新型前哨淋巴結示蹤劑的制備及動物實驗研究

叢斌斌，孫 曉，宋現讓，曹曉珊，劉雁冰，趙 桐，

田崇麟1，2，于金明4，王永勝21.濟南大學山東省醫學科學院醫學與生命科學學院，山東 濟南 250200；2.山東大學附屬山東省腫瘤醫院乳腺病中心，山東 濟南 250117；3.山東大學附屬山東省腫瘤醫院基礎實驗室，山東 濟南 250117；4.山東大學附屬山東省腫瘤醫院放療科，山東 濟南 250117

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新型前哨淋巴結示蹤劑的制備及動物實驗研究

叢斌斌1，2，孫 曉2，宋現讓3，曹曉珊1，2，劉雁冰2，趙 桐2，

田崇麟1，2，于金明4，王永勝2
1.濟南大學山東省醫學科學院醫學與生命科學學院，山東 濟南 250200；2.山東大學附屬山東省腫瘤醫院乳腺病中心，山東 濟南 250117；3.山東大學附屬山東省腫瘤醫院基礎實驗室，山東 濟南 250117；4.山東大學附屬山東省腫瘤醫院放療科，山東 濟南 250117

［摘要］背景與目的：前哨淋巴結活檢是臨床腋窩淋巴結陰性早期乳腺癌患者治療的標準。準確定位前哨淋巴結對分期、預后及治療至關重要。該研究將利妥昔單抗與熒光示蹤劑吲哚菁綠偶聯，制備新型前哨淋巴結示蹤劑，確定最佳偶聯比例，并對其生物學特性、安全限度及定位性能進行研究。方法：直接偶聯法制備新型前哨淋巴結吲哚菁綠-利妥昔單抗，雙層析快速薄層層析-硅膠層析紙法測定標記率，非還原型SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳法和雙抗體夾心間接酶聯免疫測定法檢測新型示蹤劑中單抗分子完整性和免疫活性，按中華藥典要求檢測新型示蹤劑的安全限度及在小鼠體內前哨淋巴結的定位性能。結果：新型示蹤劑中利妥昔單抗分子完整且保持了單抗的免疫活性，利妥昔單抗大分子上吲哚菁綠的標記率為100%，新型示蹤劑為無菌、無致熱原的溶液且局部注射不會產生危害。利妥昔單抗與吲哚菁綠質量比例為4∶1、6∶1偶聯形成的新型示蹤劑，前哨淋巴結顯像效果最佳。前哨淋巴結定位與核素法一致。結論：吲哚菁綠-利妥昔單抗偶聯的新型前哨淋巴結示蹤劑的制備工藝簡單且無放射性危害，其中單抗的分子完整性和免疫活性無破壞，為無菌、無致熱原、無急性毒性的示蹤劑，能夠用于前哨淋巴結顯像。

［關鍵詞］前哨淋巴結；顯像劑；利妥昔單抗；吲哚菁綠；淋巴顯像

Correspondence to: WANG Yongsheng E-mail: wangysh2008@aliyun.com

前哨淋巴結(sentinel lymph node，SLN)是乳腺癌轉移的第一站淋巴結，其病理情況對乳腺癌外科手術方式及術后綜合治療有重要的指導價值。前哨淋巴結活檢(sentinel lymph node biopsy，SLNB)是乳腺癌淋巴結分期的技術手段，準確定位SLN是乳腺癌SLNB研究一直關注的技術領域。SLN定位的示蹤劑包括染料、核素、熒光等，這些均為非特異性示蹤劑，利用淋巴結內巨噬細胞吞噬作用將示蹤劑滯留在SLN內。此類顆粒型示蹤劑顆粒直徑為50～200 nm，大小不均，每次注入顆粒總數不易控制，容易出現術中檢出次級淋巴結的情況。本研究將淋巴結特異性結合的利妥昔單抗(rituximab)與熒光示蹤劑吲哚菁綠(indocyanine green，ICG)偶聯，制備新型SLN示蹤劑ICG-利妥昔單抗，并對其體外特性、安全限度及定位性能進行研究。

1　材料和方法

1.1實驗動物

BALB/c小鼠40只，18～20 g，雌性，無菌級，購自北京華阜康生物技術股份有限公司。

1.2主要實驗試劑

利妥昔單抗，100 mg，購自瑞士巴塞爾豪夫邁羅氏有限公司；ICG(注射用吲哚菁綠)，25 mg，購自丹東醫創藥業有限責任公司；滅菌注射用水，5 mL，購自天津藥業集團新鄭股份有限公司；半透膜直徑22 mm，截留分子量4×103~6×103，購自美國光譜醫學公司；熒光成像儀(MDM-I型熒光脈管系統)，購自廊坊明德生物醫藥技術有限公司；γ探測儀(Neoprobe 2000)購自美國強生公司；磷屏顯像儀(Cyclone磷屏成像系統)購自美國Packard公司；雙層硅膠層析紙(ITLC-SG)購自德國Gelman公司；ELISA試劑盒(兔ELISA試劑盒)購自上海拜力生物科技有限公司；RPMI-1640培養基、胎牛血清購自美國Hyclone公司；PowerPac Basic電泳裝置購自美國Bio-Rad公司；其他試劑為國產AR級。

1.3新型示蹤劑的制備

室溫下，按照無菌操作原則將100 mg利妥昔單抗用10 mL滅菌注射用水配制成10 mg/mL的溶液，置于50 mL無菌離心管內冷藏(2~8℃)保存備用；將25 mg ICG用10 mL滅菌注射用水配制成濃度為2.5 mg/mL的溶液，置于50 mL無菌離心管內避光保存備用。室溫下，分別取6份體積為0.5 mL的已配制完成的10 mg/mL利妥昔單抗溶液置于10 mL離心管中，取利妥昔單抗與ICG質量比為3∶1、4∶1、6∶1、12∶1、30∶1 及32∶1的相應體積的2.5 mg/mL ICG溶液，將ICG溶液緩慢滴入利妥昔單抗溶液中。觀察離心管內偶聯反應后有無沉淀生成，若有沉淀產生，則將裝有偶聯反應物的離心管進行離心沉淀(2012×g，20 min)去除離心管底部的沉淀后，取上清液置于半透膜制成的透析袋中；若無沉淀產生則將混合液直接置于透析袋中，室溫避光條件下以偶聯反應物混合液與滅菌注射用水體積比為1∶200的比例進行透析，先用流水透析5 min，之后置于滅菌注射用水的容器中繼續透析，每2 h更換滅菌注射用水透析液，取每次透析結束更換的透析液進行熒光成像儀檢測，確定偶聯物中有無游離的小分子ICG，通過此方法將透析袋中的小分子ICG完全洗脫出去，然后收集ICG-利妥昔單抗偶聯物。

1.4新型示蹤劑的體外特性

1.4.1標記率測定

采用雙層析快速薄層層析-硅膠層析紙(ITLC-SG)法測定標記率。體系1為V吡啶∶V乙醇∶V水=5∶2∶1，體系2為丙酮。用體系1時ICG在原點，新型示蹤劑在前沿；用體系2時利妥昔單抗和新型示蹤劑在原點，ICG在前沿。

1.4.2分子完整性測定

8%非還原型SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳法檢測新型示蹤劑中單抗分子的完整性，利妥昔單抗為陽性對照，確定新型示蹤劑中單抗分子的完整性。

1.4.3免疫活性檢測

采用雙抗體夾心間接酶聯免疫吸附(enzymelinked immunosorbent assay，ELISA)法檢測新型示蹤劑中單抗分子的免疫活性。兔抗鼠IgG-Fab抗體為包被抗體，采用質量分數為1%的牛血清白蛋白封閉1 h，加入利妥昔單抗與ICG質量比為4∶1、6∶1、12∶1、30∶1及32∶1的新型示蹤劑，在室溫條件下避光反應2 h，加入辣根過氧化物酶標記的羊抗人IgG-Fc段抗體，在室溫條件下避光反應1 h，鹽酸鄰苯二胺顯色，酶聯儀測定D412 nm值。

1.5安全限度檢測

1.5.1細菌檢測

分別將0.5 mL利妥昔單抗與ICG質量比為4∶1、6∶1、12∶1、30∶1及32∶1的新型示蹤劑移入含有10%胎牛血清培養液的RPMI-1640細胞培養基中進行細菌檢測，在37℃下培養1周，觀察有無細菌產生。

1.5.2致熱原檢測

以大腸桿菌內毒素(1 U/mL)為陽性對照，無菌、無致熱原注射用水為陰性對照，應用鱟試驗檢測新型示蹤劑是否存在致熱原。用1 mL注射用水溶解鱟試劑，將待測樣品加入到已溶解的鱟試劑中，于37℃下溫育1 h。試劑若呈膠凍狀為有致熱原；若為澄清液體，則無致熱原。

1.5.3急性毒性實驗

BALB/c小鼠20只，雌性，體質量為(20±0.1)g，分為5組，每組4只。每組小鼠后肢腳墊皮下分別以1.2和12 mg/kg劑量注射5種不同質量比的新型示蹤劑，相當于人體用量的10和100倍。觀察1周內小鼠的生存情況。

1.6SLN定位性能

分別將10 μL 5種不同質量比的新型示蹤劑分別注射于50只(每組10只)小鼠的后肢足墊皮下，用熒光成像儀持續觀察24 h，詳細記錄出現SLN及次級淋巴結的時間。另外，將注射了新型示蹤劑且已經利用熒光成像儀明確定位SLN位置的10只小鼠的后肢足墊皮下注射10 μL SLN標準示蹤劑99mTc-硫膠體（10 μCi，185 kBq)。注射后2 min用γ探測儀定位放射性活性SLN位置并用磷屏顯像儀進行小鼠腹股溝SLN顯像，以明確新型示蹤劑定位的SLN位置是否與核素法定位的一致。

1.7統計學處理

應用SPSS 17.0軟件進行統計分析。兩組獨立樣本間的比較采用t檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2　結 果

2.1新型示蹤劑的體外特性

在制備過程中發現，5種不同質量比的利妥昔單抗與ICG新型示蹤劑在透析12 h之后均未見ICG浸入透析液，說明ICG經過偶聯反應完全結合到利妥昔單抗上，而質量比為3∶1混合偶聯時會出現沉淀，經過分析確定為ICG成分濃度過高引起的沉淀，其他質量比例的制備過程中均未見沉淀。鑒于沉淀會影響SLN顯像的情況，因此3∶1質量比的新型示蹤劑未進行進一步的實驗。

ITLC-SG法檢測顯示，在5種不同質量比的利妥昔單抗與ICG的新型示蹤劑中，利妥昔單抗大分子上ICG的標記率為100%。

5種不同質量比的利妥昔單抗與ICG的新型示蹤劑，8%非還原型SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳法檢測顯示未見明顯降解條帶，說明新型示蹤劑中單抗分子完整(圖1)。

圖 1　8%非還原型SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳法確定新型示蹤劑單抗分子完整性Fig. 1 The new tracer was analyzed for molecular integrity by 8% sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis

ELISA法顯示，不同比的ICG-利妥昔單抗和利妥昔單抗顯色反應均呈陽性，酶聯儀測定D412 nm值未見明顯差異，說明新型示蹤劑中單抗分子保持了利妥昔單抗的免疫活性。

2.2安全限度檢測

經過細菌檢測和致熱原檢測顯示，新型示蹤劑為無菌、無致熱原的溶液。分別注射了相當于人體用量10倍和100倍新型示蹤劑的20只小鼠，48 h內注射局部及全身均未見明顯異常，常規飼養1周均未見死亡，說明5種不同質量比的利妥昔單抗與ICG新型示蹤劑的LD50大于12 mg/kg，局部注射不會對人體產生危害。

圖 2　新型示蹤劑前哨淋巴結定位性能的小鼠實驗Fig. 2 Mouse experiment for SLN detection of new tracer

2.3SLN定位性能

5種不同質量比的ICG-利妥昔單抗新型示蹤劑的SLN顯像情況見表1。用熒光成像儀探測注射4∶1、6∶1的新型示蹤劑的小鼠，SLN均顯像清晰，而12∶1、30∶1及32∶1新型示蹤劑的小鼠均有無SLN顯像的情況出現，因此利妥昔單抗與ICG質量比為4∶1、6∶1的新型示蹤劑是進行SLNB顯像的最佳示蹤劑。注射了這兩種質量比例示蹤劑的小鼠首次出現腹股溝SLN的時間分別為(13.62±1.79)min和(10.07±1.40)min(表1)，而且48 h后仍只有SLN顯像而未見次級淋巴結顯像。明確定位SLN位置的10只小鼠的后肢足墊皮下注射10 μL99mTc-硫膠體，探測儀定位的SLN位置與新型示蹤劑定位的SLN位置一致，熒光成像儀中的圖像與磷屏顯像儀中的SLN的位置也一致（圖2）。

表 1　ICG-利妥昔單抗新型示蹤劑首次出現SLN的時間 （min）Tab. 1 The first appearance time of SLN in new tracer ICG-rituximab

3　討 論

SLNB作為一項腋窩準確分期的微創活檢技術，代表著乳腺癌外科治療的發展水平［1］。目前，SLN定位的示蹤劑包括染料、核素、熒光等，這些均為非特異性示蹤劑［2］。其中染料法(美蘭、專利藍和納米碳)定位SLN主要是通過術前在乳腺原發腫瘤周圍和(或)皮下注射染料，然后于腋窩區域循著被染料染色的淋巴管精細解剖找到第一枚被染色的淋巴結，從而確定SLN的具體位置，然而這種方法需要精湛的外科解剖技巧，并且經過學習曲線后仍存在較高的SLNB假陰性率，這導致SLNB的準確性難以把握［3-5］；而核素法(99mTc-硫膠體)定位SLN是通過術前于乳腺原發腫瘤周圍腺體和(或)皮下注射放射性核素，術中利用γ探測儀探測放射性計數，依據放射性計數找到計數較高的淋巴結，從而確定SLN(大于最高放射性計數10%的淋巴結)的具體位置，雖然該方法SLNB的準確率高、特異性好，但是目前部分國內醫院無核醫學科受到儀器設備條件的限制，以及在實際操作時存在放射性核素污染及醫務人員放射性恐懼的問題，而且99mTc-硫膠體中的硫膠體并未通過中國食品藥品監督管理局的批準，這些都限制了其在我國臨床實際工作中的應用［6］；熒光法定位SLN的方法與染料法相似，通過術前在乳腺原發腫瘤周圍和(或)皮下注射熒光示蹤劑，術中利用熒光成像儀循熒光顯像發亮的淋巴管找到第一枚熒光顯像的淋巴結，從而定位SLN的位置，然而由于淋巴管內滯留的熒光示蹤劑較少，其被激發所釋放出的熒光較弱，導致淋巴管熒光顯像不明顯，所以活檢過程中很難發現位置較深的淋巴管，從而導致很難循熒光顯像的淋巴管找到第一枚熒光顯像的淋巴結，造成SLN的漏檢，而位置較淺的淋巴管雖然可以清晰地發現熒光顯像但在離斷后其內的熒光示蹤劑隨淋巴液一起漏出，極易造成淋巴管周圍組織熒光示蹤劑顯像污染，導致難以辨識淋巴管的位置，最終造成SLN漏檢［7］，這也不是理想的SLN示蹤劑。

ICG是目前乳腺癌SLNB的示蹤劑之一，是一種具有含硫活性基團的小分子化合物，可以被熒光脈管系統成像儀前的近紅外光源(760 nm)激發產生熒光(820~830 nm)，所產生的熒光可以穿透人體脂肪組織。因為淋巴結中滯留的ICG比淋巴管中的多，所以淋巴結熒光顯像明顯，利用成像儀可清晰直觀地觀察到淋巴結的顯像位置。但是由于ICG分子量小并易于彌散造成了在SLNB方面的顯像率高、敏感性高和準確性低，且極易導致SLN以外的次級淋巴結顯像［7-8］。而利妥昔單抗是針對淋巴結中B淋巴細胞膜上CD20分子的特異性人源化單克隆抗體，能夠與淋巴結內CD20+的分子特異性結合，并且結合后不易解離［9］，另外其具備有與其他小分子結合的結構域，能夠與小分子物質進行偶聯反應［10］。我們將大分子的利妥昔單抗與小分子的ICG進行偶聯，其原理為小分子ICG中的含硫活性基團在室溫中性環境條件下與大分子利妥昔單抗中的自由氨基(主要為賴氨酸的ε-氨基)相結合，每個大分子的利妥昔單抗能偶聯15~20個小分子ICG，新形成的偶聯物綜合了以上兩種試劑的特點，既能夠在近紅外線的激發下使SLN熒光顯像又能特異的定位SLN。本研究中的新型示蹤劑為一種顆粒大小穩定的偶合物，通過投射電鏡確認其粒徑為200~300 nm，動物實驗顯示大劑量（100 μL）新型示蹤劑注射能夠出現小鼠腹腔和盆腔內次級淋巴結顯像，而通過劑量梯度實驗之后，適當劑量（10 μL）新型示蹤劑小鼠足墊下注射僅能夠使SLN顯像，其原理為新型示蹤劑進入SLN后與淋巴結中B淋巴細胞膜上CD20分子特異性結合，當劑量過大時示蹤劑與CD20分子結合達到飽和，過量的示蹤劑將向下一級淋巴結進行引流，而劑量適中時示蹤劑與CD20分子結合未達到飽和，僅在SLN中滯留而不會向次級淋巴結引流。動物實驗結果顯示，該新型示蹤劑進行SLNB時，通過濃度梯度實驗獲得SLN顯像的示蹤劑最佳濃度(10 μL），使得示蹤劑只能滯留在SLN中而不向次級淋巴結引流。因此在人體進行應用時需通過濃度梯度試驗獲得SLN顯像最佳濃度，通過該濃度的新型示蹤劑指導進行SLNB時，不必再循熒光顯像的淋巴管找尋SLN，只需術中用紅外線熒光顯像系統探測熒光顯像的SLN的位置，將SLN周圍組織解剖游離后，直接解剖檢出熒光顯像定位的SLN，從而避免了SLN的漏檢和周圍組織熒光顯像污染的情況。

本研究結果表明，所制備的新型示蹤劑ICG-利妥昔單抗中，利妥昔單抗大分子上ICG的標記率為100%，保持了抗體分子的完整性并保留了免疫活性，為無菌、無致熱原和無急性毒性的溶液。本研究在核素示蹤劑的前期小鼠實驗中發現，10 μL99mTc-硫膠體注射于小鼠后肢足墊后，2 min時只存在SLN顯像(盆腔腹腔解剖后)，30 min后才有可能出現次級淋巴結顯像，因此選擇2 min時進行磷屏顯像，以確定新型熒光示蹤劑的SLN定位效果與核素示蹤劑的效果一致。利妥昔單抗與ICG質量比例為4∶1、6∶1偶聯形成的新型示蹤劑，適當劑量（10 μL）進行小鼠后肢足墊注射后，SLN顯像效果最佳，且與核素法定位的SLN相一致，說明新型示蹤劑與核素示蹤劑一樣能夠準確定位SLN，用于SLN定位顯像。

總之，ICG-利妥昔單抗偶聯的新型SLN示蹤劑的制備工藝簡單、標記率高且無放射性危害，其中單抗的分子完整性和免疫活性無破壞，為無菌、無致熱原、無急性毒性的示蹤劑，能夠用于SLN顯像，具有較好的臨床應用前景。本研究結果為臨床應用提供了依據。

［參 考 文 獻］

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The preparation and experimental study of a new sentinel lymph node tracer

CONG Binbin1,2, SUN Xiao2, SONG Xianrang3, CAO Xiaoshan1,2, LIU Yanbing2, ZHAO Tong1, TIAN Chonglin1,2, YU Jinming4, WANG Yongsheng2(1.School of Medicine and Life Sciences, University of Jinan and Shandong Academy of Medical Sciences, Jinan 250200, Shandong Province, China; 2.Breast Cancer Center, Shandong Cancer Hospital Affiliated to Shandong University， Jinan 250117， Shandong Province， China； 3.Basic Laboratory，Shandong Cancer Hospital Affiliated to Shandong University， Jinan 250117， Shandong Province， China；4.Radiotherapy Department， Shandong Cancer Hospital Affiliated to Shandong University， Jinan 250117，Shandong Province, China)

［Key words］Sentinel lymph node; Imaging agent; Rituximab; Indocyanine green; Lymphoscintigraphy

［Abstract］Background and purpose: Sentinel lymph node biopsy is regarded as the standard of care in patients without clinical axillary lymph node metastases in early-stage breast cancer. Accurate detection of sentinel lymph node is an important step for staging, prognosis, and treatment. In this study, a new sentinel lymph node tracer was produced by the rituximab to combine with the fluorescence tracer （indocyanine green， ICG）， and to identify the most appropriate combination ratio of the two agents. Its biological property and safety limitation were evaluated. Methods: Rituximab was combined directly with ICG. The new tracer was analyzed for labeled rate by instant thin-layer chroma-tography-silica gel, molecular integrity by sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis and molecular immune activity by ELLAS. The safety limitation was tested according to the Chinese Pharmacopeia. The localization ability of sentinel lymph node was tested in mice. Results: The new tracer was intact and kept the immune activity of rituximab. The ICG labeled rate of rituximab was 100%. The new tracer was bacteria and pyogen free, and was safe to body with location injection. The most appropriate combination ratio of rituximab and ICG was 4∶1 and 6∶1 with the best sentinel lymph node imaging. The location of sentinel lymph node identified by the new tracer was accorded with the radiotracer. Conclusion: The preparation method of the new sentinel lymph node tracer is simple and no radioactive injury. The new tracer has no bacteria, no pyogen and no acute toxicity, and can be used in sentinel lymph node visualization.

DOI:10.3969/j.issn.1007-3969.2016.03.007

中圖分類號：R73-35

文獻標志碼：A

文章編號：1007-3639(2016)03-0245-06

基金項目：山東省自然科學基金重點項目（ZR2014HZ003）。

通信作者：王永勝 E-mail:wangysh2008@aliyun.com

收稿日期：（2015-07-03 修回日期：2015-10-26）