不同培養方式產縱條紋炭角菌的指紋圖譜分析

黃 毅，袁小紅，賀新生,宋 航

(1.四川大學制藥與生物工程系,四川成都 610065;2.西南科技大學生命科學與工程學院,四川綿陽 621010)

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不同培養方式產縱條紋炭角菌的指紋圖譜分析

黃 毅1,2，袁小紅2，賀新生2,宋 航1*

(1.四川大學制藥與生物工程系,四川成都 610065;2.西南科技大學生命科學與工程學院,四川綿陽 621010)

摘要[目的]采用高效液相色譜法建立縱條紋炭角菌指紋圖譜分析方法，比較該菌5種培養物的化學成分差異。[方法]色譜柱為Agilent Eclipse XDB C18(150.0 mm×4.6 mm，5.0 μm)，流動相為乙腈-水梯度洗脫，檢測波長210 nm，流速0.8 mL/min，溫度25 ℃。測定指紋圖譜后，應用相似度分析和系統聚類分析對不同培養物的化學成分進行比較。 [結果]建立了縱條紋炭角菌HPLC指紋圖譜分析方法，在色譜指紋圖譜中，確定了35個共有峰，根據相似度分析、系統聚類分析的結果確定棉籽殼和麩皮共培養的縱條紋炭角菌與野生條紋炭角菌化學成分最為相似。[結論]該方法簡便、穩定且重現性好，可用于縱條紋炭角菌培養物的質量控制和培養方法篩選。

關鍵詞縱條紋炭角菌；指紋圖譜；HPLC；相似度分析；聚類分析

高等藥食真菌中富含豐富的天然活性化合物，其結構新穎，藥理活性強，是醫藥業開發的重要資源。但野生菌難于獲取，需要人工培養物進行替代。兩者由于生長環境不同，其內部化學物種類及含量會有較大差異，采用指紋圖譜技術對比分析既可將差異定量化，又便于未來人工培養物用于醫藥品質量標準的建立。縱條紋炭角菌(XylariastriataPat.)，屬子囊菌門、盤菌亞門、糞殼菌綱、炭角菌亞綱、炭角菌目、炭角菌科、炭角菌屬藥食真菌，原始標本采自我國南京棕櫚樹Trachycarpus老樹干上[1]。現有文獻已逐步報道了同屬多種炭角菌具有各種活性小分子[2-7]。同屬目前開發最好的是黑柄炭角菌，又名“烏靈參”，是四川、云南等地著名的補氣中藥，具有改善中樞神經系統、造血、抗前列腺增生以及提高機體免疫等功能[8]，已有醫藥產品上市銷售。筆者所在課題組于2012年在四川省綿陽市發現了該種并對該菌展開系統性研究，先期完成了培養優化工作[9-11]，并在生物活性初篩時，發現該菌提取物具有抗菌[12]和抗腫瘤[13]活性。為了后續活性化合物的發現，筆者建立了縱條紋炭角菌HPLC指紋圖譜分析方法，并對多種培養方式產培養物與野生菌化學成分進行比較，以便于后期的開發利用。

1材料與方法

1.1儀器1260型高效液相色譜儀(美國安捷倫科技有限公司)，Acculab Alc電子天平(德國賽多利斯科技儀器有限公司)，R-100旋轉蒸發儀(瑞士步琪公司)，KQ5200DE型數控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2試藥麥角甾醇對照品(純度97.0%)，云南西力生物技術股份有限公司；高效液相色譜用乙腈為色譜純，美國Fisher公司；超純水(18.2 ΩPa)為西南科技大學制藥工藝學實驗室自制，其他試劑均為國產分析純。

1.3樣品人工培養縱條紋炭角菌樣品5份，野生縱條紋炭角菌樣品1份(經賀新生教授鑒定為XylariastriataPat.1887)，樣品編號、名稱、部位和培養方式見表1。所有子實體樣品除雜風干并經50 ℃烘干，菌絲體經紗布過濾純水洗滌后經50 ℃烘干。所有樣品經小型中藥粉碎機粉碎后過30目篩避光保存備用。

表1　縱條紋炭角菌樣品來源

1.4方法

1.4.1對照品溶液的制備。精密稱取麥角甾醇對照品5.0 mg，置于10 mL棕色容量瓶中，加甲醇溶解并定容即得對照品溶液(0.5 mg/mL)，置于4 ℃避光保存備用。

1.4.2供試品溶液的制備。精密稱取各樣品粉末0.5 g，置于50 mL具塞錐形瓶中，精密加入甲醇20 mL，密塞，稱重，超聲(功率300 W，頻率40 kHz)處理20 min，冷卻至室溫，再稱重，用甲醇補足減失的重量，搖勻，用0.22 μm微孔濾膜過濾，取濾液即得供試品溶液(0.025 g/mL)，置于4 ℃避光保存備用。

1.4.3色譜條件。Agilent Eclipse XDB C18色譜柱(150.0 mm×4.6 mm，5.0 μm)，流動相為乙腈(A):水(B)梯度洗脫(0～50 min，5%～100%A；50～60 min，100%A)，再次進樣前平衡時間30 min，流速0.8 mL/min，檢測波長210 nm，進樣量5 μL，溫度25 ℃。

圖1　生長在槐樹樹干基部的野生子實體Fig.1　Wild fruiting body growing in the trunk base of Styphnolobium japonicum

注：底部為棉籽殼和麩皮的固體培養基。Note:Bottom was the solid medium of cottonseed hulls and brans.圖2　棉籽殼和麩皮固體共培養產子實體Fig.2　Fruiting body cultured in cottonseed hulls and brans

2結果與分析

2.1指紋圖譜方法學考察

2.1.1精密度。取野生縱條紋炭角菌子實體樣品(S3)適量，按“1.4.2”方法制備樣品，連續進樣6針，考察各針中各個共有峰相對保留時間及相對峰面積的一致性。采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統軟件》(2004A版)對所得的色譜圖進行評價，所有色譜圖的相似度值不低于0.900，從自動匹配后的共有峰中選擇面積較大的21個峰，以19號峰為參照峰S，考察共有峰相對保留時間和相對峰面積，結果各共有峰與參照峰相對保留時間的RSD均小于0.5%，相對峰面積的RSD均小于2.91%，表明儀器精密度較好，符合指紋圖譜要求。

2.1.2重復性。取野生縱條紋炭角菌子實體樣品(S3)適量，按“1.4.2”方法制備樣品，分別取6份供試品溶液進樣測定。以《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統軟件》(2004A版)評價，結果顯示，各共有峰相對保留時間的RSD為0.5%～0.7%，相對峰面積的RSD為1.5%～2.9% ，表明該方法重復性良好，符合指紋圖譜的技術要求。

2.1.3穩定性。取野生縱條紋炭角菌子實體樣品(S3)適量，按“1.4.2”方法制備樣品，分別在 0、2、4、6、8、10 h進樣，檢測指紋圖譜。以《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統軟件》( 2004A版) 評價，結果顯示，各共有峰相對保留時間的RSD為0.3%～0.4%，相對峰面積的RSD為1.2%～2.1%，表明供試品溶液在10 h內穩定性良好。

2.2不同培養方式下樣品指紋圖譜的建立及分析分別將6種樣品按“1.4.2”方法制備后，在“1.4.3”色譜條件下測定，記錄色譜圖(圖3)。采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統》( 2004A 版) 對樣品的圖譜數據進行分析，確定35個色譜峰為其特征峰。經對照品確定，32號峰為麥角甾醇，其保留時間適中，峰面積較大且穩定，峰形較好，各樣品中均具有一定含量，故選擇其為內參照峰，將其保留時間和色譜峰面積設為1，將其他特征峰的保留時間與峰面積和參照峰的保留時間與峰面積相比，得到各峰的相對保留時間和相對峰面積(表2)。按以上方法計算各樣品35個共有指紋峰的相對保留時間和相對峰面積，結果差異明顯。

圖3　6種樣品的HPLC指紋圖譜Fig.3　HPLC fingerprint of six samples

2.3指紋圖譜相似度評價采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統軟件》(2004A版)對6種樣品分別進行相似度評價，設定S3為參照圖譜，中位數法，時間窗口寬度0.1，將其樣品的色譜圖與參照圖進行自動匹配，建立共有模式，計算其他條件培養的條紋炭角菌與野生條紋炭角菌的相似度(表3)。由表3可知，S3和S4最相似，即棉籽殼和麩皮共培養的條紋炭角菌子實體與野生條紋炭角菌子實體最相似，其次依次是S1、S2、S5、S6。

表2　樣品共有峰的相對峰面積

表3　6種樣品的相似度

2.4樣品的聚類分析將6種樣品HPLC圖譜中35個共有峰的相對保留時間運用SPSS19.0軟件對其進行分析，采用最近鄰元素法，利用平方歐式距離作為樣品的測度。由圖4可知，S3和S1、S2、S4聚為第I類，該結果與指紋圖譜相似度分析結果相似。

圖4　系統聚類分析Fig.4　Results of hierarchical cluster analysis

3結論與討論

該試驗利用DAD檢測器同時考察了多個檢測波長(210、220、240、254、280、300、320和360 nm)的指紋圖譜，結果表明在210 nm下的色譜信號多，峰形好。同時考察了60 min以上梯度洗脫效果，結果表明60 min即可將重疊的圖譜峰分離開，耗時較少，提高了檢測效率。

該試驗建立了條紋炭角菌的HPLC指紋圖譜，該方法簡便易行，所檢測到的化學成分均得到較好的分離。指紋圖譜相似度和聚類分析均說明不同培養條件下條紋炭角菌的成分與野生條紋炭角菌的成分差異較大，其中棉籽殼和麩皮共培養的條紋炭角菌與野生條紋炭角菌成分最為相似，可用于后續該菌化學成分研究的材料，為今后有效成分提取純化的材料選擇提供依據。

野生食藥用真菌自然生長條件下產量很低，無法滿足食品藥品的后續開發使用。人工培養是解決產量的最佳方法，但不同培養方式因其培養基、培養方式的不同，培養物的化學成分和野生種類差異可能很大。該試驗通過指紋圖譜優選的方式，可以更好地優選接近野生品種的培養方式，為一種野生食藥用真菌開發的優良方法。

參考文獻

[1] 賀新生.四川盆地蕈菌圖志[M].北京:科學出版社,2011:52-57.

[2] 吳根福.黑柄炭角菌產生的DPPH自由基捕捉成分[J].微生物學報,2001,41(3):363-366.

[3] 龔慶芳,武守華,譚寧華,等.黑柄炭角菌發酵菌絲中抗氧化及抗腫瘤活性的有效成分研究[J].食品科技,2008,33(12):28-31.

[4] 龔慶芳,張玉梅,譚寧華,等.黑柄炭角菌發酵菌絲體的化學成分研究[J].中國中藥雜志,2008,33(11):1269-1272.

[5] 麻兵繼,阮元,劉吉開,等.長柄炭角菌子實體化學成分研究[J].天然產物研究與開發,2008,20(1):63-65.

[6] 楊小龍,劉吉開,羅都強,等.黑柄炭角菌的化學成分[J].天然產物研究與開發,2011,23(5):846-849.

[7] 王興娜,黃午陽,劉吉開,等.大炭角菌子實體化學成分的研究[J].中草藥,2012,43(12):2327-2332.

[8] 馬橙,翁榕安,張平,等.黑柄炭角菌的研究進展[J].菌物研究,2009,7(1):59-62.

[9] 馬貝貝,霍存錄,賀新生,等.縱條紋炭角菌子實體培養[J].食品與發酵科技,2013,49(2):44-47.

[10] 馮望,吳穎,尤雅,等.縱條紋炭角菌培養條件的優化[J].廣東農業科學,2014(10):90-94.

[11] 劉霞,高聰,鐘雨婷,等.縱條紋炭角菌菌絲體液體培養條件的優化[J].中藥材,2014,37(8):1317-1321.

[12] 袁小紅,張春杰,劉霞,等.6種高等真菌醇提物對植物病原菌的抗菌活性研究[J].安徽農業科學,2013,41(12) :5289-5290,5294.

[13] 袁小紅,張春杰,鄭仁林,等.六種高等真菌醇提物的抗腫瘤活性篩選[J].西南科技大學學報,2013,28(3):95-97.

Analysis of HPLC Fingerprint ofXylariastriataby Different Culture Methods

HUANG Yi1,2,YUAN Xiao-hong2,HE Xin-sheng2,SONG Hang1*

(1.Department of Pharmaceutical and Biological Engineering,Sichuan University,Chengdu,Sichuan 610065; 2.College of Life Science and Engineering,Southwest University of Science and Technology,Mianyang,Sichuan 621010)

Abstract[Objective] To establish Xylaria striata fingerprint analysis method by High Performance Liquid Chromatography (HPLC),and to compare the differences in chemical components of five cultures.[Method] Chromatographic column was Agilent Eclipse XDB C18(150.0 mm × 4.6 mm,5.0 μm); mobile phase was acetonitrile-water; detection wavelength was 210 nm; flow rate was 0.8 mL/min; and column temperature was 25 °C.After detecting the fingerprint,the chemical composition was compared by similarity analysis and cluster analysis.[Result] The HPLC fingerprint analysis method of X.striata was established.In chromatographic fingerprint,35 common peaks were identified.According to the results of similarity analysis and cluster analysis,the chemical compositions of X.striata cultured in cottonseed hulls and bran were most similar as the wild.[Conclusion] The method is simple,stable and repeatable,which can be used for quality control and method screening of X.striata cultures.

Key wordsXylaria striata; Fingerprint; HPLC; Similarity analysis; Cluster analysis

基金項目國家自然科學基金項目(21272189)。

作者簡介黃毅(1979- )，男，四川成都人，講師，博士，從事真菌天然產物開發研究。*通訊作者，教授，博士生導師，從事天然產物資源綜合開發研究。

收稿日期2016-01-26

中圖分類號S 603.6

文獻標識碼A

文章編號0517-6611(2016)08-134-04