鈦合金表面納米氧化鋅薄膜的體外細胞毒性研究*

劉冠花，王金清，邱宜農

［1.蘭州軍區蘭州總醫院口腔科，甘肅蘭州730050；2.中國科學院蘭州化學物理研究所（固體潤滑國家重點實驗室），甘肅蘭州730000］

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鈦合金表面納米氧化鋅薄膜的體外細胞毒性研究*

劉冠花1，王金清2，邱宜農1

［1.蘭州軍區蘭州總醫院口腔科，甘肅蘭州730050；2.中國科學院蘭州化學物理研究所（固體潤滑國家重點實驗室），甘肅蘭州730000］

摘要：目的評價鈦合金表面納米氧化鋅薄膜對細胞毒性的作用。方法觀察小鼠胚胎成纖維L-929細胞在含納米氧化鋅薄膜的鈦合金析出液中的生長情況，采用噻唑藍比色法測定各組細胞的吸光度值，并計算出相對的細胞增殖率，進行細胞毒性評價。結果各組細胞生長狀況良好，細胞形態無異常，增值率＞80%，細胞毒性等級為1級。結論鈦合金表面納米氧化鋅薄膜對細胞生長無毒害作用。

關鍵詞：鈦合金；納米氧化鋅；細胞毒性；噻唑藍比色法；生物相容性

種植技術是修復牙列缺損、缺失的重要方法，在臨床上應用越來越廣泛。種植體周圍炎是種植修復的主要并發癥之一，是導致種植失敗的主要原因［1］，源于種植體基臺與牙齦袖口間的細菌感染。減少基臺周圍細菌定植及繁殖成為防治種植體周圍炎的關鍵。種植體基臺的主要材料為鈦或鈦合金，其本身不具有抗菌性。前期筆者通過溶膠-凝膠法在種植體基臺表面構建一層納米氧化鋅抗菌膜［2］，起到良好的抗菌殺菌作用。本實驗旨在評價納米氧化鋅涂層對細胞的毒性作用。

1　材料與方法

1.1試劑和儀器

小鼠胚胎成纖維L-929細胞，由中國科學院昆明細胞庫提供，達爾伯克必需基本培養基（dulbecco's minimum essential medium，DMEM）及小牛血清均購自美國Gibco公司，雙抗噻唑藍（美國Amresco公司），二甲基亞砜（Dimethylsulphoxide，DMSO）（美國Amresco公司），0.25%胰酶消化液。酶聯免疫檢測儀（瑞士Tecan公司），生物安全柜（HFsafe-1200，上海力申科學儀器有限公司），氣體培養箱（HF160W，上海力申科學儀器有限公司），Olympus IX-71倒置相差顯微鏡（日本Olympus公司），96孔細胞培養板（美國Coster公司）。

1.2實驗方法

1.2.1浸提液的制備參照試件表面積與浸提介質體積之比為0.5～6.0 cm2/ml，按1.0 cm2/ml的浸提比例將高溫高壓消毒后的實驗組鈦片（表面含納米氧化鋅涂層）和陰性對照組鈦片（表面不含涂層）分別浸泡在含10%小牛血清的DMEM培養液中，在37℃培養箱內放置24 h后制成各組材料的浸提液，放入4℃冰箱保存［3］。

1.2.2細胞培養生長旺盛的L-929細胞傳代48h，制成1×105個/ml細胞懸液，分注于3個96孔培養板，每孔100μl，每一板設3組（實驗組、陰性對照組和空白對照組），每一組接種8孔，置于培養箱內（37℃，體積分數為5%二氧化碳CO2）培養。24 h后細胞貼壁生長良好時，棄去原培養液，用磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffer saline，PBS）洗滌2次，實驗組每孔分別加入100μl的含納米氧化鋅涂層的鈦片浸提液，陰性對照組每孔分別加入100μl不含涂層的鈦片浸提液，空白對照組每孔分別加入100μl新鮮培養液。繼續置于細胞培養箱內培養。

1.2.3細胞形態觀察及噻唑藍比色法檢測3個96孔板分別培養24、48和72 h后終止培養，終止培養前均在倒置顯微鏡下觀察各組細胞形態變化和生長狀況并攝影，然后每孔加入5 g/L噻唑藍溶液20μl，繼續置于細胞培養箱內培養4 h后，吸棄原液，每孔加入DMSO 150μl，置于振蕩器上振蕩10 min，使用酶聯免疫檢測儀在波長490 nm處測定各孔的吸光度值（A490）。

1.2.4細胞毒性評價細胞相對增殖率（the relative growth rate，RGR）的計算公式［4］：RGR=實驗組A值/陰性對照組A值/空白對照組A值。美國藥典中細胞相對增殖率與細胞毒性分級如下［5］：0級為RGR≥100%；1級為RGR 80%～100%；2級為RGR 50%～80%；3級RGR為30%～50%；4級為RGR 0%～30%。當RGR≥80%，即毒性級別≤1級時，樣品對細胞的增殖無毒害作用；反之，對細胞的增殖有毒害作用。

1.3統計學方法

采用SPSS 17.0統計軟件進行數據分析，各組吸光度值（A值）用均數±標準差（±s）表示，每個時間段各組組間比較及各組3個時間點A值比較用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統計學意義。根據細胞毒性計算公式和分級標準直接計算并評價其對細胞的毒性。

2　結果

2.1培養72 h細胞形態

可見各組細胞形態基本相似，呈梭性或多角形，部分圓形細胞的細胞核處于分裂期，表明細胞生長旺盛。見圖1。

2.2各組A值與細胞毒性

2.2.1各組同一時間A值比較分別培養24、48、72 h后，各組間A值比較，差異無統計學意義（F值分別為0.211、8.089和1.509，P值分別為0.811、0.067和0.244）（見表1），提示每個時間段各組細胞生長增殖比較，差異無統計學意義。

2.2.2各組3個時間段A值比較實驗組、陰性對照組、空白對照組3個時間段的A值比較，經方差分析，差異有統計學意義（F值分別380.171、625.354 和194.550，P值分別為0.000、0.000和0.002）。各組3個時間段的A值均呈線性關系（P=0.002），各組A值均隨著時間的延長而逐漸增大。見表1。

圖1　各組細胞培養72 h形態圖（×100）

表1　各組3個時間段的A值（n=8，±s）

表1　各組3個時間段的A值（n=8，±s）

組別　24 h　48 h　72 h實驗組　0.181±0.045　 0.409±0.065　 0.882±0.102陰性對照組　0.195±0.080　 0.428±0.075　 0.837±0.073空白對照組　0.201±0.106　 0.470±0.083　 0.934±0.111

2.2.3細胞增殖率和細胞毒性級別比較細胞的相對增殖率均＞80%，細胞毒性級別是1級（見表2），表明細胞生長沒有受到抑制，鈦片表面納米氧化鋅涂層具有良好的細胞相容性。

表2　各組材料的細胞相對增殖率和細胞毒性級別

3　討論

氧化鋅是一種無機抗菌劑，作為添加成分主要應用于皮膚科外用藥、日用化妝品、水消毒及紡織品防腐等方面［6-7］。納米氧化鋅與細菌微生物產生更廣泛的接觸面積［8］，其抗菌性能遠大于傳統的氧化鋅殺菌劑［9］，具有安全性高、效力持久和不易耐藥的特點［10］。

細胞毒性試驗是口腔新型材料生物相容性研究中重要的檢測指標之一。噻唑藍比色法是一種檢測體外培養細胞生長存活的方法，酶聯免疫比色分析法測定的吸光度值的大小可反映存活細胞數量的多少及細胞代謝活性的強弱，因而吸光度值降低程度即可反映材料析出液的細胞毒性大小［11-12］，由于該法簡便、靈敏、結果客觀且重復性好，廣泛用于細胞毒性檢測。

本研究結果顯示納米氧化鋅薄膜組細胞生長狀態良好，可見圓形分裂期細胞，細胞增殖率＞80%，細胞毒性是1級，對細胞的增殖無毒害作用，利于細胞分化及功能表達，達到良好的鈦合金-組織界面［13］。但畢竟體外實驗條件與真實人體口腔環境有較大差異，納米氧化鋅涂層能否應用于臨床，還需要進一步的生物學和動物學實驗研究證實。

參考文獻：

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（申海菊 編輯）

In vitro cytotoxicity study of nano-ZnO thin film on surface of titanium alloy*

Guan-hua Liu1，Jin-qing Wang2，Yi-nong Qiu1
［1. Department of Stomatology，Lanzhou General Hospital of Lanzhou Military Command of PLA，Lanzhou，Gansu 730050，China；2. Lanzhou Institute of Chemical Physics （State Key Laboratory of Solid Lubrication），Chinese Academy of Sciences，Lanzhou，Gansu 730000，China］

Abstract:Objective To evaluate the cytotoxicity of nano-ZnO thin film on titanium alloy. Methods The growth of L-929 cells in the culture solutions consisting of the ions released from nano-ZnO thin film on the surface of titanium alloy was observed. And the absorbance values of the cells were tested by MTT method. The relative growth rate of L-929 cells was calculated and the cytotoxicity of nano-ZnO thin film on the surface of titanium alloy was evaluated. Results The relative growth rate of each L-929 cell group was above 80%and the cytotoxicity grade was grade 1. Conclusions Nano-ZnO thin film on the surface of titanium alloy has almost no cytotoxicity.

Keywords:titanium alloy；nano-ZnO；cytotoxicity；MTT method；biocompatibility

中圖分類號：R783.1

文獻標識碼：A

DOI:10.3969/j.issn.1005-8982.2016.07.001

文章編號：1005-8982（2016）07-0001-03

收稿日期：2015-10-30

*基金項目：中國科學院蘭州化學物理研究所固體潤滑國家重點實驗室開放課題（No：LSL-1309）

［通信作者］邱宜農，E-mail：yinongqiu@hotmail.com；Tel：0931-899469