兩種培養基對羊駝毛囊干細胞生長和增殖的影響

弓慧敏， 白　瑞， 賈宗菲， 董常生， 龐全海*

(1山西醫科大學晉祠學院基礎醫學部形態學教研室，太原　030025； 2山西農業大學動物科技學院； *通訊作者，E-mail：pangquanhai@126.com)

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兩種培養基對羊駝毛囊干細胞生長和增殖的影響

弓慧敏1， 白瑞2， 賈宗菲2， 董常生2， 龐全海2*

(1山西醫科大學晉祠學院基礎醫學部形態學教研室，太原030025；2山西農業大學動物科技學院；*通訊作者，E-mail：pangquanhai@126.com)

摘要：目的比較K-SFM和DMEM/F12兩種培養基對羊駝毛囊干細胞生長和增殖的影響。方法取2-3歲羊駝背部皮膚，采用聯合酶消化法分離毛囊干細胞，用無血清角質化培養基(K-SFM)和自配無血清培養基(DMEM/F12)培養羊駝毛囊干細胞，比較羊駝毛囊干細胞的生長狀況，用CK19、integrin-β1特異性標志物免疫細胞化學鑒定細胞。結果免疫細胞化學證實所培養的細胞為羊駝毛囊干細胞。兩種培養基均能培養一定量的羊駝毛囊干細胞，培養基K-SFM有利于羊駝毛囊干細胞的增殖，細胞生長數量多，細胞克隆形成能力強，增殖速度快；DMEM/F12培養基細胞數量少，細胞活力不強，傳代次數少，增殖速度慢。結論成功分離并鑒定了羊駝毛囊干細胞，建立了適于羊駝毛囊干細胞體外擴增的培養基，K-SFM培養基較自配培養基DMEM/F12更適合羊駝毛囊干細胞的體外培養。

關鍵詞：羊駝；毛囊干細胞；細胞培養；免疫細胞化學

羊駝(Lama pacos)屬于哺乳綱、偶蹄目、駱駝科、美洲駝屬，其毛具有重要經濟價值。羊駝毛有22種自然色澤，羊駝毛織成的衣服輕盈、柔軟，是半細毛類中特別優良的毛纖維，被視為紡織品中的“軟黃金”。

目前，有關毛囊干細胞(hair follicle stem cells，FSC)的分離培養，在多數實驗室中以鼠的觸須毛囊[1-3]、外科獲取的人頭皮樣本[4]為毛囊干細胞的組織來源。樣本經中性蛋白酶DispaseⅡ酶處理，分離去除表皮，或者用胰酶/EDTA處理的毛囊組織，獲得單細胞懸液培養毛囊干細胞。毛囊干細胞在體外可誘導分化為神經元，神經膠質細胞，角化細胞，平滑肌細胞和黑色素細胞等[5,6]，而在體內(移植后)可分化為神經元、黑色素細胞等。另外，毛囊干細胞還能分化成毛囊、皮脂腺、表皮[7]等，毛囊周期生長是由毛囊干細胞和間質細胞的共同作用完成。因此，毛囊干細胞對毛發的再生以及毛色的影響起著重要的作用[8,9]。由于羊駝皮膚組織更新速度快、再生能力強，來源充足、取材方便、創傷小，其對自體細胞構建的組織不存在排斥反應，可在體外大量培養擴增，因此，來自皮膚局部的干細胞受到了重視。

由于羊駝皮膚毛囊相對大鼠毛囊要細小，單根毛發顯微切割過程持續時間長，容易污染，而且工作強度大。DispaseⅡ酶屬于中性蛋白酶，常用來分離皮膚的表皮和真皮進行細胞培養[10,11]，是分離組織和細胞的一種性質穩定的消化酶，它不損傷細胞膜[12-14]。本實驗初步探討了羊駝毛囊干細胞的分離培養，為羊駝毛發及毛色的研究以及干細胞分化成其他功能細胞的研究建立了一個技術平臺。

1材料和方法

1.1動物

2-3歲雌性羊駝，山西農業大學羊駝養殖基地(原種引自澳大利亞)。

1.2主要試劑及其配制

牛血清白蛋白(BSA)、胰島素樣生長因子(IGF-1)均購自美國Sigma公司。DispaseⅡ酶購自美國Gibco公司。胰蛋白酶購自美國Sigma公司。EDTA購自美國Invitrogen公司。DMEM培養基購自杭州四季青生物工程有限公司。CK19和β1-整合素購自武漢博士德生物工程有限公司。

K-SFM無血清培養基：1 000 ml K-SFM+5 μl/ml BPE+0.1 μl/ml EGF+0.5 μg/ml氫化可得松+5 μl/ml胰島素，均購自美國Gibco公司。

DMEM/F12自配培養基：1 000 ml DMEM/F12+2%BSA+100 ng/ml EGF+0.5 μg/ml氫化可得松+5 μl/ml胰島素+10 ng/ml IGF-1。

1.3毛囊干細胞的分離培養

取羊駝背部直徑約0.8 cm的皮膚樣本，置DMEM培養基中，4 ℃保存備用。將皮膚樣本置于75%乙醇中消毒3 min，無菌操作移入PBS中，用眼科鑷和眼科剪及手術刀片刮去皮膚表面臟物，去除真皮脂肪組織；將樣本切成約0.2 cm×0.3 cm的條塊，用含雙抗(青霉素100 U/ml和鏈霉素100 U/ml)的PBS沖洗4次，將其浸泡在0.2%DispaseⅡ酶中，37 ℃消化2 h。取出組織置于PBS中用眼科鑷分離毛囊，PBS中漂洗毛囊后，置于0.25%胰蛋白酶∶0.02% EDTA(1∶1)中37 ℃消化2 min，終止液終止消化，用彎頭滴管吹打，200目濾網過濾，將濾過物1 000 r/min離心10 min，移入24孔培養板上，置于37 ℃，飽和溫度，5% CO2培養箱中培養。對第1,3,5代細胞進行形態學觀察比較。

1.4細胞生長曲線測定

分別取K-SFM和DMEM/F12兩種培養基培養的生長良好的第3代羊駝毛囊干細胞以1×104個/孔的細胞密度接種于96孔板，每孔0.2 ml，分為2組，分別采用兩種培養基培養。每日觀察細胞的生長狀況并拍照，同時每天每組取3孔細胞進行計數，計算平均值，連續計數7 d，繪制細胞生長曲線，分析不同培養基對羊駝毛囊干細胞生長和增殖的影響。

1.5細胞克隆形成率測定

參照文獻[15-17]的方法，分別取K-SFM和DMEM/F12兩種培養基培養的第3代細胞稀釋成克隆密度(1細胞/μl溶液)，每孔100個細胞接種于6孔培養板上，分別培養7-9 d，固定后用姬姆薩法染色，在解剖鏡下計克隆數，按式計算，克隆形成率=克隆細胞數/接種細胞數×100%[15-17]。

1.6免疫細胞化學檢測毛囊干細胞表面標志CK和integrin-β1

選用兩種培養基培養的生長良好的第3代細胞，用0.25%胰酶∶0.02%EDTA(1∶1)37 ℃消化3 min，制成單細胞懸液，調整細胞密度，接種于12孔板上的其中6孔，每孔預先放入處理好的細胞爬片(蓋玻片)。將接種好的12孔板放入37 ℃，5%CO2，飽和濕度下培養3-5 d，細胞達到70%左右時，吸出預檢測細胞的培養液，用緩沖液DPBS清洗細胞爬片后，用4%多聚甲醛固定爬片20-30 min，DPBS沖洗除去固定液，按免疫組化試劑盒操作程序進行CK19、integrin-β1免疫細胞化學染色(CK19、integrin-β1為源于人、小鼠、大鼠的多克隆抗體)，分兩組，每組3孔。

1.7統計學分析

2結果

2.1兩種培養基培養的毛囊干細胞的形態學比較

用K-SFM分離培養第1代羊駝毛囊干細胞，第2天可見部分細胞貼壁(細胞周圍無光暈)，部分未貼壁(細胞周圍有光暈)，在開始培養的3 d內，細胞呈圓形，未伸展成多角形的形態，從第6天開始可見呈多角形的細胞，形成幾個細胞聚集的呈小島狀均勻分布小克隆(見圖1A)，此后細胞增殖加速，10-15 d細胞可接近融合，鏡下觀察毛囊干細胞呈扁平多角形或鋪路石狀(見圖1B)。

用DMEM/F12分離培養第1代羊駝毛囊干細胞，前3 d與KSF培養基培養的細胞無明顯差別，第6天形成小的、不明顯的聚集，細胞開始增殖，呈圓形，未伸展成多角形的形態(見圖1E)，一直到第11天才會呈均勻分布狀態，細胞集落中細胞的大小不等，形態不一，有些細胞呈老化狀態，體積變大，出現空泡(見圖1F)。

胰酶消化細胞制備細胞懸液，加培養基稀釋細胞進行傳代，按1∶2傳，K-SFM培養基和DMEM/F12培養基的兩組細胞均為第2天開始貼壁生長。K-SFM培養基培養的細胞生長狀況良好，呈克隆狀小島樣生長，形態一致，3-5 d多個小島樣克隆匯合，排列緊密，只有少量懸浮細胞(見圖1C，D)，前10代細胞形態無明顯變化，12代開始細胞生長緩慢，形成的小島樣克隆較小且不規則，小克隆之間匯合時間延長至12 d，細胞普遍較大，排列疏松，出現細胞衰老現象，能傳代生長至15代，另外，在消化過程中，12代以后的細胞不易脫落，胰酶消化時間逐漸延長，可延長至10 min。而DMEM/F12培養基培養的細胞生長緩慢，貼壁細胞相對要少，相對不易貼壁，總有部分細胞呈半貼壁狀態，懸浮細胞多，不易匯合，需一周左右才能匯合，細胞體積較大，排列疏松，第5代開始逐漸老化，只可傳代至8代(見1G，H)。

兩種培養基均能培養擴增一定量的羊駝毛囊干細胞，但K-SFM培養基有利于羊駝毛囊干細胞的增殖，細胞生長數量多，細胞克隆形成能力強，增殖速度快，而DMEM/F12培養基細胞數量少，細胞活力不強，傳代次數少，增殖速度慢。

A-D分別為K-SFM培養基第1代第6，10天、3代第7天和5代第6天;E-H分別為DMEM-F12培養基第1代第6和11天d、3代第6天和5代第6天圖1　兩種培養基羊駝毛囊干細胞分離培養和傳代的形態學觀察比較 (×200)Figure 1　Comparison of the morphology of hair follicle stem cells between two culture mediums (×200)

2.2兩種培養基對毛囊干細胞生長的影響

從第3代細胞生長曲線可以看出，兩種培養基中毛囊干細胞在接種前2 d生長緩慢，2-4 d進入倍增期，此后兩組之間細胞增長走勢不同，K-SFM培養基進入倍增期后仍然保持增殖態勢，沒有明顯平臺期，而DMEM-F12培養基毛囊干細胞增殖緩慢，進入倍增期，從第5天開始出現接觸抑制，生長速度減慢，進入平臺期(見圖2)。K-SFM組和DMEM-F12組間細胞增殖數量差異有統計學意義(P<0.01)。

2.3兩種培養基對毛囊干細胞增殖的影響

由圖3可看出，兩種培養體系對羊駝毛囊干細胞克隆形成率有明顯的影響，K-SFM培養基培養基細胞克隆形成率明顯高于DMEM-F12培養基細胞的克隆形成率，而且兩種培養體系都是第5代干細胞克隆形成率高于第3,7,9代。通過t檢驗，K-SFM組和DMEM-F12組之間細胞克隆形成率差異有統計學意義(P<0.01)。

同一時間與K-SFM組比較,*P<0.01圖2 第3代羊駝毛囊干細胞生長曲線Figure2 Thegrowthcurveofpassage3alpacahairfolliclesstemcellsbetweentwogroups

2.4毛囊干細胞的免疫細胞化學檢測結果

CK19、integrin-β1是毛囊干細胞及祖細胞特異性標志物，對培養細胞進行上述指標檢測，羊駝毛囊干細胞免疫組化染色結果可以看出，兩種培養基培養的細胞CK19均呈現陽性，在細胞膜內外表達，細胞核呈淺藍色或藍紫色，細胞質呈褐色(見圖4A、B)，而空白對照無表達，作為陰性對照(見圖4C)。兩種培養基培養的細胞integrin-β1也呈陽性表達，細胞核呈淺藍色或藍紫色，細胞質呈褐色(見圖4D、E)，而空白對照無表達，作為陰性對照(見圖4F)。

相同代次與K-SFM組比較，*P<0.01圖3　不同代次兩組羊駝毛囊干細胞克隆形成率比較Figure3　Comparison of clone formation rate in different passage between two groups

A-C分別為K-SFM培養第3代細胞CK19陽性表達、integrin-β1陽性表達、對照組;D-F分別為DMEM/F12培養第3代細胞CK19陽性表達、integrin-β1陽性表達、對照組圖4　毛囊干細胞免疫細胞化學鑒定 (×300)Figure 4　Immunocytochemical identification of hair follicle stem cells (×300)

3討論

本實驗選用的兩種培養基均為無血清培養基。雖然血清中含有多種黏附因子可促進細胞貼壁，但血清的成分復雜，可促進細胞復層化和分化[12]，故實驗中采用無血清培養基培養。此外，研究顯示血清中的一些成分和Ca2+可以抑制角質形成細胞的分裂促其分化，最終細胞發生老化、凋亡[18]，使用無血清培養基可以排除血清中許多未知因素的干擾，并減少動物血清帶來的不利影響[10,12]。

許多研究報道，毛囊干細胞培養所用的培養基為無血清角質化培養基[1,11,18,19]和自配無血清培養基DMEM/F12[3,12,20]，故本實驗采用這兩種培養基進行比較培養，旨在選擇更適合羊駝毛囊干細胞的生長條件。在角朊細胞生長過程中存在兩種主要的生長因子增殖信號途徑，即胰島素激活途徑和表皮生長因子(EGF)激活途徑[2]，故在培養基中添加胰島素和EGF。鑒于氫化可的松可抑制成纖維細胞和黑色素細胞的增殖[10,21]，能夠進一步的純化毛囊干細胞，故此實驗中在培養體系中添加了氫化可的松。

K-SFM培養基富含銅、硒、鋅等微量元素和豐富的必需氨基酸，可為毛囊干細胞的生長提供良好的營養[10,18]，獲得較純的毛囊干細胞，且具有良好的增殖能力，能形成較多的克隆。

形態學觀察顯示，兩種培養基均能培養一定量的羊駝毛囊干細胞，K-SFM培養基細胞生長數量多，細胞克隆形成能力強，增殖速度快，DMEM/F12培養基細胞數量少，細胞活力不強，傳代次數少，增殖速度慢。由此可知，K-SFM培養基更利于羊駝毛囊干細胞的生長和增殖，在體外培養條件下，無血清K-SFM培養基更能保持毛囊干細胞高增殖、低分化的生長特性。

外根鞘細胞與表皮細胞均屬于上皮細胞，但它們在體內表達的角蛋白具有明顯的差異，表皮細胞表達CK1和CK10等分子量較大的分化標記蛋白，而在毛囊外根鞘中表達CK6、CK16和CK19等分子量較小的增殖相關角蛋白[22]，CK19可作為皮膚干細胞的標記[23]。β1整合素被認為是表皮干細胞的標志物之一[12]，Moll[24]發現β1整合素在毛囊部和基質處的角質細胞強烈表達，β1整合素陽性細胞包含了干細胞和部分祖細胞[12]。故本實驗選用CK19和β1整合素做羊駝毛囊干細胞的分子標記物，實驗表明，均為陽性表達，與史明艷等[20]對山羊毛囊干細胞的鑒定結果一致。

本實驗利用DispaseⅡ酶分離毛囊的真皮鞘以純化培養毛囊干細胞，再用胰酶消化毛囊得到毛囊干細胞。這樣避免了拔毛法造成毛囊的損傷和工作量大等問題，而且減少了操作過程中的污染問題，也減少了成纖維細胞的生長，提高了毛囊干細胞的純度。

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Effect of two kinds of culture medium on the alpaca hair follicle stem cell growth and proliferation

GONG Huimin1, BAI Rui2, JIA Zongfei2, DONG Changsheng2, PANG Quanhai2*

(1DepartmentofMorphology,JinciCollegeofShanxiMedicalUniversity,Taiyuan030025,China;2CollegeofAnimalScienceandVeterinaryMedicine,ShanxiAgriculturalUniversity；*Correspondingauthor,E-mail:pangquanhai@126.com)

Abstract：ObjectiveTo compare the effect of K-SFM and DMEM/F12 on alpaca hair follicle stem cell growth and proliferation.MethodsSkins were collected from the back of 2-3-year-old alpaca. The alpaca hair stem cells were disassociated with collagenase and trypsin. The keratinocyte serum free medium(K-SFM) and the self-made serum-free medium (DMEM/F12) were used to culture the alpaca follicle stem cells, and then the growth conditions were compared. The expression of CK19 and integrin-β1 was detected in stem cells.ResultsThe cultured cells expressed CK19 and integrin-β1 and desmin in cytoplasm, demonstrating that they were indeed alpaca hair follicle stem cells. Some alpaca hair follicle stem cells were cultured in both two kinds of medium. K-SFM was beneficial to the growth of the alpaca follicle stem cells, with a large number of the cells, the powerful ability of cellclone formation, and the rapid reproduction. After cultured with DMEM/F12, the number of the alpaca follicle stem cells was less, its vitality was lower, its passage was decreased, and its reproduction was slower.ConclusionThe present study successfully isolate and identify the alpaca hair follicle stem cells, and K-SFM medium is more suitable for the culture of alpaca hair follicle stem cells in vitro.

Key words:alpaca;hair follicle stem cells;cell culture;immunocytochemistry

基金項目：國家自然科學基金資助項目(30972223);山西農業大學博士啟動基金資助項目(412528);山西農業大學博士后基金資助項目(614114)

作者簡介：弓慧敏，女，1983-05生，碩士，助教，E-mail：397362842@qq.com

收稿日期：2016-01-10

中圖分類號：R329.2

文獻標志碼：A

文章編號：1007-6611(2016)05-0424-05

DOI：10.13753/j.issn.1007-6611.2016.05.006