轉化，當pH小于7時主要以離子氨形式存在，毒性小；當pH大于7時，大多以分子氨形式存在；當pH大于11時，幾乎以分子氨形式存在。分子氨有較強的脂溶性，易穿透脂質性細胞膜，改變貝類體內滲透壓，破壞鰓組織；分子氨進入血液，抑制血液載氧能力，嚴重時可引起偏頂蛤窒息甚至死亡[10，12]。

表3　亞硝酸氮對偏頂蛤的半致死濃度(LC50)及95%置信區間

亞硝酸氮可降低體內抗氧化酶(如酚氧化酶、溶菌酶)的活力，降低水產動物的免疫力，誘發多種疾病[13]。亞硝酸氮進入血液，可將血紅蛋白分子的亞鐵離子氧化為三價鐵離子，破壞載氧蛋白結構和功能，降低其載氧能力，造成組織缺氧、代謝紊亂、神經麻痹甚至死亡[13-15]。養殖水體中亞硝酸氮進入蝦類血液，可將氧合血藍蛋白轉化為脫氧血藍蛋白，降低血淋巴運氧能力，從而使貝類機體缺氧甚至致死[16]。

3.2偏頂蛤對氨氮和亞硝酸氮的耐受能力

3.2.1中毒癥狀。該試驗結果表明，高濃度組氨氮和亞硝酸氮對偏頂蛤均具有較強的毒害作用，其中毒癥狀相似。24 h內絕大多數偏頂蛤可正常開閉殼，受刺激時閉殼迅速，足伸出活動；24 h后試驗蛤多數閉殼，少數開殼刺激緩慢閉合。偏頂蛤貝殼大、閉殼肌強大有力，主動閉殼機制增強其對毒性的耐受力，這與泥蚶(Tegillarcagranosa)能耐受較高濃度氨氮毒性的機理一致[17]。隨著攻毒時間的延長，偏頂蛤貝殼張開，反應遲鈍；足無力伸長，刺激收縮慢或不收縮；內臟團開始脫水萎縮，外套膜和鰓絲開始腐爛；出現雌雄產卵排精現象，精卵排放后不擴散。氨氮低濃度組，偏頂蛤短時間內(24 h)不出現中毒癥狀，隨著脅迫時間的延長而逐漸表現出中毒癥狀；低濃度亞硝酸氮組偏頂蛤中毒癥狀較早出現。

3.2.2毒性比較。該試驗結果表明，偏頂蛤對總氨的96 h半致死濃度是亞硝酸氮的2.95倍，而偏頂蛤對亞硝酸氮96 h半致死濃度是非離子氨的3.83倍，表明非離子氨對偏頂蛤的毒性遠大于亞硝酸氮的毒性，因此非離子氨毒性在偏頂蛤增養殖過程中應著重考慮。王娟等[18]研究亞硝酸鹽和氨氮對中國對蝦(Fenneropenaeuschinensis)急性毒性效應得出了相似的結論。與氨氮毒性相比，偏頂蛤對低濃度亞硝酸氮毒性更為敏感，據此推測這可能與偏頂蛤生存水體中高氨氮低亞硝酸氮有關。

3.3氨氮和亞硝酸氮的防控措施養殖水體中氨氮和亞硝酸氮對生物有機體的毒性受多種因子的影響，如pH、溫度、鹽度、溶解氧、受試動物規格和生理狀態[19-24]。相關研究表明，鹽度越低，氨氮和亞硝酸氮毒性越強[20-21，23]，適當增加鹽度有助于緩解養殖水體中氨氮和亞硝酸氮的毒性。海水pH對氨氮毒性的影響顯著，pH越高，氨氮毒性越強。相關研究表明，pH升高1.0，則氨氮毒性增強近10倍[20]；海水中亞硝酸氮的毒性隨pH的升高而降低[22]。因此，維持養殖水環境中適宜pH十分關鍵，高密度養殖水產動物時應做到長期監測，定期調整。同時，適當增加溶解氧可以有效降低水體中氨氮和亞硝酸氮的毒性[24]。因此，水產動物養殖過程中應保證養殖水體充足的曝氣時間，維持較高的溶氧量。此外，控制水產動物放養密度，以減少自身污染，使用生態制劑來改良水質，定期倒池、清塘消毒等均可以有效降低養殖水環境中氨氮和亞硝酸氮的毒性。

參考文獻

[1] 齊鐘彥，馬繡同，王禎瑞，等.黃渤海的軟體動物[M].北京：農業出版社，1987：164-166.

[2] 寧軍號，宋堅，常亞青，等.偏頂蛤性腺發育和生殖周期[J].中國水產科學，2015，22(3)：469-477.

[3] 寧軍號，胡盼，宋堅，等.幾種環境因子對偏頂蛤浮游幼蟲生長和發育的影響[J].大連海洋大學學報，2014，29(6)：601-606.

[4] 常亞青.貝類增養殖學[M].北京：中國農業出版社，2007：65-71.

[3] 雷衍之.養殖水環境化學[M].北京：中國農業出版社，2004：11-13.

[4] 王如才，王昭萍，張建中.海水貝類養殖學[M].青島：青島海洋大學出版社，2003：4-6.

[5] 劉媛，王建，孫建峰，等.我國海洋貝類資源的利用現狀和發展趨勢[J].現代食品科技，2013，29(3)：673-676.

[6] 呂富，黃金田，呂林蘭，等.不同鹽度條件下氨氮對雙齒圍沙蠶的毒性研究[J].安徽農業科學，2009，37(7)：2986-2987，2994.

[7] 孫艦軍，丁美麗.氨氮對中國對蝦抗病力的影響[J].海洋與湖沼，1999，30(3)：267-272.

[8] SPRAGUE J B.Measurement of pollutant toxicity of fish III.Sublethal effects and safe concentrations[J].Water research，1971，5：245-266.

[9] 王清印.海水養殖與碳匯漁業[M].北京：海洋出版社，2012：527-530.

[10] 常亞青.貝類增養殖學[M].北京：中國農業出版社，2007：72-74.

[11] 白秀娟，馮波，盧伙勝，等.亞硝酸鹽對文昌魚的急性毒性效應[J].安徽農業科學，2013，41(20)：8522-8524.

[12] ARMSTRONG D A，CHIPPENDALE D，KNIGHT A W.Interaction of ionized and un-ionized ammonia on short-term survival and growth of prawn larvae，Macrobrachiumrosenbergii[J].Biological bulletin，1978，154：15-31.

[13] ALDERSON R.The effect of ammonia on the growth of juvenile dover sole，Solesole( L.)and turbot，Scophthalmusmaximus(L.)[J].Aquaculture，1979，17( 4)：291-309.

[14] PERSON L E，RUYET J，CHARTOIS H，et al.Comparative acute ammonia toxicity in marine fish and plasma ammonia response[J].Aquaculture，1995，136(1)：181-194.

[15] 潘小玲，陳百悅，樊海平.非離子氨及亞硝酸鹽對歐洲鰻鱺的急性毒性試驗[J].水產科技情報，1998，25(1)：20-23.

[16] CHENG S Y， CHEN J C.Haemocyanin oxygen affinity and the fractionation of oxyhem ocyanin and deoxy hemocy anin forPenaeusmonodomexposed to elevated nitrite[J].Aquat toxicol，1999，45：35-46.

[17] 呂永林，張永普，單賽賽，等.不同溫度條件下氨氮對泥蚶的急性毒性影響[J].浙江海洋學院學報，2012，31(1)：55-64.

[18] 王娟，曲克明，劉海英，等.不同溶氧條件下亞硝酸鹽和氨氮對中國對蝦的急性毒性效應[J].海洋水產研究，2007，28(6)：1-6.

[19] 賴曉芳，沈善瑞，呂海波.氨態氮和pH對脊尾白蝦氮磷代謝的影響[J].安徽農業科學，2013，41(13)：5745-5746.

[20] 師尚麗，馬奕成，鄭蓮，等.不同pH和鹽度下氨氮對方斑東風螺的毒性研究[J].湛江海洋大學學報，2005，25(6)：36-40.

[21] CHEN J C，NAN F H.Changes of oxygen consumption and ammonia-N excretion byPenaeuschinensisOsbeck at different temperature and salinity levels[J].Journal of crustacean biology，1993(4)：706-712.

[22] 郭增華，王秋燕.亞硝酸鹽氮對方斑東風螺毒性的研究[J].海洋水產研究，27(6)：88-92.

[23] 黃翔鵠，李長玲，鄭蓮，等.亞硝酸鹽氮對凡納濱對蝦毒性和抗病相關因子影響[J].水生生物學報，2006，30(4)：466-471，907

[24] 曲克明，徐勇，馬紹賽，等.不同溶氧條件下亞硝酸鹽和非離子氨對大菱鲆的急性毒性效應[J].海洋水產研究，2007，28(4)：83-88.

Acute Toxicity of Ammonia Nitrogen and Nitrite toModiolusmodiolus

ZHANG Xiao-sen, NING Jun-hao, CHANG Ya-qing*et al

(Key Laboratory of Mariculture & Stock Enhancement in North China’s Sea, Ministry of Agriculture, Dalian Ocean University, Dalian, Liaoning 116023)

Abstract[Objective] To research the acute toxicity of ammonia nitrogen and nitrite to Modiolus modiolus, and to provide references for the rational adjustment of ammonia nitrogen and nitrite nitrogen in M. modiolus. [Method] Conventional biological toxicity test was used to research the tolerance of M. modiolus to ammonia nitrogen and nitrite.[Result] The 96 h LC50of total ammonia nitrogen, non-ionic ammonia nitrogen and nitrite nitrogen to M. modiolus were 158.85, 14.06 and 54.20 mg/L, respectively. And the safe concentrations (SC) of total ammonia nitrogen, non-ionic ammonia nitrogen and nitrite nitrogen to the mussels were 15.89, 1.41 and 5.42 mg/L, respectively. [Conclusion] M. modiolus has stronger tolerance to total ammonia nitrogen toxicity than nitrite nitrogen, and the high toxicity occurs in non-ionic ammonia nitrogen.

Key wordsModiolus modiolus; Non-ionic ammonia nitrogen; Nitrite nitrogen; Tolerance

基金項目國家海洋局海洋公益項目(201505016)；遼寧省科技攻關重大項目(2015203003)。

作者簡介張曉森(1991- )，男，河北邢臺人，碩士研究生，研究方向：水產動物繁育。*通訊作者，教授，博士，博士生導師，從事海洋生物學及水產動物繁育方面的研究。

收稿日期2016-02-19

中圖分類號S 912

文獻標識碼A

文章編號0517-6611(2016)08-115-03