全反式維甲酸對5/6腎大部切除大鼠腎間質纖維化的影響及其作用機制

劉　霞　馬紅萍

(1南通大學醫(yī)學院病理生理學系,2機能實驗室　南通　226001)

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全反式維甲酸對5/6腎大部切除大鼠腎間質纖維化的影響及其作用機制

劉霞1馬紅萍2△

(1南通大學醫(yī)學院病理生理學系,2機能實驗室南通226001)

【摘要】目的探討全反式維甲酸 (all-trans retinoic acid,atRA)對5/6腎大部切除 (5/6 nephrectomy,5/6Nx) 大鼠腎小管間質纖維化的作用及其機制。方法成年雄性SD 大鼠行5/6Nx后2周分為3組:5/6Nx組 (大豆油1 mL·kg-1·d-1,n=11)、 atRA1 組 (atRA 5 mg·kg-1·d-1,n=10)、atRA2組 (atRA 10 mg·kg-1·d-1,n=11),另設Sham組即假手術組 (大豆油1 mL·kg-1·d-1,n=7)。經灌胃給藥,每日1次,連續(xù)給藥12 周。測定24 h尿蛋白量和血肌酐濃度;腎臟病理切片采用VG染色,對腎小管間質纖維化進行評分;用Western blot檢測腎皮質中α平滑肌肌動蛋白 (α-smooth muscle actin,α-SMA)和纖溶酶原激活物抑制劑1 (plasminogen activator inhibitor-1,PAI-1)的蛋白表達。結果術后14 周,atRA顯著降低5/6Nx大鼠的24 h尿蛋白量和血肌酐濃度 (P均<0.05)。atRA顯著降低該模型的腎小管間質纖維化 (P<0.01)。atRA顯著下調該模型的腎皮質α-SMA和PAI-1表達 (P均<0.05),腎小管間質纖維化評分與α-SMA和PAI-1表達均呈顯著正相關 (r分別為0.717 6和0.809 8,P均<0.01)。結論atRA可減少5/6Nx大鼠的尿蛋白水平,抑制腎皮質α-SMA和PAI-1的蛋白表達,從而減輕腎間質纖維化。

【關鍵詞】維甲酸;腎切除術;腎小管間質纖維化;α平滑肌肌動蛋白;纖溶酶原激活物抑制劑1

*This work was supported by the General Program of College Natural Science Research Foundation of Jiangsu Province (11KJD310001) and the Application Research Project of Nantong City (BK2014035).

腎小管間質纖維化是多種腎臟疾病進展至終末期腎功能衰竭的共同通路[1],其病理特征是細胞外基質成分 (extracellular matrix,ECM)過多沉積于腎小管間質。ECM積聚是由ECM合成增多和/或ECM降解減少引起。α-平滑肌肌動蛋白 (α-smooth muscle actin,α-SMA)是肌成纖維細胞的標志性蛋白,當腎小管上皮細胞和間質成纖維細胞表達α-SMA時,肌成纖維細胞特征而大量合成分泌ECM[2]。 纖溶酶原激活物抑制劑 1 (plasminogen activator inhibitor-1,PAI-1)是纖溶酶原激活物 (plasminogen activator,PA)的抑制劑,通過抑制PA對纖溶酶原的激活,抑制ECM降解,促進ECM積聚[3]。研究表明PAI-1參與了腎纖維化的發(fā)生和發(fā)展[4]。維甲酸是維生素A的衍生物,包括全反式維甲酸 (all-trans retinoic acid,atRA),9-順式維甲酸和13-順式維甲酸。維甲酸具有抗增生和抗炎癥作用,能抑制腎纖維化,保護腎結構和功能[5-10],但其抗纖維化機制有待進一步研究。本研究以大鼠5/6腎大部切除(5/6 nephrectomy,5/6Nx)為模型,觀察atRA對腎功能、腎小管間質纖維化及腎臟α-SMA和PAI-1表達的影響,并進一步探討atRA 的腎保護作用機制。

材 料 和 方 法

主要試劑atRA購自上海市第六制藥有限公司,抗α-SMA抗體購自美國Sigma公司,抗PAI-1抗體購自美國BD公司,抗β-actin 抗體購自美國Santa Cruz公司,化學發(fā)光試劑盒購自美國Pierce公司。

大鼠5/6Nx模型的建立雄性SD大鼠(250～330 g)購自上海中科院實驗動物中心。術前腹腔注射30%水合氯醛 (300 mg/kg)麻醉,經背部左側切口暴露左腎,分離腎動脈左上支和中支并結扎,使左腎梗死約2/3,同時摘除右腎。假手術組(Sham組)大鼠僅分離左腎動脈分支,不予結扎,摘除右腎。

動物分組及給藥術后2周,根據血肌酐水平的升高確定造模成功后將大鼠分成3組:5/6Nx模型組(n=11)用大豆油1 mL·kg-1·d-1灌胃;低劑量 atRA 組 (atRA1,n=10)用atRA 5 mg·kg-1·d-1灌胃;高劑量atRA 組 (atRA2,n=11)用atRA 10 mg·kg-1·d-1灌胃。另設Sham組(n=7)用大豆油1 mL·kg-1·d-1灌胃。避光條件下每天新鮮配制atRA的豆油懸浮液。術后2周起開始喂藥,連續(xù)給藥12周。 Lv等[11]報道，5和10 mg·kg-1·d-1的atRA能顯著緩解自發(fā)性高血壓大鼠的心肌纖維化,幾乎無毒性作用;而30～60 mg·kg-1·d-1的atRA具有顯著降低大鼠體重等不良反應,故本研究選用5和10 mg·kg-1·d-1這兩個atRA劑量。

腎功能檢測將每只大鼠單獨地放在代謝籠中,留取24 h尿并量取總體積,在此期間大鼠自由飲水、進食。24 h后取尾血,采用自動生化測定儀測定血肌酐濃度和尿蛋白濃度,計算24 h尿蛋白總量。

腎小管間質纖維化評分取腎臟組織矢狀切面約2 mm,常規(guī)石蠟包埋,切片厚度為4μm,VG染色。顯微鏡下高倍視野 (×400)拍照,每只大鼠選擇至少20個高倍視野,采用CellSens Dimension軟件 (日本Olympus公司)測定腎小管間質纖維化面積占總面積的百分比,作為腎小管間質纖維化評分。

Western blot檢測腎皮質α-SMA和PAI-1的蛋白表達水平腎皮質組織于液氮中速凍,然后轉存于-80 ℃冰箱。取腎皮質100 mg,加入1 mL組織裂解液,于冰水中勻漿。4 ℃下12 000×g離心10 min,取上清,用BCA法測定蛋白濃度。 取30μg總蛋白,加入相應量的5×SDS凝膠加樣緩沖液,制備1×SDS緩沖液,進行SDS-PAGE蛋白電泳,濕轉至PVDF膜上。將轉印上蛋白的PVDF膜置于5%脫脂奶粉中室溫封閉2 h。然后置于一抗工作液中,4 ℃過夜。洗膜,接著加入相應的辣根過氧化酶標記的二抗,室溫放置1 h。洗膜,加入化學發(fā)光試劑作用5 min,將PVDF膜置于暗盒中,X光片感光。用Smart viewer 軟件 (上海復日科技公司)對蛋白條帶進行定量。

結果

atRA對5/6Nx大鼠24h尿蛋白量的作用4組術前24h尿蛋白量的差異無統(tǒng)計學意義 (圖1)。 術后14 周,5/6Nx組的24h尿蛋白量顯著高于Sham組 (P<0.01)。與 5/6Nx組比較,atRA1組和atRA2組的24h尿蛋白量顯著下降 (P<0.05)。atRA1組的尿蛋白水平比較atRA2組更低,但差異無統(tǒng)計學意義。

atRA對5/6Nx大鼠血肌酐濃度的作用4組術前血肌酐濃度的差異無統(tǒng)計學意義(圖2)。術后14周,5/6Nx組的血肌酐濃度顯著高于Sham組 (P<0.01)。與 5/6Nx組比較,atRA1組和atRA2組的血肌酐濃度顯著下降 (P<0.05)。atRA1組的血肌酐濃度較atRA2組更低,但差異無統(tǒng)計學意義。

atRA對5/6Nx大鼠腎小管間質纖維化的作用腎組織切片VG染色(圖3)顯示:5/6Nx組腎小管間質纖維化評分顯著高于Sham組(P<0.01)。與5/6Nx組比較,atRA1組和atRA2組的腎小管間質纖維化評分顯著下降 (P<0.01),但無劑量依賴性。

圖1atRA對5/6Nx大鼠尿蛋白的作用

Fig1EffectofatRAonurinaryalbuminexcretionintheratswith5/6Nx

圖2atRA對5/6腎大部切除大鼠血肌酐濃度的作用

Fig2EffectofatRAonserumcreatinineintheratswith5/6Nx

atRA對5/6Nx大鼠腎皮質α-SMA和PAI-1蛋白表達的作用5/6Nx組腎皮質α-SMA和PAI-1蛋白表達顯著高于Sham組 (P均<0.05,圖4)。 與5/6Nx組比較,atRA1組和atRA2組的腎皮質α-SMA和PAI-1蛋白表達顯著下降 (P均<0.05),且呈現劑量依賴性,atRA2組腎皮質α-SMA和PAI-1蛋白表達較atRA1組下降更明顯 (P均<0.05)。腎小管間質纖維化評分與α-SMA和PAI-1蛋白表達均呈顯著正相關 (r分別為0.717 6和0.809 8,P均<0.01,圖5)。

圖3atRA對5/6Nx大鼠腎小管間質纖維化的作用

Fig3EffectofatRAonrenaltubulointerstitialfibrosisintheratswith5/6Nx

討論

腎小管間質纖維化是腎衰竭的主要病理基礎,腎小管間質損害比腎小球病變更能反映腎臟疾病的預后[12]。本研究以5/6Nx大鼠為模型,并用atRA處理,atRA能降低該模型的腎小管間質纖維化程度,與其降低24 h尿蛋白量和下調腎皮質α-SMA和PAI-1蛋白表達有關。

蛋白尿是腎臟濾過屏障功能障礙的重要特征。腎小球足細胞是腎臟濾過屏障的主要成分,其足突和裂孔膜是防止血漿白蛋白濾過的最后一道關鍵屏障。大多數的蛋白尿疾病與腎小球足細胞的足突消失和/或裂孔膜的破壞有關。原尿中大量蛋白逸出至腎小管管腔,引起腎小管間質損傷和纖維化[13],所以蛋白尿不僅是反映腎功能損傷的指標,也是導致腎疾病進展的直接病理因素。atRA能顯著降低5/6Nx大鼠的24 h尿蛋白水平。atRA在體內和體外均能上調足細胞的裂孔膜相關蛋白podocin和nephrin的表達,從而發(fā)揮抗蛋白尿作用[7-8]。因為蛋白尿是腎臟疾病進展的一個危險因素,所以atRA的抗蛋白尿作用是其改善腎小管間質纖維化的機制之一。

圖4atRA對5/6Nx大鼠腎皮質α-SMA和PAI-1表達的作用

Fig4EffectsofatRAonα-SMAandPAI-1expressionsintherenalcortexofratswith5/6Nx

纖維化是由ECM合成過多和/或降解減少從而ECM過多沉積造成的。正常腎臟中α-SMA的表達僅見于腎臟血管中層的平滑肌細胞。若腎小管上皮細胞、間質成纖維細胞和腎小球系膜細胞表達α-SMA,則標志著它們被激活,獲得了肌成纖維細胞特征,增殖活躍且ECM合成分泌顯著增加[2]。我們觀察到5/6Nx組腎皮質α-SMA蛋白水平顯著高于Sham組,atRA能顯著降低α-SMA蛋白表達;腎小管間質纖維化程度與α-SMA表達呈顯著正相關。 5/6Nx大鼠模型中除發(fā)生腎小管間質纖維化外,腎小球硬化也存在,所以該模型腎臟中增加的α-SMA不僅來源于腎小管上皮細胞和間質成纖維細胞,也來源于腎小球系膜細胞。atRA對腎小管間質和腎小球中α-SMA表達的影響可通過免疫組化來區(qū)分。atRA可通過直接抑制肌成纖維細胞的α-SMA表達來改善腎小管間質纖維化。肌成纖維細胞增殖活躍,atRA具有抗增殖特性,所以atRA可能通過抑制肌成纖維細胞的增殖來降低α-SMA表達,從而降低ECM合成。atRA也可能通過抑制單個肌成纖維細胞的α-SMA表達,從而抑制單個細胞水平上的ECM合成。 因為Wen等[14]觀察到atRA的一種同型異構體——9-順式維甲酸能抑制轉化生長因子β1誘導的腎系膜細胞α-SMA表達,而不影響細胞數目。

A:α-SMA (r=0.7176,P<0.01);B:PAI-1 (r=0.8098,P<0.01).

圖5腎小管間質纖維化評分與α-SMA和PAI-1表達的相關性

Fig 5Correlation between renal tubulointerstitial fibrosis score and α-SMA and PAI-1 expressions

纖維化不僅可由ECM合成增加造成,也可由ECM降解減少引起。ECM主要由基質金屬蛋白酶 (matrix metalloproteinases,MMPs)和纖溶酶來降解[3]。纖溶酶可直接降解ECM,也可通過活化MMP來降解ECM。PAI-1作為組織型纖溶酶原激活物 (tissue-type plasminogen activator,tPA)和尿激酶型纖溶酶原激活物 (urokinase-type plasminogen activator,uPA)的抑制劑,抑制PA對纖溶酶原的激活,從而抑制ECM降解,促進ECM積聚。正常腎組織中PAI-1表達很低;腎損傷時其表達顯著增高[4]。過表達PAI-1的小鼠器官纖維化比野生型小鼠嚴重[15-16],而PAI-1基因敲除后器官纖維化減輕[15,17-18]。我們觀察到,與Sham組比較,5/6Nx組腎皮質PAI-1表達增加,atRA顯著下調PAI-1表達;腎小管間質纖維化程度與PAI-1表達呈顯著正相關,提示atRA可通過減少PAI-1表達降解ECM,從而緩解腎小管間質纖維化。 atRA可直接抑制肌成纖維細胞的PAI-1表達,我們曾報道atRA能直接抑制轉化生長因子β1和血管緊張素Ⅱ誘導的體外培養(yǎng)的腎系膜細胞PAI-1和ECM表達纖維連接蛋白[19]。

atRA對5/6Nx大鼠腎皮質α-SMA和PAI-1表達的抑制作用呈現劑量依賴性;而在降低尿蛋白和血肌酐的作用方面,5 mg·kg-1·d-1atRA比10 mg·kg-1·d-1atRA更具優(yōu)勢,這可能是由較高劑量atRA的毒性作用和不良反應引起的,包括高脂血癥和肝功能損害等[20],具有劑量依賴性。本研究選用較低劑量的atRA(5和10 mg·kg-1·d-1),在保證有效的同時盡量減少毒性作用和不良反應,但10 mg·kg-1·d-1的atRA仍能輕微升高血中三酰甘油水平,而5 mg·kg-1·d-1的atRA則無此不良反應[11]。本研究中2個劑量的atRA對腎間質纖維化的抑制作用未表現出劑量依賴性,這可能是由于較高劑量atRA的非特異性不良反應削弱了其特異性腎保護作用。

綜上所述,atRA能有效降低5/6Nx大鼠的尿蛋白水平,能有效抑制腎皮質α-SMA和PAI-1表達,減少ECM合成,同時促進ECM降解,從而改善腎小管間質纖維化和腎功能。

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Effect of all-trans retinoic acid on renal tubulointerstitial fibrosisin the rats with 5/6 nephrectomy and its mechanisms

LIU Xia1, MA Hong-ping2△

(1DepartmentofPathophysiology,2FunctionalLaboratory,MedicalSchoolofNantongUniversity,Nantong226001,JiangsuProvince,China)

【Abstract】ObjectiveTo investigate the effect of all-trans retinoic acid (atRA) on renal tubulointerstitial fibrosis in the rats with 5/6 nephrectomy and the involved mechanisms.MethodsAdult male SD rats underwent 5/6 nephrectomy (5/6Nx).Two weeks later,nephrectomized rats were divided into 3 groups:5/6Nx group (soybean oil of 1 mL·kg-1·d-1,n=11),atRA1 group (atRA of 5 mg·kg-1·d-1,n=10) and atRA2 group (atRA of 10 mg·kg-1·d-1,n=11).Sham group (soybean oil,1 mL·kg-1·d-1,n=7) served as a nomal control.Rats were treated by intragastric gavage once a day for 12 weeks. Serum creatinine concentration and 24 hours urinary albumin excretion were measured.The renal tubulointerstitial fibrosis was scored on renal sections with VG staining.The expression levels of α-smooth muscle actin (α-SMA) and plasminogen activator inhibitor-1 (PAI-1) in renal cortex were examined by Western blot.ResultsTreatment of atRA decreased the elevated levels of urinary albumin excretion and serum creatinine concentration in 5/6 nephrectomized rats at 14 weeks after operation (all P<0.05).Renal tubulointerstitial fibrosis score in rats with 5/6 nephrectomy was markedly decreased after atRA administration (P<0.01).The increases in expressions of α-SMA and PAI-1 in renal cortex in rats with 5/6 nephrectomy were significantly downregulated by atRA treatment (all P<0.05).Renal tubulointerstitial fibrosis score correlated well with the expression of α-SMA (r=0.7176,P<0.01) or with that of PAI-1 (r=0.8098,P<0.01).ConclusionsTreatment with atRA ameliorates renal tubulointerstitial fibrosis in rats with 5/6 nephrectomy by decreasing both proteinuria and protein expressions of α-SMA and PAI-1 in renal cortex.【Key words】retinoic acid;nephrectomy;renal tubulointerstitial fibrosis;α-smooth muscle actin;plasminogen activator inhibitor-1

【中圖分類號】Q 491.1

【文獻標識碼】A

doi:10.3969/j.issn.1672-8467.2016.01.005

(收稿日期:2015-04-20;編輯:段佳)

江蘇省高校自然科學研究面上項目 (11KJD310001);南通市應用研究計劃 (BK2014035)

△Corresponding authorE-mail:mahp@ntu.edu.cn