熒光定量PCR檢測豬鏈球菌2型主要毒力因子方法的建立

凌淑萍， 趙 健， 陳 國， 葉宇飛， 許秀琴， 呂 燕， 吳銀良

(寧波市農業科學研究院，浙江寧波 315000)

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熒光定量PCR檢測豬鏈球菌2型主要毒力因子方法的建立

凌淑萍， 趙 健， 陳 國， 葉宇飛， 許秀琴， 呂 燕， 吳銀良

(寧波市農業科學研究院，浙江寧波 315000)

摘要[目的]建立熒光定量PCR檢測豬鏈球菌2 型(Streptococcus suis serotype 2,SS2)、溶菌酶釋放蛋白(Muramidase-released protein,MRP) 和胞外因子(Extracellular protein factor，EF)3種主要毒力因子的方法。[方法]根據cps2j、mrp和ef基因的基因序列，分別設計并合成3對引物及相應的Taqman探針,其中cps2j和mrp的5′端標記FAM熒光發射基團，ef的5′端標記HEX熒光發射基團，3種基因的3′端都標記BHQ1淬滅熒光基團。通過優化反應體系和程序，建立了一種基于Taqman探針法的熒光定量PCR方法檢測上述3種主要毒力因子，其中cps2j單獨檢測，mrp與ef的實行雙重熒光PCR 方法檢測。[結果]cps2j、mrp和ef的最低檢測限分別為12、51和51 CFU，靈敏度很高；與其他病原菌無交叉反應，重復性及特異性均較好；此外，整個檢測過程在60 min內即可完成。[結論]該試驗所建立的雙重熒光定量PCR方法的敏感性、重復性及特異性均較好，可用于同時快速檢測豬鏈球菌2型3種主要毒力因子。

關鍵詞豬鏈球菌2型；熒光定量PCR；毒力因子

豬鏈球菌是一種重要的人畜共患病原菌，豬鏈球菌分為33個血清型，其中以豬鏈球菌2型(Streptococcussuistype 2，SS2)致病力最強，也是全世界范圍內引起人類疾病最常見的致病血清型[1-2]。SS2可引發豬腦膜炎、關節炎、心內膜炎、敗血癥和肺炎等，各年齡段豬均可感染豬鏈球菌病。SS2不僅是影響各國養豬業發展的重要疫病之一，同時該病還可感染養豬相關從業人員，引起細菌性敗血癥、休克、腦膜炎、永久性聽力喪失，甚至死亡，給養豬業及公共衛生構成嚴重威脅[3]。

SS2在很多國家均受到廣泛重視，對其研究主要集中在毒力相關因子(Virulence correlated facters， VAFs)的研究上。研究表明，VAFs與豬鏈球菌引起的病癥密切相關[4]。其中，莢膜多糖(CPS)是目前已確定的豬鏈球菌2型主要的細菌毒力相關因子，具有抗吞噬的作用[5-6]，因其具有很高的種特異性，csp2j常被作為檢測豬鏈球菌2型的靶基因[7]。此外，溶菌酶相關蛋白(MRP)和細胞外蛋白因子(EPF)也是主要毒力相關因子，人工感染小鼠和豬的試驗表明MRP+EF+菌株可致豬產生典型腦膜炎、多發性關節炎和多發性漿液炎等疾病，MRP+EF-菌株僅引起的疾病則較為溫和，而MRP-EF-菌株則無致病性[8]。另外，mrp與ef基因串聯表達蛋白具有重要的免疫保護作用[9]。目前,對豬鏈球菌2型的檢測包括細菌培養、生化試驗、乳膠凝集試驗和qPCR等分子生物學檢測方法，與傳統的方法相比qPCR方法能夠快速、準確檢測豬鏈球菌2型，被廣泛應用于豬鏈球菌病的檢測與診斷方面[10]。筆者針對豬鏈球菌2型3個主要的毒力相關因子(cps2j、mrp、ef)分別設計引物與Taqman探針，cps2j單獨實行熒光定量法，用以檢測豬鏈球菌2型是否存在，而mrp和ef實行雙重熒光定量PCR方法，檢測豬鏈球菌2型的毒力情況，以期為豬鏈球菌的疾病防控與公共衛生提供指導。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株。豬鏈球菌2型ATCC43765，購自中國獸醫微生物菌種保藏管理中心；金黃色葡萄球菌ATCC6538、單增李斯特菌ATCC29212、沙門氏菌ATCC14028、大腸埃希氏菌ATCC25922、乙型溶血性鏈球菌ATCC21059，均購自廣東環凱微生物科技有限公司。

1.1.2主要試劑和儀器。腦心浸液肉湯和瓊脂粉，均購自青島海博生物技術有限公司；Ezup柱式細菌基因組DNA提取試劑盒提取基因組DNA(上海生工股份有限公司)；Premix ExTaqTM試劑盒(TaKaRa)；steponeplusTM定量PCR儀(ABI)；溶菌酶(BIOSHARP)；蛋白酶K(上海生工股份有限公司)。

1.2引物和TaqMan 探針根據GenBank 公布的豬鏈球菌2 型csp2j基因序列鑒定菌種參考基因序列(登錄號JX986792.1)，其他2個毒力因子基因mrp(登錄號 X64450.1)、ef(登錄號JF813371.1)，探針的5’端分別標記FAM、FAM、HEX；3’端標記BHQ1。使用Beacon Designer 7設計引物和探針，均由Life公司合成。引物和探針序列如表1所示。

表1　引物和探針序列

1.3細菌計數豬鏈球菌2型標準菌株接種于腦心浸液肉湯，37 ℃下培養24 h。取1 mL培養液置于9 mL生理鹽水中，搖勻，依次進行10倍梯度稀釋，取適當稀釋度的菌液1 mL置于培養皿中，加入含1.5%瓊脂的腦心浸液肉湯，混合均勻，每個稀釋度的細菌做2個平行，37 ℃下培養24 h ，取合適細菌生長數的培養皿，計算每毫升菌落形成單位(Colony forming units,CFU)。

1.4熒光定量PCR

1.4.1豬鏈球菌2型基因組DNA的提取。取2 mL細菌增菌培養液，10 000×g 離心1 min，棄上清，使用細菌基因組DNA提取試劑盒提取基因組DNA，具體方法參照使用說明書。

1.4.2熒光定量PCR 擴增。PCR 擴增反應在Stepone Plus(ABI)上進行，單熒光反應體系(20 μL)：Premix ExTaqTM10 μL、10 μmol/L引物各0.4 μL、probe 0.8 μL、ROX Reference Dye(50×)0.4 μL、DNA模板2 μL、超純水6.0 μL；雙重熒光反應體系(20 μL)：Premix ExTaqTM10 μL、10 μmol/L引物1、引物2各0.4 μl，probe 1、probe 2各0.8 μL，ROX Reference Dye(50×)0.4 μL，DNA模板2 μL，超純水4.4 μL。反應條件：95 ℃ 20 s；95 ℃ 1 s，60 ℃ 20 s，40個循環，在每個循環的60 ℃時收集熒光信號。

1.4.3特異性試驗。運用實驗室保存的金黃色葡萄球菌、單增李斯特菌、沙門氏菌、大腸埃希氏菌、乙型溶血性鏈球菌作為特異性試驗的對照組進行試驗。

1.4.4標準曲線的繪制與靈敏度檢測。取1 mL 37 ℃過夜培養的菌液，用生理鹽水進行10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7稀釋；取適量稀釋液做細胞計數試驗，使用試劑盒法提取細菌基因組，提取基因組通過熒光PCR進行檢測。

2結果與分析

圖1　S.suis 2 cps2j、mrp、ef實時熒光定量PCR的動力學擴增曲線Fig.1　The dynamic curve of the triple real-time qPCR for cps2j,mrp,ef in S.suis serotype 2

圖2　純培養豬鏈球菌2型DNA的實時PCR 標準曲線Fig.2　Real-time PCR standard curve of S.suis serotype 2 DNA

2.1標準曲線取10-2、10-3、10-4、10-5、10-6稀釋度的豬鏈球菌2 型基因組DNA 進行定量擴增。擴增曲線如圖1所示。取10-5、10-6稀釋度的豬鏈球菌2 型菌進行進行細胞計數，結果表明10-5稀釋度細菌數多不可計，10-6稀釋度的細菌拷貝數為120 CFU。以起模板數的對數為X軸，以Ct值為Y軸，繪制標準曲線。根據標準曲線，得到cps2j、mrp、ef3種基因的標準曲線方程：y=-3.185 9x+39.901(R=0.999 2)、y=-3.165x+ 41.533(R= 0.997 5)、y=-3.275 7x+40.689(R2= 0.997 2)(圖2)。

2.2靈敏度檢測根據陽性對照細菌數計算拷貝數，檢測倍比稀釋的陽性對照，結果發現此體系中cps2j最低可檢測細菌拷貝數為12 CFU，而mrp和ef最低可檢測細菌拷貝數均為51 CFU(圖3)。

2.3特異性試驗運用保存的金黃色葡萄球菌、單增李斯特菌、沙門氏菌、大腸埃希氏菌、乙型溶血性鏈球菌作為特異性試驗的對照組進行試驗。 結果表明，該方法能夠特異地檢測出豬鏈球菌2型，而其他對照組的檢測結果均為陰性，說明該體系具有良好的特異性。

3討論與結論

豬鏈球菌是一種危害嚴重的條件性致病菌，亞臨床的病原攜帶者是豬鏈球菌的主要傳染源。該病原對我國食品安全、畜牧業生產安全以及相關從業人員具有巨大威脅。1998年和2005年已經分別在我國江蘇省和四川省引起了豬鏈球菌2型2次大規模的爆發，并伴隨著豬群大規模的鏈球菌中毒性休克綜合癥和異常升高的死亡率[11-13]，引起了公眾對豬鏈球菌2型的極大關注。加強對豬鏈球菌尤其是對豬鏈球菌2型的檢測力度，對于預防和控制豬鏈球菌病具有重要的意義[14]。目前，PCR技術在病原菌的檢測與診斷方面已被廣泛應用。

圖3　豬鏈球菌2型最低檢出限DNA的實時PCR 標準曲線Fig.3　Real-time PCR standard curve of detection limit of S.suis serotype 2 DNA

該試驗采用的qPCR技術是PCR技術中的一種，它不僅有常規PCR技術的擴增高效率的特點，還具有探針的高度特異性、光譜技術的高敏感性和精確性等特點，被廣泛運用于醫療、藥物研究、病原菌的檢測等體外擴增技術[15]。此外，整個反應過程是由儀器自動控制并進行結果分析，避免了后續電泳等步驟，減少污染。豬鏈球菌菌株根據毒力因子的差異，可分為強毒力株(MRP+EF+)、弱毒力株(MRP+EF-)和無毒力株(MRP-EF-)[16]。該試驗參照GenBank中豬鏈球菌2型3種毒力因子cps2j、mrp和ef基因序列，選擇其高度保守區，利用Beacon Designer 7軟件分別設計3對特異性的引物及相應的Taqman探針。cps2j基因采用單重熒光PCR技術，用于檢測SS2是否存在。另外，通過優化反應體系和程序，建立一種基于Taqman探針法的雙重熒光定量PCR方法檢測mrp和ef2個毒力因子基因。優化反應體系后mrp和ef基因的擴增效率基本與單重qPCR相一致，而且2種熒光信號的收集不存在互相干擾，可建立良好動力學擴增曲線及標準曲線。該試驗結果表明試驗所建立的實時熒光定量PCR方法的敏感性、重復性及特異性均較好，而且操作方便，簡單快速，可為豬鏈球菌2型菌株的分離和毒力鑒定提供參考。

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Establishment of the Real-time qPCR method for Detection of Main Virulence Factors ofStreptococcussuisSerotype 2

LING Shu-ping,ZHAO Jian,CHEN Guo et al

(Ningbo Academy of Agricultural Sciences,Ningbo,Zhejiang 315000)

Abstract[Objective] Taq Man real-time qPCR was established for detection of Streptococcus suis serotype 2(SS2),muramidase-released protein(MRP) and extracellular protein factor(EF).[Method] The double Taq Man real-time PCR assay was developed to simultaneously detect virulence genes cps2j,mrp and ef of S.suis serotype 2.Three pairs of specific primers and fluorogenic-labeled probes were designed and synthesized in accordance with the above target genes.The 5′-ends of probes for cps2j and mrp were labeled with FAM,while the 5′-ends of ef were individually labeled with HEX,and their 3′-ends were all labeled with quencher BHQ1.The reaction system and procedures were optimized.[Result] The detection limits for purified recombinant plasmids of cps2j,mrp and ef were 12,51 and 51 CFU,respectively.There was no cross reaction between S.suis serotype 2 and other pathogens.The entire detection could be completed within 60 min.[Conclusion] The double Taq Man real-time PCR assay developed in this study is fast,sensitive,repeatable and specific,which can be used for rapid detection of three kinds of virulence factors of S.suis serotype 2.

Key wordsStreptococcus suis serotype 2; Real-time qPCR; Virulence factors

基金項目寧波市農科教結合項目(2015NK24)。

作者簡介凌淑萍(1987- )，女，浙江寧波人，碩士研究生，研究方向：微生物檢測。

收稿日期2016-02-24

中圖分類號S 852.6

文獻標識碼A

文章編號0517-6611(2016)08-138-03