miR-296在卵巢癌中的表達及其靶基因的預測研究

權效珍　蘭艷麗

441021 湖北文理學院附屬襄陽市中心醫院

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miR-296在卵巢癌中的表達及其靶基因的預測研究

權效珍蘭艷麗

441021 湖北文理學院附屬襄陽市中心醫院

【摘要】目的觀察miR-296在卵巢癌中的表達及其靶基因的預測。方法收集卵巢癌患者組織樣本22例和婦科活檢為正常的樣本22例，在提取RNA后進行RNA純度檢測，進而檢測miR-296在卵巢癌中的表達；在卵巢癌細胞中穩定轉入高表達miR-296的質粒，miRNA芯片進行靶基因檢測。結果卵巢癌組織中miR-296高表達，與正常對照組相比，差異有統計學意義(P<0.001)。在卵巢癌細胞系中，當高表達miR-296時，microRNA143和microRNA215在轉染組中高表達，microRNA96、microRNA551b、microRNA502-3p低表達。結論miR-296在卵巢癌中高表達，且其潛在的靶基因有可能作為臨床卵巢癌診斷的標志。

【關鍵詞】miR-296；卵巢癌；靶基因

(ThePracticalJournalofCancer,2016,31:727～729)

卵巢癌被認為是常見惡性腫瘤中致死率較高的腫瘤疾病，特別是在東亞和南非國家中尤為常見，且在發展中國家中，卵巢癌患者發病率和死亡率也明顯要高于其他發達國家[1-2]。卵巢癌患者的發病率是一個多因素，多步驟，復雜的過程，而且和各類婦科疾病及患者身體狀況有關系[3]，但是其潛在形成惡性腫瘤的機制還未被研究清楚。microRNA被報道是一個小的非編碼RNA，它可以調節RNA的轉錄功能，進而促進或者抑制腫瘤基因的表達[4]。到現在為止，超過1000個人類microRNA被確認而且被報道在RNA數據庫中，而且有些被用來作為診斷、預后和治療的分子生物標記物[5-6]。miR-296位于染色體20q13.32處，有研究報道miR-296的分子作用是與血管生成有關，是一個比較好的腫瘤抑制劑，參與調節細胞極性[7-8]。但是miR-296在卵巢癌中的研究較少，且關于其靶基因在卵巢癌中的研究在國內外均未見報道。

1材料與方法

1.1臨床資料

收集我院腫瘤科卵巢癌患者樣本22例，將婦科活檢為正常的樣本22例進行對照，患者各類臨床資料均良好保存。

1.2方法

1.2.1Q-PCR試劑及方法逆轉錄試劑盒購自TaKaRa公司，稱取等量組織或血清，加入同等比例的Trizol，12 000 r/min，4 ℃離心10 min；吸取上清液至一新的EP管中，靜置5 min，使之充分裂解；加入200 μL氯仿，劇烈震蕩15 s，然后放置3 min；12 000 r/min，4 ℃離心15 min，離心完后分為3層，取最上層(中間一層為蛋白)至一新的EP管中，加入等體積異丙醇，顛倒數次，室溫沉淀10 min；12 000 r/min，4 ℃離心10 min，棄上清液；加入75%乙醇(DEPC水溶解)，顛倒數次混勻；7 500 r/min，4 ℃ 5 min，棄上清液，小心吸盡液體(此時可以看到白色沉淀即為RNA)；RNA略干后加入20 μL DEPC水。用核酸染料法進行實時熒光定量PCR檢測miR-296在卵巢癌中的表達研究。引物序列為：miR-296，F-GCGAGCTACATTGTCTGCTGGGTT；R-GTCGAGGGTCCGAGGTATTCCG。U6，F-CGGCGGTAGCTTATCAGACTGATG；R-CCAGTCGAGGGTCCGAGGTATT。

1.2.2miRNA分子雜交方法采用(Ambion公司)小分子分離試劑盒分理處小分子RNA，將提取完的小分子RNA進行Cy3標記，進而與miRNA芯片進行雜交反應，miRNA芯片購自于Affymetrix Human Geome公司。

1.2.3穩定轉染過表達的miR-296的卵巢癌細胞株

將處于對數期的SKOV3(購自于ATCC)種于六孔板中，保證每孔細胞量為3×105～8×105，lipo2000加入5 μl用100 μl無血清培養基混勻，靜置5 min，同時高表達的miR-296的質粒12 μl于100 μl無血清的培養基中混勻，5 min后兩者混勻20 min，然后加入1 800 μl的無血清培養基，48 h后提取RNA進行檢測。過表達miR-296序列合成于廣州銳博生物公司。

1.3統計學處理

用SPSS 11.0統計軟件包處理，統計學方法采用t檢驗，Pearson相關分析，χ2檢驗，P<0.05為差異具有統計學意義。

2結果

2.1標本中RNA質量檢測

在RNA檢測中會經常出現RNA降解，所以在進行microRNA檢測前我們進行RNA純度的檢測，其檢測方法是RNA凝膠電泳檢測，采取28 s和18 s的比例，28 s和18 s是真核生物rRNA(核糖體RNA)的2個主要亞基，在體內含量較多。28 s/18 s即為衡量提取的RNA完整性的指標，如果28 s/18 s為1.8～2.0表明所提取RNA完整性較好，基本無降解發生。電泳條帶上應是28 s在上，18 s在下，且亮度為28 s是18 s的2倍。結果見圖1。

圖1　RNA凝膠電泳檢測結果

2.2miR-296在卵巢癌中的表達

在22例卵巢癌患者和22例正常卵巢患者中檢測miR-296的表達，在提取RNA后進行實時熒光定量PCR檢測后，用U6作為內參，將2組miR-296的表達內參化后進行統計分析，發現在卵巢癌組織中miR-296高表達，與正常卵巢組織比較，表達存在明顯差異，P<0.001，見圖2。

圖2　miR-296在卵巢癌組織中的表達

2.3在卵巢癌中miR-296靶基因檢測

在我們的研究中發現我們所提取的RNA純度較高，且未出現降解等情況。SKOV3是臨床上經常用于科學研究的卵巢癌細胞株，在我們轉染高表達的miR-296后，檢測其下游的靶基因。在我們的檢測中發現，microRNA143和microRNA215在miR-296轉染組中高表達，microRNA96、microRNA551b、microRNA502-3p在轉染組中低表達。見圖3。

中間線表示理想回歸線，上下線表示理想預測的1個對數單位

3討論

卵巢癌是1種高度惡性的腫瘤，其發病機理也比較復雜。基因的表達異常產生了腫瘤，MicroRNA在卵巢癌中的研究越來越多，也越來越深入，在卵巢癌初期miRNA的篩查中發現很多基因表達異常，許多已經被廣大研究者公認為抑癌基因，當然也有很多基因被認為是促癌基因。有越來越多的microRNA被用來作為腫瘤標記物應用到臨床研究上[9]。miR-296早期被用來抗血管生成的研究，其主要是通過影響細胞極性進而改變細胞運動狀態，如影響極性蛋白scrib。有研究報道，當miR-296過表達時會增加腫瘤細胞的遷移和浸潤[10]。

但是關于miR-296的靶基因研究還未見過多報道，特別是在卵巢癌中的研究。有研究報道miR-296可以調控VEGFR2和PDGFRβ信號通路進而影響前列腺癌的腫瘤進程，這一研究主要集中在通過miR-296的表達進而影響血管的生成，達到影響腫瘤[11-12]。卵巢癌的致死率也逐漸引起廣大醫療科研工作者的重視，但是調控卵巢癌的發生發展的分子機制也相當復雜，所以尋找一個好的基因靶點顯得尤為重要。

在前人的研究中已經有學者報道miR-296與腫瘤之間的關系，但是卵巢癌中的研究還未見報道。在我們的研究中發現在 RNA純度等多方面均完好的情況下miR-296在卵巢癌中高表達，且存在明顯差異。當我們轉染高表達的miR-296的卵巢癌細胞系時，發現microRNA143和microRNA215在轉染組中高表達，microRNA96、microRNA551b、microRNA502-3p低表達。這些基因的表達差異是我們研究的創新點，據我們的實驗觀察可得出，這些微小RNA有可能作為卵巢癌診斷分子標記物。

參考文獻

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(編輯：甘艷)

Expression of miR-296 in Ovarian Cancer and Prediction of Its Target Gene Research

QUANXiaozhen,LANYanli.

XiangyangCentralHospitalAffiliatedtoHubeiUniversityofArtsandScience,Xiangyang，441021

【Abstract】ObjectiveTo observe the expression of miR-296 expression in ovarian cancer and prediction of its target gene research.MethodsCollect our oncology patient samples 22 cases of ovarian cancer tissues,and 22 cases of normal tissues were collected.After testing the purity of RNA,we screen the expression of miR-296,in ovarian cancer were detected,and test the target gene were tested after transferred with high miR-296 by genechip technology.ResultsWe found that the miR-296 had high expression in ovarian cancer,and compared with the control had statistical significance normal,P<0.001.When transferred with high miR-296 in ovarian cancer cell lines(SKOV3),we found that that microRNA143 and microRNA215 were upregulated in the group with high expression miR-296,and microRNA96、microRNA551b and microRNA502-3p were down-regulated expression.ConclusionThe miR-296 are highly expressed in ovarian cancer,and the potential target gene may as ovarian cancer molecular marker in clinic.

【Key words】miR-296;Ovarian cancer;Target gene

通訊作者：蘭艷麗

DOI：10.3969/j.issn.1001-5930.2016.05.009

中圖分類號：R737.31

文獻標識碼：A

文章編號：1001-5930(2016)05-0727-03

(收稿日期2015-07-21修回日期 2015-12-10)