miR-373-3p參與去甲腎上腺素對結腸癌細胞RKO體外增殖的調控

馬瑞麗， 韓　佳， 侯　妮， 黃　辰,3*

(1西安交通大學醫學部細胞生物學與遺傳學系，西安　710061； 2西安醫學院基礎醫學部； 3西安交通大學醫學部心血管研究中心；*通訊作者，E-mail：hchen@mail.xjtu.edu.cn)

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miR-373-3p參與去甲腎上腺素對結腸癌細胞RKO體外增殖的調控

馬瑞麗1,2， 韓佳1， 侯妮1， 黃辰1,3*

(1西安交通大學醫學部細胞生物學與遺傳學系，西安710061；2西安醫學院基礎醫學部；3西安交通大學醫學部心血管研究中心；*通訊作者，E-mail：hchen@mail.xjtu.edu.cn)

摘要：目的確定miR-373-3p是否參與去甲腎上腺素對結腸癌細胞RKO細胞增殖的調控。方法將結腸癌細胞RKO分為處理組和對照組，處理組細胞培養于含有終濃度10 μmol/L去甲腎上腺素的培養基中，對照組培養于正常培養基中，使用MTT法檢測細胞增殖的差異。使用劃痕實驗觀察細胞遷移，使用流式細胞術檢測細胞周期。通過RT-PCR檢測處理組細胞的miR-373-3p表達量。合成miR-373-3p的DNA抑制劑si-miR-373-3p，將其轉染入細胞，觀察其對RKO細胞增殖的影響。采用SPSS22.0對數據進行統計學分析，P<0.05視為有統計學差異。結果10 μmol/L去甲腎上腺素促進RKO細胞的體外增殖(P<0.05)和遷移過程。細胞周期結果顯示，處理組細胞S期和G2期比例均上升。處理組細胞miR-373-3p表達量上升(P<0.05)，轉染si-miR-373-3p的RKO細胞增殖受到抑制(P<0.05)。對轉染si-miR-373-3p的細胞，去甲腎上腺素不再促進細胞增殖。結論miR-373-3p參與了去甲腎上腺素促進的結腸癌細胞RKO的增殖過程。

關鍵詞：去甲腎上腺素；結腸癌；細胞增殖；miR-373-3p

結腸癌(colorectal cancer，CRC)是發生在結腸和直腸的消化系統惡性腫瘤，為世界第三大高發癌癥，2012年結腸癌患者為354萬，因其死亡的人數69萬[1]。結腸癌的發生與基因突變、飲食、炎癥、生活方式等多種因素相關。近年來的研究發現，腎上腺素、去甲腎上腺素與癌癥的發展和轉移密切相關。Pu等[2]的研究發現，腎上腺素可以誘導結腸癌細胞HT29的遷移，并增加其抗藥性。Yang等[3]的研究表明，去甲腎上腺素可以通過誘導IL-6的表達，參與到胃癌的發生過程中。Stock等[4]的研究發現，去甲腎上腺素會阻滯胰腺癌細胞的遷移。這些研究說明，去甲腎上腺素參與到癌癥的發展中，但其在結腸癌中的作用機制還有待于更進一步的研究。

微小RNA(microRNA，miRNA)是一類進化上高度保守的單鏈非編碼小分子RNA，在真核生物中廣泛存在，主要由基因的內含子部位剪切產生。已有的研究表明，miRNA的作用方式主要有兩種方式：當其與目的蛋白的mRNA完全互補時，誘導目的蛋白降解；當其與目的蛋白的mRNA不完全互補時，通過不完全的堿基配對，與目的蛋白mRNA的3′UTR區結合，抑制其轉錄[5]，調節細胞的各種功能。已有研究表明，miR-373作為促癌基因，作用于YOD1基因，促進了宮頸癌的發展[6]。在非小細胞肺癌中，miR-373被組蛋白去乙?；聊诜切〖毎伟┑陌l展和轉移中發揮了重要作用[7]。本研究旨在觀察miR-373-3p是否參與由去甲腎上腺素介導的結腸癌細胞RKO增殖和遷移的過程。

1材料與方法

1.1細胞株和主要試劑

人結腸癌細胞RKO由西安交通大學醫學部環境與疾病相關基因教育部重點實驗室提供，培養于含10%胎牛血清的1640培養基中。置于37 ℃、5% CO2培養箱中，隔天換液，取對數生長期細胞進行實驗。重酒石酸去甲腎上腺素(norepinephrine，NE)購于美國Sigma公司；轉染試劑Lipfectamine 2000 Transfection和RNA提取試劑Trizol購于美國Invitrogen公司；逆轉錄試劑盒PrimeScript RT Regent kit和real time PCR試劑盒SYBR premix EX TaqTM購于日本TaKaRa公司，引物和抑制劑由中國上海生工生物工程股份有限公司合成。

1.2MTT檢測細胞增殖

按5 000個細胞/孔進行96孔板鋪板，12 h向培養基中加入NE，藥物終濃度為10 μmol/L，每組做5個復孔。加NE后24 h,48 h和72 h使用MTT法測定細胞數目。

1.3劃痕實驗檢測細胞遷移

按2×105/孔鋪6孔板，12 h用10 μl加液器吸頭劃線，并換培養基為含10 μmol/L NE和1%胎牛血清的培養基，分別于24 h,48 h和72 h觀察其劃痕愈合情況。

1.4流式細胞儀檢測細胞周期

按2×105/孔鋪6孔板，12 h時加入10 μmol/L NE，10%胎牛血清的培養基培養24 h，用胰酶消化細胞，PBS洗滌2次，75%乙醇固定，用碘化丙啶染色，避光靜置30 min后使用流式細胞儀檢測細胞周期。

1.5引物設計

設計miR-373-3p和U6的逆轉錄引物和實時定量PCR引物，以及DNA抑制劑si-miR-373-3p,序列見表1。

表1Real Time PCR所用引物序列及miR-373-3p抑制劑序列

Table 1Real time PCR primer sequence and miR-373-3p inhibitor sequence

名稱 序列(5'-3')miR-373-3pRT:GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCG-GCAATTGCACTGGATACGACACACCCCmiR-373-3pF:ATCCAGTGCGTGTCGTGmiR-373-3pR:TGCTGAAGTGCTTCGATTTTU6RT:CGCTTCACGAATTTGCGTGTCATU6F:GCTTCGGCAGCACATATACTAAAATU6R:CGCTTCACGAATTTGCGTGTCATsi-miR-373-3pACACCCCAAAATCGAAGCACTTC

1.6RNA抽提和鑒定以及逆轉錄PCR獲取cDNA

按2×105/孔鋪6孔板，12 h時加入10 μmol/L NE，使用含10%胎牛血清的1640培養基培養24 h，使用Trizol試劑盒提取總RNA。分別利用miR-373-3p特異性逆轉錄引物和內參U6引物進行逆轉錄，獲取cDNA，反應產物4 ℃保存。

1.7實時定量PCR(RT-PCR)檢測miR-373-3p表達量變化

采用試劑盒SYBR Premix Ex TaqTMⅡ(Perfect Real Time)， 設置U6作為內參，檢測處理組和對照組miR-373-3p表達量，每組樣本均做3個重復。讀取RT-PCR反應結果的Ct值，計算2-ΔΔCt分析比較樣品中miR-373-3p表達量的差異。

1.8si-miR-373-3p瞬時轉染

按5 000個細胞/孔進行96孔板鋪板，鋪板12 h時進行轉染。分別設置陰性對照組，si-miR-373-3p組,si-miR-373-3p+NE組，每組設5個復孔。其中陰性對照組轉染的為亂序對照，si-miR-373-3p組轉染si-miR-373-3p，si-miR-373-3p+NE組在轉染si-miR-373-3p 4 h后換液為含10 μmol/LNE的培養基。按照Lipfectamine 2000 Transfection 試劑盒要求進行轉染，加NE后24 h,48 h和72 h使用MTT法測定細胞數量。

1.9統計學分析

采用SPSS22.0對實驗結果進行t檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1NE促進RKO細胞增殖

MTT實驗結果顯示，處理組細胞增殖活性高于對照組，結果有統計學差異(P<0.05，見圖1)。

2.2NE促進RKO細胞遷移

劃痕實驗結果顯示，10 μmol/L NE促進細胞遷移(見圖2)。

圖1　NE對RKO細胞增殖的影響　Figure 1　Effects of NE on RKO proliferation

圖2　NE對RKO細胞遷移的影響Figure 2　Effects of NE on RKO cells migration

2.3NE對RKO細胞周期的影響

流式細胞儀檢測細胞周期發現，處理組細胞的S期比例上升(P<0.05)，G2期比例上升(見圖3)。

2.4NE使RKO細胞miR-373-3p表達量上調

RT-PCR結果顯示，處理組的細胞miR-373-3p的表達量上升，結果有統計學差異(P<0.05，見圖4)。

2.5si-miR-373-3p抑制RKO細胞增殖

si-miR-373-3p組細胞與陰性對照組細胞相比較，增殖活力下降(P<0.05)，si-miR-373-3p+NE組細胞增殖活力與陽性對照組相比顯著下降(P<0.05)。RT-PCR結果顯示,轉染si-miR-373-3p后細胞中miR-373-3p表達量顯著下調(P<0.05，見圖5)。

圖3　NE對RKO細胞周期的影響Figure 3　Effects of NE on cells cycle distribution

與對照組比較，*P<0.05圖4　NE對miR-373-3p表達量的影響Figure 4　Effects of NE on miR-373-3p expression in RKO cells

B. 轉染si-miR-373-3p后miR-373-3p的表達量與對照組比較，*P<0.05圖5　si-miR-373-3p，si-miR-373-3p+NE對RKO細胞增殖的影響Figure 5　Effects of si-miR-373-3p,si-miR-373-3p+NE on RKO cells proliferation

3討論

隨著醫學模式的改變，精神應激與疾病的關系越來越引起人們的注意。精神應激是指機體在各種內外界環境及社會、心理因素刺激下所表現出的全身性非特異性反應。面臨精神應激時，機體的所有器官最終都會發生改變，但神經內分泌系統的改變是其他器官功能改變的先導和基礎。應激狀態下的神經內分泌變化錯綜復雜，但主要包括腎素-血管緊張素和HPA軸的激活，兒茶酚胺類物質(腎上腺素和去甲腎上腺素)的增加是非常典型的表現之一[8]。去甲腎上腺素作為重要的神經遞質，其在癌癥發展中的作用受到越來越多的研究。Fitzgerald等[9]和Pai等[10]的文章均發現，使用去甲腎上腺素削弱藥品的病人，其癌癥發生率下降，這提示去甲腎上腺素濃度升高可能是癌癥發生發展的原因之一。我們的實驗發現，去甲腎上腺素可以促進結腸癌細胞的體外增殖，劃痕實驗顯示去甲腎上腺素促進了RKO細胞的遷移，這與Shan等[11]在胃癌中的研究結果一致。細胞周期分析顯示處理組細胞S期和G2期均上升，說明其促進DNA合成，加速了細胞分裂過程。進一步證明去甲腎上腺素具有促進RKO細胞體外增殖的功能。然而，其促進細胞增殖的具體機制并不明確。

去甲腎上腺素與細胞膜上的β2受體結合后，通過G蛋白偶聯受體，引起cAMP濃度上升，激活cAMP依賴性蛋白激酶PKA，導致其下游的蛋白磷酸化，調節細胞的各項功能[12]。CREB作為重要的轉錄因子，被PKA激活后，進入胞核內，引起目的基因轉錄水平的改變。Zhang等[13]的研究發現，CREB可以調控miR-373的表達，引起其下游基因TP53INP1，CD44等的表達量改變。據此，我們推測miR-373可能是去甲腎上腺素誘導的RKO細胞體外增殖的調控機制之一。

miR-373位于第19號染色體上，是miR-371-373家族中的一員，其與腫瘤發生發展的關系較為復雜，在不同的腫瘤中，其表達情況不盡相同，但在大部分腫瘤中，其與癌癥的發生發展是正相關的[14]。通過實時定量PCR，我們發現在處理組細胞中miR-373-3p的表達量顯著上調，初步說明miR-373-3p可能參與了去甲腎上腺素促進的RKO細胞增殖的過程。為了進一步確認miR-373-3p的作用，我們設計了miR-373-3p的抑制劑，將其轉染到細胞中,結果表明，抑制劑組的細胞，其增殖活性明顯下降。對轉染過抑制劑的細胞，去甲腎上腺素不再促進其細胞增殖。為了確保抑制效率，我們對轉染si-miR-373-3p的細胞進行了總RNA抽提和RT-PCR驗證，發現其miR-373-3p表達量顯著下調，說明抑制劑設計合理。這些結果表明，miR-373-3p的確參與了由去甲腎上腺素誘導的結腸癌細胞的增殖。

綜上所述，去甲腎上腺素能夠促進結腸癌細胞RKO的體外增殖，且在其調控過程中有miR-373-3p的參與。我們推測miR-373-3p可能通過去甲腎上腺素-β2受體-cAMP-CREB-miR-373-3p-目的基因的通路，在RKO細胞的增殖過程中起到調控作用。這將在后續的實驗中深入研究，同時也將為癌癥的靶向治療提供新思路。

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The miR-373-3p participated in the regulation of norepinephrine(NE) on RKO proliferationinvitro

MA Ruili1,2, HAN Jia1, HOU Ni1, HUANG Chen1,3*

(1DepartmentofCellBiologyandGenetic,Xi’anJiaotongUniversityschoolofMedicine,Xi’an710061,China;2CollegeofBasicMedicalScience,Xi’anMedicalUniversity;3CardiovascularResearchCenter,Xi’anJiaotonguniversityschoolofMedicine;*Correspondingauthor,E-mail:hchen@mail.xjtu.edu.cn)

Abstract：ObjectiveTo confirm whether miR-373-3p was involved in the regulation of norepinephrine(NE) on RKO proliferation in vitro. MethodsRKO cells were divided into NE group and control group. RKO cells were cultured in medium containing final concentration of 10 μmol/L NE in NE group and normal medium in control group. Cell proliferation was measured by MTT. Wound healing was used to observe the migration ability. Flow cytometry was adopted to analyze the change of cell cycle distribution. The level of miR-373-3p was detected by real-time PCR. The si-miR-373-3p was synthesized and then transfected into cells to observe its effect on cell proliferation. SPSS22.0 was chosen to analyze the data,and P<0.05 was considered as statistically significant difference.ResultsThe 10 μmol/L NE promoted proliferation(P<0.05) and migration ability of RKO cells in vitro. In NE group, the percentage of S phase and G2 phase cells were higher than in control group, and the relative expression of miR-373-3p was up-regulated(P<0.05). The si-miR-373-3p caused a decline of cell proliferation(P<0.05). NE didn’t promote the proliferation of RKO cells after transfected with si-miR-373-3p.ConclusionThe miR-373-3p may participate in the regulation of NE on RKO cells proliferation in vitro.

Key words:norepinephrine(NE);colorectal cancer;cell proliferation;miR-373-3p

基金項目：國家自然科學基金青年基金資助項目(31100969)

作者簡介：馬瑞麗，女，1985-05生，本科，助理實驗師，E-mail:mary3578@163.com

收稿日期：2016-03-03

中圖分類號：R735.35

文獻標志碼：A

文章編號：1007-6611(2016)05-0429-05

DOI：10.13753/j.issn.1007-6611.2016.05.007