鮑腸道益生菌芽孢桿菌A3440菌株培養基及發酵條件優化

凌宇恒,吳淑妃,柯才煥,趙　晶

(廈門大學海洋與地球學院,福建廈門 361102)

鮑腸道益生菌芽孢桿菌A3440菌株培養基及發酵條件優化

凌宇恒,吳淑妃,柯才煥,趙晶*

(廈門大學海洋與地球學院,福建廈門 361102)

摘要：對一株來自于雜色鮑(Haliotis diversicolor)腸道并經證實具有顯著促進其生長及免疫活性的同溫層芽孢桿菌 (Bacillus stratosphericus)A3440菌株進行培養基及發酵條件的優化研究,為該益生菌應用于鮑及其他水產動物的健康養殖奠定基礎．以細菌芽孢率和蛋白酶活力為檢測指標,采用單因素試驗和正交設計試驗優化發酵培養基組分及發酵條件．結果顯示,該菌最佳發酵配方為：蛋白胨7 g/L，酵母膏7 g/L，NaCl 20 g/L，CaCl2 0.20 g/L;最佳發酵條件為：初始pH 9.0，培養溫度30 ℃，種子液接種量8%，裝液量30 mL(250 mL錐形瓶)，培養時間24 h．優化后芽孢率為94.3%,較基礎培養基提高8.77%;蛋白酶活力為294.44 U/mL,較基礎培養基提高76.67%．

關鍵詞：同溫層芽孢桿菌;發酵培養基;發酵條件;蛋白酶活力;芽孢率

隨著對動物蛋白需求的增大,水產養殖業作為世界發展最快的食品供給領域,受到越來越多的關注,具有廣闊的前景[1]．亞洲的水產養殖業近幾十年迅猛發展,目前產量已占全球的90%[2]．我國的鮑養殖研究開始于20世紀70年代,80年代開始大規模養殖，2013年全國鮑養殖總產量達11萬t,其中福建省8.85萬t[3],創造了巨大的經濟價值與社會效益．然而,隨著鮑養殖業的快速發展,養殖規模的不斷擴大，集約化程度的提高以及沿海水質的惡化,鮑病害日益頻繁,危害了鮑的生長發育以及鮑養殖業的健康發展[4-5]．抗生素的應用在一定程度上能有效應對水產養殖病害的發生和蔓延,但長期使用將會導致一系列副作用，如抗生素殘留水平升高、病原菌抗藥性增強、破壞腸道有益菌群的微生態環境等,且抗生素在水生動物體內的富集也會對人類健康造成危害[6-7]．因此,開展鮑健康養殖方式勢在必行．

益生菌能夠有效改善水環境，調節養殖動物體內微生態平衡，提高宿主免疫水平和消化酶活性,在促進水產養殖對象生長發育與預防病害中發揮重要作用,成為水產養殖業的研究應用焦點[8],益生菌取代抗生素也成為未來的發展趨勢[9]．1974年,Parker定義益生菌為有助于腸道菌群平衡的微生物和物質[10]．1986年,Kozasa將益生菌應用于水產養殖中[11]．此后,益生菌水產養殖研究迅速發展,在作為飼料微生態添加劑和水體微生態調節劑上都發揮巨大的作用．2001年,食品農業組織(FAO)和世界衛生組織(WHO)完善了它的定義,將益生菌定義為有活性的微生物,當其適量施用時,能夠賦予宿主健康[12]．目前已經發現了多種可以用于養殖的益生菌,包括革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌,其來源通常是宿主動物的消化道[13]．芽孢桿菌是一種重要的益生菌,革蘭氏陽性,大多好氧或兼性厭氧,具有極強的產孢能力；且其分解轉化和適應能力強,可代謝產生蛋白酶、淀粉酶、酯酶等多種酶類,提高養殖對象對飼料的吸收與轉化,并能夠降解水體中的氨氮、亞硝酸鹽,抑制病原菌的生長[14-15]．在過去30年,芽孢桿菌屬已擴展至超過100種,但可用作養殖益生菌的菌種并不多[16]．目前,益生菌在水產養殖中的應用主要集中在魚類、甲殼類和雙殼類,關于鮑等腹足類的益生菌研究相對較少,許多在鮑養殖中使用與研究的益生菌多從其他水生動物或水體中提取,效果并不明顯．

同溫層芽孢桿菌(Bacillusstratosphericus)A3440菌株是從健康雜色鮑(Haliotisdiversicolor)腸道分離篩選獲得的,研究發現其具有5種消化酶活性,包括蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶、褐藻酸鈉酶和纖維素酶,其中以蛋白酶活力最強；并通過初步檢測其安全性發現不產生溶血素,且在菌株生物量為1×108cfu/g (cfu,colony-forming units,指單位體積中的細菌群落總數)時對鮑無明顯的毒害作用,可以作為益生菌應用于鮑養殖[17]．本研究以芽孢率和蛋白酶活力為指標,通過單因素試驗和正交試驗對同溫層芽孢桿菌A3440菌株芽孢率和蛋白酶活力的發酵條件優化,為工業化生產提供理論依據與參考．

1材料與方法

1.1菌株

同溫層芽孢桿菌A3440菌株由廈門大學海洋與地球學院分離保存．

1.2基礎發酵培養基和種子培養

以2216E液體培養基作為基礎發酵培養基:蛋白胨5 g/L，酵母膏1 g/L，磷酸高鐵0.01 g/L，過濾陳海水1 L．將A3440菌株接種于100 mL培養基,200 r/min、30 ℃搖床培養20 h后作為種子培養液備用．

1.3實驗方法

1.3.1生長曲線的測定

為選擇合適生長時期的菌液作為種子液,進行A3440菌株生長曲線的測定．將1 mL種子液接種于100 mL基礎培養基(即接種量為1%),200 r/min、30 ℃搖床培養．每隔2 h取樣,以基礎培養基為空白,測定發酵液在630 nm條件下的吸光度(OD630)．以培養時間為橫坐標,OD630為縱坐標,繪制A3440菌株的生長曲線,以選擇對數生長期為最佳接種時間．

1.3.2芽孢率的測定

采用稀釋平板計數法,選取3個梯度為106，107，108,每個梯度涂布3個平板,30 ℃培養48 h后進行計數．將菌液80 ℃水浴10 min后稀釋平板計數,按以下方程式計算A3440菌株的芽孢率：

1.3.3蛋白酶活力的測定

The Position of Khan Kharangui in Mongolian Heroic Epics

用100 μg/mL的酪蛋白標準溶液配置標準系列溶液,酪蛋白終質量濃度分別為0，10，20，30，40，50 μg/mL,使用改良型Lowey法蛋白濃度測定試劑盒(上海生工生物工程股份有限公司)處理,以蒸餾水作為空白對照，在酶標儀上測定其OD630,繪制標準曲線(圖1)．

圖1　酪蛋白標準曲線Fig.1Standard curve of casein

參照張映京等的方法[18]測定蛋白酶活力．取發酵菌液1 mL,8 000 r/min離心15 min,分別取0.2 mL加入2個1.5 mL離心管,標記為試驗組與空白組．40 ℃水浴2 min,空白組加入0.4 mol/L三氯乙酸0.4 mL．各組加入1%(質量分數)酪蛋白0.8 mL,40 ℃保溫20 min．試驗組加入0.4 mol/L三氯乙酸0.4 mL,保溫20 min．4 000 r/min離心10 min，取上清,稀釋100倍．取20 μL于酶標板,以20 μL蒸餾水作為對照．使用改良型Lowey法蛋白濃度測定試劑盒處理,在酶標儀上測定其OD630．在上述反應條件下,每分鐘水解酪蛋白產生1 μg 酪氨酸的酶量為1個酶活力單位.計算公式:酶活力(U/mL)=ΔOD×1×N/(k×20).其中ΔOD為試驗組與空白組的OD630差值，N為酶液的稀釋倍數，k為標準曲線斜率,1表示1 mL發酵菌液，20表示反應20 min．

1.3.4培養基組分的選擇

在其他培養條件不變的情況下：1) 將基礎培養基中的蛋白胨替換為等質量的淀粉、乳糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖為菌株提供碳源,以不加碳源的培養基作為陰性對照;2) 將基礎培養基中的酵母膏替換為等質量的牛肉膏、硫酸銨、硝酸銨、乙酸銨為菌株提供氮源,以不加氮源的培養基作為陰性對照;3) 將基礎培養基中的陳海水替換為10 g/L NaCl、KCl、MgSO4、CaCl2為菌株提供無機鹽,以不加無機鹽的培養基作為陰性對照;4) 將基礎培養基中的磷酸高鐵(Fe3+)替換為等物質的量Mg2+、Ca2+、Zn2+、Cu2+為菌株提供金屬離子,以不加金屬離子的培養基作為陰性對照．上述實驗均以基礎培養基作為陽性對照，探究最優碳源、氮源、無機鹽和金屬離子．

1.3.5培養基組分的正交優化

根據以上實驗結果,選擇最優碳源、氮源、無機鹽、金屬離子設計4因素4水平正交試驗，如表1所示．

表1　A3440菌株培養基組分的正交試驗因子

1.3.6發酵條件的選擇

圖2　A3440菌株的生長曲線Fig.2Growth curve of A3440

根據正交試驗結果配制發酵培養基，在其他培養條件不變的情況下：1) 分別在20，25，30，35，40 ℃培養,確定最優培養溫度;2) 分別以1%，3%，5%，8%，10%接種量加入種子液,確定最優接種量;3) 在250 mL錐形瓶中分別加入20，30，40，50，60，70 mL培養基,確定最優裝液量；將培養基初始pH分別調節至5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，10.0，11.0,確定最優初始pH．

1.3.7數據處理

采用SPSS 17.0軟件進行統計分析,通過Duncan氏多重比較分析組間差異顯著性,顯著性水平為0.05．

2結果與分析

2.1A3440菌株種子液培養時間的確定

對A3440菌株進行生長曲線的繪制(圖2),結果表明：在0～10 h,菌體生長速度緩慢;在10～28 h,菌體生長速度加快;從28 h開始,菌體生長速度逐漸減小．因此，選擇處于生命力旺盛的對數期菌體作為種子液,即選擇24～26 h作為種齡．

2.2培養基組分對A3440菌株蛋白酶活力、生物量與芽孢率的影響

相同字母代表組間無顯著差異(下同).圖3　不同培養基組分對A3440菌株蛋白酶活力的影響Fig.3Effects of different culture medium components on protease activity of A3440

圖4　不同培養基組分對A3440菌株生物量和芽孢率的影響Fig.4Effects of different culture medium components on viable count and yield spore production of A3440

碳源、氮源、無機鹽和金屬離子的優化結果如圖3和4所示.碳源優化實驗(圖3(a)、圖4(a))中,以蛋白胨、蔗糖、乳糖作為碳源,芽孢率較大,均在85%以上,但蛋白胨作為碳源,生物量和蛋白酶活力都顯著高于其他組(p<0.05),因此選擇蛋白胨作為最優碳源．氮源優化實驗(圖3(b)、圖4(b))結果顯示以酵母膏、乙酸銨、牛肉膏作為氮源,芽孢率較大,都在80%以上,但酵母膏作為氮源,生物量和蛋白酶活力都高于其他組,其中生物量對比其他組差異顯著(p<0.05),因此選擇酵母膏作為最優氮源．無機鹽優化實驗(圖3(c)、圖4(c))中各實驗組芽孢率并無顯著差異(p>0.05),以NaCl作為無機鹽,生物量顯著高于其他組(p<0.05),且NaCl作為無機鹽時,發酵液的蛋白酶活力最強,因此選擇NaCl作為最優無機鹽．金屬離子優化實驗(圖3(d)、圖4(d))中,以Fe3+和Ca2+作為金屬離子時,發酵液蛋白酶活力較高,但兩者并無顯著性差異(p>0.05),以Ca2+作為金屬離子時,有最高的生物量和芽孢率,因此選擇Ca2+作為最優金屬離子．

2.3A3440菌株培養基組分的正交優化

正交試驗極差分析結果(表2)表明,R蛋白胨>RNaCl>R酵母膏>RCaCl2,可知蛋白胨作為主要的影響因素,NaCl次之．由均值k得出：蛋白胨7 g/L，酵母膏7 g/L，NaCl 20 g/L，CaCl20.20 g/L為最佳培養基組合,以此進行發酵條件優化．

表2　A3440菌株培養基組分的正交試驗結果

注：k1～k4表示各因素水平下蛋白酶活力的平均值;R表示極差．

2.4培養條件對A3440菌株蛋白酶活力、生物量與芽孢率的影響

圖5　不同培養條件對A3440菌株蛋白酶活力的影響Fig.5Effects of different culture conditions on protease activity of A3440

培養條件優化結果如圖5和6所示.在30和35 ℃時,發酵液的蛋白酶活力最高,但隨著溫度的升高,發酵液的芽孢率不斷降低,35 ℃時的芽孢率顯著低于30 ℃時(p<0.05) (圖5(a)、圖6(a))．接種量為3%～8%時,蛋白酶活力較高,但接種量為5%時生物量偏低,接種量為8%時生物量最高(圖5(b)、圖6(b))．裝液量為20～40 mL時,各試驗組的蛋白酶活力、生物量與芽孢率較高,但并無顯著性差異(p>0.05),其中裝液量為30 mL時具有最高的生物量和芽孢率(圖5(c)、圖6(c))．初始pH值為7.0～10.0時,發酵液具有最高的蛋白酶活力和生物量,顯著高于其他試驗組(p<0.05),其中當初始pH為9.0時,蛋白酶活力和芽孢率最高(圖5(d)、圖6(d))．綜上所述,最優培養條件為：初始pH 9.0，培養溫度30 ℃，種子液接種量8%，裝液量30 mL(250 mL錐形瓶)．

圖6　不同培養條件對A3440菌株生物量和芽孢率的影響Fig.6Effects of different culture conditions on viable count and yield spore production of A3440

所有發酵培養基和培養條件優化后,芽孢率為94.3%,較基礎培養基提高8.77%;蛋白酶活力為294.44 U/mL,較基礎培養基提高76.67%．

3討論

幼鮑餌料中含有大量的蛋白成分,芽孢桿菌進入腸道后產生較強活性的蛋白酶,有助于幼鮑對餌料的消化,進而提高餌料消化率,促進幼鮑的生長[19]．相比于動物蛋白酶、植物蛋白酶和真菌蛋白酶,微生物蛋白酶更多地被運用于工業生產中．芽孢桿菌具有快速產酶能力,其生產的堿性蛋白酶具有很高的蛋白水解活性和在堿性條件下的穩定性[20-21],幾乎包括了能夠應用于生物技術的所有特征[22]，因此本研究選擇蛋白酶活力作為一項指標．

在益生菌投喂過程中,必須保證足夠的活菌量．在不良運輸與加工條件下,芽孢桿菌能形成芽孢,使其具有抗逆性強、耐高溫高壓、易貯存的特點[23]，因此本研究選擇芽孢率作為另一項指標．

在培養基優化實驗中,發現以蛋白胨和酵母膏分別作為碳、氮源時,具有最高的蛋白酶活力與芽孢率．蛋白胨的主要成分為氨基酸、多肽,一般蛋白質含量會達到80%以上,糖類含量較低;酵母膏中含有多種氨基酸、肽類、水溶性纖維素．由此說明同溫層芽孢桿菌A3440菌株在豐富氨基酸、多肽培養基條件下有更強的活性．

從培養條件優化結果可以看出,同溫層芽孢桿菌A3440菌株的適合培養范圍較廣．裝液量與蛋白酶活力和芽孢率都呈負相關性,裝液量反映了菌株的通氣量需求,表明同溫層芽孢桿菌A3440菌株為好氧菌,在實際生產過程中應注意適當提高通氣量．同溫層芽孢桿菌A3440菌株的最適培養pH值為9.0,與郎雙靜等[24]、舒丹等[25]、胡承等[26]的實驗結果相近,推測同溫層芽孢桿菌A3440菌株為產堿性蛋白酶菌株．多個實驗結果可以看出,同溫層芽孢桿菌A3440菌株蛋白酶活力與芽孢率的最適條件接近,但并不一致,因此實際生產中的最適條件有待進一步研究．

本研究對同溫層芽孢桿菌A3440菌株芽孢率和蛋白酶活力的發酵條件進行了優化,在優化條件下芽孢率為94.3%,較基礎培養基提高8.77%;蛋白酶活力為294.44 U/mL,較基礎培養基提高76.67%．研究結果為進一步放大優化以及工業化生產奠定了基礎．

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Optimization of Culture Medium and Fermentation Conditions of Probiotics Bacillus stratosphericus A3440 from Farmed Abalone

LING Yuheng,WU Shufei,KE Caihuan,ZHAO Jing*

(College of Ocean & Earth Sciences,Xiamen University,Xiamen 361102,China)

Abstract:Bacillus stratosphericus A3440 isolated from farmed abalone Haliotis diversicolour has been verified as probiotic to improve the growth rate and the disease resistance of abalone．Based on high yield spore production and strong protease activity,the culture medium and fermentation conditions of B. stratosphericus A3440 were optimized using a single factor test and orthogonal experiments．The results showed that the optimized medium components of A3440 were peptone 7 g/L,yeast extract 7 g/L,NaCl 20 g/L,CaCl2 0.20 g/L and the optimized culture conditions were initial pH 9.0,temperature 37 ℃,inoculation amount 8%,liquid volume 30 mL (in 250 mL flask),and cultivation for 24 h．Under the optimized fermentation conditions,the spore yield was up to 94.3%, which increased by 8.77% compared with that from the initial medium,and the protease activity was 294.44 U/mL,which increased by 76.67% compared with that from the initial culture conditions.

Key words:Bacillus stratosphericus;culture medium;fermentation condition;protease activity;spore yield

doi：10.6043/j.issn.0438-0479.2016.03.006

收稿日期：2015-06-18錄用日期：2015-08-18

基金項目：國家自然科學基金(31202014);福建省科技計劃重點項目(2013N0034)

*通信作者：sunnyzhaoj@xmu.edu.cn

中圖分類號:Q 939.9

文獻標志碼：A

文章編號：0438-0479(2016)03-0336-07

引文格式：凌宇恒,吳淑妃,柯才煥，等.鮑腸道益生菌芽孢桿菌A3440菌株培養基及發酵條件優化.廈門大學學報(自然科學版)，2016,55(3)：336-342.

Citation：LING Y H,WU S F,KE C H,et al．Optimization of culture medium and fermentation conditions of probioticsBacillusstratosphericusA3440 from farmed abalone.Journal of Xiamen University(Natural Science)，2016,55(3)：336-342．(in Chinese)