從PI3k/Akt通路研究山茱萸對大鼠心肌缺血再灌注損傷的作用機制*

劉彩容陳克芳黃啟輝

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從PI3k/Akt通路研究山茱萸對大鼠心肌缺血再灌注損傷的作用機制*

劉彩容①陳克芳②黃啟輝②

【摘要】目的：了解山茱萸對大鼠心肌缺血再灌注的保護作用機制。方法：選取84只雄性Wistar大鼠，按隨機數字表法分三組，分別為對照組、缺血再灌注組（I/R組）和治療組，每組28只。采用結扎大鼠冠狀動脈左前降支法制備大鼠心肌缺血再灌注損傷模型，對照組在左冠狀動脈前降支處僅穿線不結扎，I/R組在再灌注前5 min時尾靜脈注射0.9%氯化鈉注射液1 mL，治療組在再灌注前5 min時尾靜脈注射山茱萸藥液1 mL，觀察記錄各組大鼠心肌缺血情況和心電圖信息。結果：與對照組比較，I/R組及治療組大鼠FS和EF均降低，LVDd、LVESV、LVEDV均上升；與I/R組比較，治療組FS和EF均上升，LVDd、LVESV、LVEDV均下降，差異均有統計學意義（P＜0.05）。結論：山茱萸及其有效成分通過PI3K/Akt通路，對大鼠心肌缺血再灌注損傷保護機制的實現起到了十分重要的作用。

【關鍵詞】山茱萸； 心肌缺血； 再灌注損傷； PI3k/Akt通路

①廣州市白云區第三人民醫院 廣東 廣州 510000

②中山大學孫逸仙紀念醫院

First-author’s address：The Third People’s Hospital of Baiyun，Guangzhou 510000，China

心肌缺血再灌注損傷（MIRI）對于人體健康的恢復以及相關治療活動的開展有著極大的阻礙作用，相關醫療機構必須加強對其的重視，積極的采取措施對其進行研究，從而最大程度的避免心肌缺血再灌注損傷的產生。本文就以PI3k/Akt通路研究為基礎對山茱萸對大鼠心肌缺血再灌注損傷的作用機制進行分析與探討。

1　材料與方法

1.1實驗材料 選擇24～25周齡的84只雄性Wistar大鼠為研究對象，體重均220～250 g，本次實驗大鼠的提供機構均為中山大學實驗動物中心。將84只雄性Wistar大鼠按隨機數字表法分為正常對照組，缺血再灌注組（I/R組）以及治療組，每組各為28只。

1.2方法

1.2.1心肌缺血再灌注損傷模型制備方法 在進行實驗之前所有大鼠均采取禁食處理，禁食時間為8 h左右，期間保障自由飲水［1］。實驗時以20%的氨基甲酸乙醋對大鼠進行腹腔注射麻醉［2］，仰臥位固定大鼠四肢，并于四肢皮下插入心電儀電極，對大鼠心電圖的信息進行觀察與記錄。同時對大鼠進行氣管插管手術，切開頸部氣管，插入導管后進行固定，導管對連接動物呼吸機，通氣量8 mL/kg［3］。在實驗過程中對大鼠的正常呼吸進行維護，呼吸頻率控制在60～70次/min即可。暴露大鼠心臟，即在心臟脈動最明顯的部位打開胸腔，剪開心包，繼而讓心臟完成暴露［4］。選擇左冠狀靜脈為標志物進行縫合，縫合針的型號為7-0無創代針，縫合位置為左心耳根部下方2 mm處，在進行縫合處理時要對大鼠的心電圖進行密切關注，當心電圖保持穩定10 min后再對左冠狀動脈降支進行活結結扎，從而造成心肌缺血［5］。缺血的判定標準為前降支動脈供血區呈現出蒼白色或者青紫色，心電圖ST-T融合表現為太高狀態。大鼠被缺血30 min后，松開線繩進行冠脈行再灌注，時間為2 h，完成心肌缺血再灌注損傷模型。對照組在左冠狀動脈前降支處進行穿線，不結扎；I/R組在再灌注前5 min時尾靜脈注射0.9%氯化鈉注射液1 mL；治療組在再灌注前5 min時尾靜脈注射山茱萸藥液1 mL。

1.2.2中藥給藥量的確定 本次實驗中大鼠山茱萸的給藥量遵循中藥藥理實驗的相關指導，大鼠的低等用藥量一般情況下均為單位體重人用藥量的10倍，中等用藥量為單位體重人用藥量的20倍，高等用藥量為單位體重人用藥量的40倍，本次研究中的山茱萸多糖及總苷的人用藥量即在此基礎上結合中藥提純率相應計算得出［6］。

1.2.3大鼠血清CK-MB和LDH的測定方法 再灌注2 h后，采集大鼠腹部動脈血3 mL，所采集的血樣在4 ℃、4000 r/min下離心10 min，取上清液進行分裝，-80 ℃下保存。運用ELISA法對血清CK-MB以及LDH活性進行測定，為下一步研究的進行提供依據［7］。

1.3統計學處理 采用SPSS 17.0軟件對所得數據進行統計學分析，大鼠心機缺血及梗死面積百分率以［±D（x）］形式表示，計量資料以（±s）形式表示，行t檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1各組大鼠心肌梗死面積比較 三組大鼠心肌I/R后的缺血區面積比較差異無統計學意義（P＞0.05）；與對照組比較，I/R組和治療組大鼠心肌梗死區面積均有所增加，治療組梗死區面積低于I/R組，差異均有統計學意義（P＜0.05），見表1。

表1　各組大鼠心肌梗死面積比較［±D（x）］ %

表1　各組大鼠心肌梗死面積比較［±D（x）］ %

組別　缺血區面積　梗死區面積對照組（n=28）　45.65±2.34　26.80±4.76治療組（n=28）　46.23±1.89　43.54±2.38 I/R組（n=28）　47.22±2.65　45.66±2.87

2.2各組大鼠心肌I/R后心功能比較 與對照組比較，I/R組及治療組大鼠FS和EF均降低，LVDd、LVESV、LVEDV均上升，比較差異均有統計學意義（P＜0.05）；與I/R組比較，治療組FS和EF均上升，LVDd、LVESV、LVEDV均下降，比較差異有統計學意義（P＜0.05），見表2。

表2　各組大鼠I/R后超聲心動圖結果比較（±s）/［±D（x）］

表2　各組大鼠I/R后超聲心動圖結果比較（±s）/［±D（x）］

組別　LVDd（mm）　LVESV（mm）　LVEDV（mm）　FS（%）　EF（%）對照組（n=28）　5.45±0.18　0.04±0.11　0.30±0.03　58.8±1.42　91.8±1.11治療組（n=28）　5.96±0.43　0.13±0.03　0.45±0.04　41.3±1.45　85.6±5.32 I/R組（n=28）　6.64±0.26　0.20±0.04　0.60±0.04　21.3±1.95　64.5±4.41

3　討論

心肌缺血再灌注損傷是指患者出現心機缺血的狀況后，心肌血流得到恢復，使得心機結構，以及組織受到一定損害的現象。心肌缺血灌注損傷可能誘發患者出現心肌梗死，或者梗死面積擴大等不可逆損傷，這對于患者的健康與治療造成嚴重影響。因此，和其他心血管類疾病相比，心肌缺血再灌注損傷的病死率更高，相關醫療機構必須加強對心肌缺血再灌注損傷的重視［8-9］。心肌缺血灌注損傷之所以會發生，主要是因為在心肌缺血狀況下，患者體內所含有的氧自由基的數量在一定程度上被提升，并且細胞內鈣含量也呈現上升趨勢。此外，在心肌缺血的前提下，白細胞被激活的幾率被提升，釋放大量促炎細胞因子，進而增加血管的通透性。此外，過多的白細胞被激活，使得組織受到進一步損傷。動物以及細胞實驗顯示，中藥復方制劑以及中藥提取物在緩解心肌缺血灌注損傷方面效果顯著，這是因為中藥提取物或中藥復方制劑會對MIRI的多種因素造成影響，進而使得心肌細胞的存活率被提升，從而對缺血再灌注心肌進行保護。

本文研究結果顯示，I/R后的心功能方面，與對照組比較，I/R組與治療組大鼠的FS和EF均降低，LVDd、LVESV、LVEDV均上升，差異均有統計學意義（P＜0.05），與I/R組比較，治療組FS和EF均上升，LVDd、LVESV、LVEDV均下降，差異均有統計學意義（P＜0.05）。這主要歸咎于缺血再灌注損傷補救激酶信號通路，它主要由PI3K-蛋白激酶B以及ERK1/2組成，其中，PI3K-蛋白激酶B就是我們常說的Akt。相關研究證明，PI3K/Akt通路對于再灌注損傷保護作用的發揮有著極為重要的作用，主要體現在以下方面：首先，PI3K/Akt能夠阻止線粒體通透性轉換孔的開放，促進肌漿網實現對Ca2+的獲取。同時，PI3K/Akt通路的建立也能夠促進抗細胞凋亡途徑的恢復［10-11］。PI3K主要存在于細胞膜上，Akt通過PI3K的產物接觸細胞膜上的磷酸后呈現為被激活的狀態。在PI3K/Akt被激活的狀態下，實現向細胞核的轉運，并和相關部位的底物蛋白產生反應，進而把底物蛋白特定部位結構磷酸化，這主要是因為被硫酸化的物質有蘇氨酸以及特定部位的絲。被激活的Akt同時能夠讓細胞核，以及細胞質內的多種底物被磷酸化［12-13］。譬如，ENOS被磷酸化后會生成內源性的NO，這種NO能夠使得S6激酶呈現被激活狀態。又譬如，糖原被磷酸化后會促進激酶-3β的合成。此外，磷酸化過程的進行也能夠促進相關基因的表達以及糖原代謝等，這些活動能夠加強K+通道的開放，進而保護缺血再灌注損傷心肌。因此，Akt常常扮演的角色為網絡信號通路的調節器。相關學者研究還表明，被磷酸化的GSK-3β，能夠降低線粒體外膜腺甘酸轉移速度，進而調節VDAC磷酸化水平，抑制MPTP開放過程［14-15］。同時，PI3K/Akt能夠保護線粒體功能，進而減輕患者心肌缺血再灌注損傷。

相關藥理學研究發現，山茱萸的有效的化學成分主要為苷類、多糖體以及有機酸等，在服用之后能夠清除自由基，對興奮作用進行免疫［16-18］。山茱萸多糖對于免疫低下的小鼠，在細胞免疫功能以及體液免疫促進方面作用明顯。同時，山茱萸總苷具有較為明顯的殺菌和抗炎效果。研究發現：山茱萸能夠使大鼠心肌梗死面積呈現減小趨勢，改善其心功能。山茱萸能夠保護大鼠心肌，是因為其能夠抑制炎性介質釋放，并改善心肌細胞鈣超載狀況。此外，山茱萸也能夠發揮線粒體功能，在心肌細胞凋亡抑制方面也存在一定的優勢［19-20］。相關人員發現，山茱萸多糖和總苷在抑制心肌細胞凋亡機制方面有所差異，山茱萸多糖通過細胞膜受體信號通路，而山茱萸總苷則通過線粒體通路抑制細胞凋亡。

綜上所述，傳統中藥山茱萸及其有效成分通過PI3K/Akt通路，作用于線粒體ATP依賴性鉀通道，改善線粒體功能、減少細胞凋亡，具有十分重要的臨床意義。

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Study on Mechanism of Action of Cornus Officinalis for Rats with Myocardial Ischemia-reperfusion Injury

LIU Cai-rong，CHEN Ke-fang，HUANG Qi-hui.//Medical Innovation of China，2016，13（11）：024-027

【Abstract】Objective：To learn the protective mechanism of action of cornus officinalis for rats with myocardial ischemia-reperfusion injury.Method：Eighty-four male Wistar rats were divided into three groups according to the random number table，the control group，the ischemia-reperfusion group（I/R group） and the treatment group，twenty-eight rats in each group.The model of myocardial ischemia-reperfusion injury in rats was developed by ligaturing the left descending anterior coronary artery，the rats in the control group were only thread while rats in the I/R group were given 1 mL 0.9% sodium chloride injection through the tail vein before reperfusion and rats in treatment group were given 1 mL cornus officinalis injection through the tail vein.The myocardial ischemia and electrocardiograph information of all groups were observated and recorded.Result：Compared with the control group，FS and EF of the rats in I/R group and treatment group were decreased，but LVDd，LVESV and LVEDV were increased，while compared with the I/R group，FS and EF of the rats in treatment group were increased，but LVDd，LVESV，LVEDV were decreased，the differences were all statistically significant （P＜0.05）.Conclusion：Cornus officinalis may play a very important role for realizing the protective mechanism in rats with myocardial ischemia-reperfusion injury through PI3k/Akt pathway.

【Key words】Cornus officinalis； Myocardial ischemia； Ischemia-reperfusion injury； PI3k/Akt pathway

*基金項目：廣東省中醫藥局科研課題（20151174）

通信作者：劉彩容

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2016.11.007

收稿日期：（2015-12-07） （本文編輯：劉蕾）