降脂酮對胰島素抵抗大鼠肝損傷的保護作用

王　帥， 金　磊， 王　欣， 姬秋和， 張　偉， 海春旭， 李文麗

(第四軍醫大學毒理學教研室，西安　710032；*通訊作者，E-mail：liwenli@fmmu.edu.cn)

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降脂酮對胰島素抵抗大鼠肝損傷的保護作用

王帥， 金磊， 王欣， 姬秋和， 張偉， 海春旭， 李文麗*

(第四軍醫大學毒理學教研室，西安710032；*通訊作者，E-mail：liwenli@fmmu.edu.cn)

摘要：目的觀察降脂酮對胰島素抵抗大鼠肝病理損傷的保護作用。方法將15只大鼠隨機分成2組，即正常對照組5只、雙高加tBHP(HF+tBHP)組10只。正常對照組，正常飼料喂養，5-6周隔天腹腔注射生理鹽水。HF+tBHP組，高脂高果糖飼料喂養，5-6周隔天腹腔注射tBHP。第6周末，將HF+tBHP組隨機分成兩組:模型組5只，降脂酮組5只。模型組，雙高飲食+tBHP，生理鹽水灌胃；降脂酮組，雙高飲食+tBHP，降脂酮200 mg/kg灌胃。6周末，測定空腹血糖、血清胰島素含量、胰島素敏感指數。12周末，處死大鼠，腹主動脈取血，分離血清，測定大鼠ALT和AST。取肝臟作HE染色石蠟切片和制作電鏡切片。結果與對照組比較，模型組空腹血糖升高(P<0.05)，血清胰島素含量降低(P<0.05)，胰島素敏感指數降低(P<0.05)。降脂酮治療后，光鏡下觀察肝細胞排列整齊，腫脹減輕；電鏡下觀察肝臟線粒體腫脹減輕，內質網擴張不明顯。大鼠血清中ALT和AST的活性顯著降低(P<0.05)。結論降脂酮能夠保護高脂高果糖飲食加腹腔注射tBHP誘導的胰島素抵抗大鼠的肝損傷。

關鍵詞：降脂酮；胰島素抵抗；叔丁基過氧化氫；肝損傷

2型糖尿病目前是全世界重大的公共衛生難題，日趨受到人們的重視。胰島素抵抗是肥胖和2型糖尿病等各種代謝綜合征的根本致病因子。研究表明，脂毒性和氧化應激與2型糖尿病的發生密切相關。胰島素抵抗是2型糖尿病等各種代謝綜合征的根本致病因素。中藥作為我們國家的一個瑰寶日益受到廣大民眾的認可和歡迎。黃酮類化合物能清除機體內的自由基，被認為是一種較強的抗氧化劑[1]。近年來黃酮的保肝作用也引起了廣泛的關注。降脂酮是從多種中藥中提取的總黃酮，目前已有研究顯示，降脂酮能改善CCl4誘導的急慢性肝損傷，起到顯著的保肝作用[2]。本實驗采用高脂高果糖加tBHP誘導的大鼠胰島素抵抗模型為基礎，研究中藥提取物降脂酮對大鼠胰島素抵抗肝損傷的作用，為篩選出高效低毒的治療2型糖尿病的中藥奠定實驗基礎。

1材料與方法

1.1實驗動物及飼料配置

8周齡SPF級Sprague Dawley雄性大鼠，由第四軍醫大學實驗動物中心提供。動物飼料由第四軍醫大學實驗動物中心提供，大鼠自由攝食、飲水。動物實驗環境溫度為(24±2)℃，相對濕度為50%±10%，12 h/12 h交替照明和避光。第四軍醫大學飼料中心提供配置，配方為：普通混合飼料85%，豬油10%，果糖5%，60Co照射。

1.2主要試劑與儀器

羅氏卓越血糖儀，購自羅氏診斷產品(上海)有限公司；日立7020生化儀，購自日立公司；大鼠胰島素(INS)酶聯免疫試劑盒，購自武漢華美生物工程有限公司；降脂酮為中國科學院化學所自由基研究室提供(黃酮含量>80%)；tBHP購自美國Sigma公司，果糖購自天津富宇精細化工有限公司。

1.3動物的處理與分組

將15只大鼠隨機分成3組，即正常對照組(Control)5只、雙高加tBHP(HF+tBHP)組5只。

正常對照組，正常飼料喂養，5-6周隔天腹腔注射生理鹽水。HF+tBHP組，高脂高果糖飼料喂養，5-6周隔天腹腔注射tBHP 0.2 mmol/kg、0.5 ml/kg。第6周末，將HF+tBHP組隨機分成兩組：模型組5只，降脂酮組5只。正常組7-12周正常飼料喂養，每天生理鹽水灌胃，隔天腹腔注射生理鹽水；模型組7-12周雙高飲食，每天生理鹽水灌胃，隔天腹腔注射tBHP；降脂酮組7-12周雙高飲食，每天降脂酮200 mg/kg灌胃，隔天腹腔注射tBHP。

1.4血清胰島素含量測定和胰島素敏感指數(ISI)計算

6周末，大鼠眼底靜脈叢取血，分離血清。用大鼠胰島素(INS)酶聯免疫試劑盒測定SD大鼠空腹血清胰島素的含量。利用公式ISI=ln[1/(血糖×血清胰島素)]計算胰島素敏感指數(ISI)。

1.5大鼠肝臟HE染色切片和大鼠肝臟電鏡切片

12周末，大鼠腹腔注射苯巴比妥麻醉，開腹活體取小部分肝臟，置于4%甲醛中浸泡，制作石蠟切片，進行HE染色。光鏡下觀察各組大鼠肝臟病理變化。另取小部分肝臟置于2%戊二醛中浸泡，送電鏡室做肝臟電鏡切片，透射電鏡下觀察各組大鼠肝臟的超微病理變化。

1.6大鼠血清ALT和AST

12周末，大鼠開腹，腹主動脈取血，3 500 r/min離心10 min，取上清液即為大鼠血清。用生化儀測定大鼠血清中谷丙轉氨酶(ALT)、谷草轉氨酶(AST)的活性。

1.7統計學分析

數據以均數±標準差表示，應用SPSS17.0統計軟件進行統計學分析，組間比較采用單因素方差分析。α=0.05為檢驗水準。

2結果

2.1大鼠胰島素抵抗模型的建立

HF+tBHP組與對照組比較，空腹血糖顯著升高(P<0.05)，體內胰島素敏感性降低(P<0.05)，代償性的胰島素分泌量增加(P<0.05，見表1)。

組別空腹血糖(mmol/L)空腹血清胰島素(FINSmmol/L)胰島素敏感指數(ISI)對照組5.02±0.3937.4±3.28-5.23±0.08 HF+tBHP組5.74±0.39*64.4±3.91**-5.90±0.04**

與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01

2.2降脂酮對IR大鼠肝臟病理損傷的保護作用

在光鏡下觀察肝臟HE染色的病理學結構，對照組肝小葉規則，肝索以中央靜脈為中心排列整齊，核仁無偏移，未見炎癥細胞浸潤。HF+tBHP組肝竇變窄,肝索排列紊亂，肝細胞腫脹，體積增大，有的細胞呈氣球樣變，可見炎癥細胞浸潤，提示肝臟存在炎癥改變。降脂酮治療后肝細胞結構基本正常，細胞核位于細胞中央，肝索排列較HF+tBHP組明顯整齊，炎癥細胞浸潤明顯減少(見圖1)。

在透射電鏡下放大倍數為20 500時可見，對照組肝細胞核周隙正常，線粒體形狀規則，未見腫脹的線粒體和內質網；模型組線粒體腫脹變形，有的甚至呈球形，內質網擴張，排列紊亂；降脂酮治療后，線粒體腫脹減輕，偶可見線粒體嵴，內質網擴張不明顯(見圖2)。

圖1　肝臟光鏡下病理學改變 (HE染色，×200)Figure 1　Change of pathology of livers under light microscope (HE staining，×200)

圖2　肝臟超微病理結構改變(電鏡，×20 500)Figure 2　Ultrastructural changes of livers under electron microscope (×20 500)

2.3降脂酮對胰島素抵抗大鼠肝功能的影響

HF+tBHP組大鼠血清ALT、AST活性較對照組顯著升高(P<0.05)。用降脂酮治療后，大鼠ALT、AST活性顯著降低(P<0.05，見圖3)。

與對照組比較，*P<0.05;與HF+tBHP組相比，#P<0.05圖3　降脂酮治療后血清谷丙轉酶(ALT)和谷草轉氨酶(AST)的活性Figure 3　The changes of serum ALT and AST after treated with Jiangzhitong

3討論

果糖作為食品添加劑，廣泛用于食品、飲品中。果糖攝入的增加認為是一個潛在的肥胖流行因素。有研究表明，單純飲用果糖水10周可使大鼠體重顯著增加，并造成胰島素抵抗[3]；高脂高糖、20%果糖水飼喂8周，并注射小劑量的鏈脲佐菌素(STZ)2周也可以誘導胰島素抵抗大鼠模型[4]。由此可見，果糖與IR的產生密切相關。已知，ROS介導的炎癥和氧化應激，與代謝綜合征和T2DM的發病密切相關。ROS水平升高導致胰島素信號的改變，但單純ROS水平升高和氧化應激對誘導IR的研究至今甚少。近年有研究顯示在高脂飲食喂養大鼠時加入氧化劑NOX2，對IR模型的建立起到了重要的作用。NOX2促進高脂飲食誘導的IR的發生，清除NOX2可提高肌肉組織胰島素的敏感性，下調NOX2在骨骼細胞中的表達可提高胰島素信號的敏感性[5]。因此，本實驗綜合以上研究結果，給予大鼠高脂高果糖飲食加腹腔注射氧化劑tBHP。結果表明，大鼠體重明顯增加，空腹血糖顯著升高，機體胰島素敏感性降低，代償性的胰島素分泌量增加。以上結果均提示成功建立了胰島素抵抗大鼠模型。

2型糖尿病患者50%并發肝損傷，而胰島素抵抗是導致肝損傷的關鍵因素[6]。我們的研究結果表明，胰島素抵抗大鼠的肝臟脂滴增多，線粒體腫脹，內質網擴張。究其原因可能是：在胰島素抵抗狀態下，脂肪代謝的調節作用減弱，血中游離脂肪酸含量升高，大量游離脂肪酸進入肝臟，超過肝細胞的承受能力，導致肝細胞中脂質的大量堆積。同時胰島素抵抗下，產生大量的自由基，損傷線粒體，從而影響游離脂肪酸的代謝，加重肝細胞脂質蓄積[7]。另外，tBHP是一種氧化劑，本實驗室前期的體外實驗結果表明，它可以直接導致正常人肝細胞系發生線粒體腫脹，肝細胞凋亡[8]。本實驗給予大鼠腹腔注射tBHP，它也可能直接參與了肝臟的損傷作用。因此，尋找改善IR大鼠肝損傷的藥物顯得尤為重要。

近年研究表明，黃酮類化合物能顯著地預防和治療胰島素抵抗，并且具有顯著的保肝作用。降脂酮是一種從黃芪、枸杞子、山楂等6種中藥中提取的總黃酮，推測可能與黃酮具有類似的保肝作用[9]。國內研究[2,10]發現，降脂酮能降低CCl4誘導的急性肝損傷中NO和NOS的水平，還能顯著降低AST和ALT活性，從而起到保護肝細胞的作用。但降脂酮對胰島素抵抗大鼠的肝損傷作用還未見文獻報道。本實驗光鏡觀察顯示，模型組大鼠肝細胞腫脹，肝索排列紊亂。降脂酮治療后，大鼠肝細胞腫脹消失，肝索排列較整齊，肝臟脂滴顯著減少；電鏡觀察結果顯示，模型組大鼠肝細胞線粒體腫脹變形，內質網擴張。降脂酮治療后大鼠肝細胞線粒體腫脹減輕，偶可見線粒體嵴，內質網擴張不明顯。本實驗通過對大鼠血清ALT、AST活性的測定顯示：高脂高果糖加tBHP使大鼠血清中ALT、AST的活性顯著升高，提示肝臟損傷的出現。可能與胰島素抵抗導致的脂代謝紊亂和氧化應激相關。降脂酮治療后，大鼠血清中ALT、AST的活性顯著降低。推測可能是降脂酮參與肝臟中脂質的運輸和氧化應激水平的降低。以上結果推測，多種中藥提取物降脂酮可保護高脂高果糖和tBHP誘導的胰島素抵抗大鼠的肝損傷。

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Protective effect of Jiangzhitong on liver injury in rats with insulin resistance

WANG Shuai， JIN Lei， WANG Xin， JI Qiuhe， ZHANG Wei， HAI Chunxu， LI Wenli*

(ToxicologyTeachingandResearchSection，FourthMilitaryMedicalUniversity，Xi’an710032，China；*Correspondingauthor，E-mail：liwenli@fmmu.edu.cn)

Abstract：ObjectiveTo explore the role of Jiangzhitong in the pathological damage of the liver in rats with insulin resistance.MethodsFifteen rats were randomly divided into two groups: control group(n=5) and high fat and high glucose plus tBHP group (HF+tBHP,n=10). Control rats were fed with normal diet and injected with saline every other day from the fifth to the sixth week. HF+tBHP rats were given high-fat, high-fructose diet, and they were injected intraperitoneally with tBHP from the fifth to the sixth week. At the end of the sixth week, the HF+tBHP rats were randomly divided into two groups: model group(n=5) and Jiangzhitong group(n=5). The rats in model group were given high-fat, high-fructose diet and injected with tBHP from the seventh to the twelfth week, and the rats in Jiangzhitong group were given high-fat, high-fructose diet, Jiangzhitong 200 mg/kg orally and injected with tBHP. At the end of the sixth week, fasting blood glucose, serum fasting insulin levels, insulin sensitivity index were measured. At the end of the twelfth week, the rats were sacrificed and the livers were prepared for HE staining, oil red staining and electron microscopy slice. ResultsCompared with control group, the fasting blood glucose increased(P<0.05), the serum insulin level decreased(P<0.05), and the insulin sensitivity index decreased in model group(P<0.05). After treated with Jiangzhitong, liver cells were arranged neatly, and the swelling of liver cells was relieved. The results of electron microscope showed that the swelling of the mitochondrial was relieved in liver cells in Jiangzhitong group, and the endoplasmic reticulum wasn’t obvious. The ALT and AST in serum of rats were decreased in Jiangzhitong group(P<0.05). ConclusionJiangzhitong can alleviate the liver injury in insulin resistance rats induced by high fructose, high fat and tBHP.

Key words:Jiangzhitong;insulin resistance;tBHP;liver injury

基金項目：國家科學自然基金資助項目(31170807)；陜西省自然科學基金青年人才基金資助項目(2013JQ4018)

作者簡介：王帥，女,1989-08生，在讀碩士，E-mail：992751204@qq.com

收稿日期：2016-02-29

中圖分類號：R587

文獻標志碼：B

文章編號：1007-6611(2016)05-0411-04

DOI：10.13753/j.issn.1007-6611.2016.05.003