大鼠尾椎與腰椎髓核組織及細胞的分離培養以及髓核表型的對比研究

康新桂，吳小濤，王鋒，時睿，蔡峰，朱厚毅

(1.東南大學 醫學院，江蘇 南京　210009； 2.東南大學附屬中大醫院 脊柱外科中心，江蘇 南京　210009)

大鼠尾椎與腰椎髓核組織及細胞的分離培養以及髓核表型的對比研究

康新桂1，吳小濤2，王鋒1，時睿1，蔡峰1，朱厚毅1

(1.東南大學 醫學院，江蘇 南京210009； 2.東南大學附屬中大醫院 脊柱外科中心，江蘇 南京210009)

[摘要]目的:對大鼠尾椎與腰椎髓核組織及細胞進行體外分離、培養與觀察，并對髓核軟骨樣細胞表型進行對比研究。方法:分別取12周齡Sprague- Dawley(SD)大鼠腰椎與尾椎椎間盤，用分析天平稱取髓核組織的質量。組織貼壁法分離培養髓核細胞；倒置相差顯微鏡觀察HE染色的髓核組織及不同代次細胞形態變化；流式細胞術檢測細胞凋亡率；實時熒光定量PCR檢測第2代尾椎與腰椎髓核細胞髓核表型的差異。結果:腰椎髓核組織總質量及單個節段的質量均顯著低于尾椎(P<0.05)。成功分離培養腰椎與尾椎髓核細胞。腰椎原代髓核細胞貼壁時間及70%融合時間顯著高于尾椎原代髓核細胞(P<0.05)；第2代腰椎髓核細胞中脊索樣細胞數量顯著低于尾椎髓核細胞(P<0.05)。HE染色示尾椎髓核組織中脊索樣細胞較多，細胞外基質豐富，髓核樣軟骨細胞數目較少。第2代腰椎與尾椎髓核細胞凋亡率差異無統計學意義。實時PCR示第2代尾椎髓核細胞與腰椎髓核細胞相比，前者顯著下調低氧誘導因子(Hif)2α、aggrecan、Brachyury(T)、細胞角蛋白(Krt)8、Krt18及Krt19的表達(P<0.05)，且Brachyury(T)、Krt8、Krt18及Krt19的下調量更明顯；顯著上調碳酸酐酶(Car)3、Car12的表達(P<0.05)。結論:與腰椎髓核組織相比，尾椎髓核組織中的脊索樣細胞數目更多，細胞活性更佳，組織量大，易取材，更適合作為椎間盤退變研究的種子細胞。體外單層培養的腰椎與尾椎髓核細胞表型存在差異。

[關鍵詞]椎間盤； 髓核； 表型； 尾椎； 腰椎； 大鼠

大約80%的人一生中至少經歷一次下腰痛[1]，隨著人口老齡化的發展，下腰痛患者的人數將進一步增加，給社會及個人帶來沉重的經濟負擔[2- 3]，椎間盤退變(intervertebral disc degeneration，IDD)是其主要原因[4]。髓核細胞外基質[5]、脊索樣細胞(notochordal cells，NCs)[2]的丟失是IDD原因之一。現階段的手術及保守療法雖緩解疼痛癥狀，但都不能從根本上解決IDD，甚至還能加重相鄰節段的退變[6]。通過注射功能性細胞(促進基質合成)、分子(刺激內源性細胞合成基質)或生物材料(減震水凝膠)的生物療法有望修復甚至逆轉IDD[3]。近年來，細胞移植療法成為修復或再生退變椎間盤組織的研究熱點[7]。大鼠椎間盤髓核組織中的髓核軟骨樣細胞(nucleus pulposus cartilage cells，NPCs)及NCs對髓核細胞外基質組分的維持有重要作用，被認為是理想的種子細胞[8- 9]。本實驗通過分離大鼠腰椎髓核組織(lumbar nucleus pulposus，LNP)及尾椎髓核組織(caudal nucleus pulposus，CNP)，觀察髓核組織與細胞形態學及NPCs表型等的差異，為選取合適的椎間盤移植療法的種子細胞奠定實驗基礎。

1材料與方法

1.1主要試劑與儀器

DMEM/F12培養液(Gibco，美國)，胎牛血清(Hyclone，美國)，青霉素、鏈霉素雙抗、0.25%胰蛋白酶(Gibco，美國)，Ⅱ型膠原酶(Biosharp，美國)，Annexin Ⅴ- FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒(凱基，中國)，RNA提取試劑盒、反轉錄試劑盒(TaKaRa，日本)，RNA擴增試劑盒(Roche，瑞士)，倒置相差顯微鏡(Olympus，日本)，高速冷凍離心機(Eppendorf，德國)，Nanodrop 2000紫外分光光度計、Becton- Dickinson FACScan流式細胞儀(Thermo，美國)，ABI Step one plus熒光定量PCR循環儀、2720 Thermal Cycler普通PCR儀(Applied Biosystems，美國)。

1.2髓核組織分離、稱重及細胞的提取、培養及傳代

取5只Sprague- Dawley(SD)大鼠(12周，～200g，東南大學實驗動物中心提供)，過量水合氯醛腹腔注射處死，酒精消毒背部后切開背部皮膚、筋膜與肌肉，游離胸腰椎及尾椎，剖離附著的肌肉與筋膜，放置碘伏中浸泡5min，PBS沖洗后分別于超凈臺下分離提取3只SD大鼠的LNP與CNP，分析天平稱重，另外2只的腰椎與尾椎椎間盤浸泡于福爾馬林溶液中備用。另取6只SD大鼠(12周，～200g)，按上述方法分別分離LNP與CNP并放置于0.15%的Ⅱ型膠原酶、37℃搖床中消化3h(每2只大鼠的LNP與CNP為1組)；將含未完全消化組織塊的細胞懸液經1000r·min-15min離心后，直接加完全培養基(含10%胎牛血清、1%青霉素+鏈霉素雙抗的DMEM/F12培養基)重懸后分別種植于3個T25培養瓶中，37℃、體積分數5%CO2、飽和濕度的細胞孵育箱中培養，4d后首次換液，以后每3d換液。原代細胞達70%融合時1∶2傳代培養，以后細胞達80%融合時1∶2傳代培養。

1.3腰椎與尾椎髓核組織HE染色及細胞形態學觀察

取上述浸泡于福爾馬林溶液的椎間盤組織，蠟塊包埋組織后行HE染色觀察；倒置相差顯微鏡觀察分離培養的原代及傳代后的第2代腰椎髓核細胞(lumbar nucleus pulposus cells，LNPCs)與尾椎髓核細胞(caudal nucleus pulposus cells，CNPCs)。

1.4細胞凋亡檢測

取達80%融合的第2代LNPCs與CNPCs，消化細胞后用PBS洗滌2次，2000r·min-1離心5min；500μl Binding Buffer懸浮細胞后再加入5μl Annexin Ⅴ- FITC并充分混勻；最后加入5μl Propidium lodide充分混勻后移入2.5ml EP管中；錫紙避光包裹并室溫靜置15min，1h內用流式細胞儀進行分析。

1.5實時熒光定量PCR檢測NPCs表型基因

按照說明書操作提取RNA并逆轉錄后，所得到的cDNA經實時熒光定量PCR對低氧誘導因子(Hif)1α、Hif2α、聚集蛋白聚糖(Acan)、2型膠原(Col2a1)、Brachyury(T)、碳酸酐酶(Car)3、Car12、細胞角蛋白(Krt)8、Krt18及Krt19基因進行擴增，以肌動蛋白(Act)β為內參照。Hif1α引物上游5′- AGCAATTCTC

CAAGCCCTCC- 3′，下游5′- TTCATCAGTGGTGGCAGTTG- 3′；Hif2α引物上游5′- TCACTCATCCTTGCGACCAC- 3′，下游5′- CAGGTGGCCGACTTAAGGTT- 3′；Acan引物上游5′- TGGCCTGCCTGACTTTAGTG- 3′，下游5′- CCTGAACCACTGACGCTGAT- 3′；Col2a1引物上游5′- GGCCAGGATGCCCGAAAATTA- 3′，下游5′- ACCCCTC

TCTCCCTTGTCAC- 3′；Brachyury(T)基因上游5′- GCAAGCTAGAGTCCTTTGCCT- 3′，下游5′- AATCCGCT

GGCTATGGTGTT- 3′；Car3引物上游5′- TGGTTCACTG

GAACCCGAAG- 3′，下游5′- GAGCCTCCTTGCCCTTAG

TC- 3′；Car12引物上游5′- TCCGACAAGGACTGCTTAC

C- 3′，下游5′- GGAGATCCCAAGGACACCAG- 3′；Krt18引物上游5′- ACTACCCGTAAGGTCGTGGA- 3′，下游5′- TTGGTCCCTCAGTCCCCAAG- 3′；Krt19引物上游5′- GTCTTCCTATGGGGGCATGG- 3′，下游5′- TAAAACTTC

CACCGCGTCCT- 3′；Actβ引物上游5′- CCCATCTATGA

GGGTTACGC- 3′，下游5′- TTTAATGTCACGCACGATTT

C- 3′。以上引物均由TaKaRa公司設計并驗證。Krt8引物由查詢以往文獻[10]所得，上游5′- TTGAAACCCG

aGATGGGAAA - 3′，下游5′- GGCCATTCACTTGGACA

TGAT- 3′。PCR反應期參數設置為95 ℃ 5 s，60℃ 30 s，循環40次并繪制溶解曲線。

1.6統計學處理

采用Grapd pad prism 5.0統計軟件進行分析，數據以均數±標準差表示。組間比較采用獨立樣本t檢驗，組內比較采用單因素方差分析，P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1髓核組織鮮重比較

LNP(共6個椎間盤)的總重量為(11.33±1.53)mg，n=3；CNP(共8個椎間盤)總重量為(45.33±6.51)mg，n=3； 單節段LNP的平均重量為(1.89±0.25)mg，n=3；單節段CNP的平均重量為(5.67±0.81)mg，n=3。CNP的總重量及單個節段的質量均顯著高于LNP(P<0.05)。見圖1。

2.2髓核細胞形態學比較

單層培養系統下，LNPCs貼壁時間為(11.67±1.53)h(n=3)，高于CNPCs的(7.67±0.58)h(n=3)，差異有統計學意義(P<0.05)。原代細胞以集落的形式向外擴增生長，直至不同集落相互融合。然而部分集落相距較遠，不易相互融合，此時這些集落中的細胞生長速度緩慢。部分細胞從未消化完全的組織塊中鉆出，越靠近這些未完全消化的組織塊，含液泡結構的NCs越多，反之體形較小呈長梭形、三角形或多邊形的NPCs和(或)髓核干細胞越多。LNP與CNP相比，CNP提取的細胞中NCs較多。原代細胞生長緩慢，LNPCs達70%融合時間[(21.67±1.53)d，n=3]多于CNPCs[(16.67±1.53)d，n=3]，差異有統計學意義(P<0.05)。隨著傳代次數的增加，細胞達80%融合速度均明顯降低，含液泡結構的NCs數量減少，第2代LNPCs中的NCs數量[(4.67±0.58)，n=3]仍低于CNPCs[(6.33±0.58)，n=3]，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖2。

*P<0.05

a.LNP與CNP總質量； b.單個節段LNP與CNP平均質量

圖1LNP與CNP鮮重比較

Fig 1Fresh weight comparison between LNP and CNP

a.原代LNPCs； b.第2代LNPCs； c.原代CNPCs； d.第2代CNPCs

圖2LNPCs與CNPCs倒置相差顯微鏡下形態×100

Fig 2Morphology observation of LNPCs and CNPCs under inverted phase contrast microscopy×100

2.3LNP與CNP HE染色

與LNP相比，CNP含有較多液泡結構的NCs，細胞外基質豐富，而NPCs數量較少(圖3)。

2.4LNPCs與CNPCs凋亡率比較

第2代LNPCs凋亡率為(6.23±0.29)%(n=3)，稍低于第2代CNPCs的(6.39±0.64)%(n=3)的，差異無統計學意義(P=0.71>0.05)(圖4)。

2.5NPCs相關標記基因表達情況

實時熒光定量PCR顯示第2代CNPCs與LNPCs相比，CNPCs下調Hif1α、Hif2α、Acan、Brachyury(T)、Krt8、Krt18及Krt19的表達，Hif2α、Acan、Brachyury(T)、Krt8、Krt18及Krt19的表達差異有統計學意義(P<0.05)，且Brachyury(T)、Krt8、Krt18及Krt19的下調量更明顯；上調Col2a1、Car3及Car12表達，且Car3、Car12上調幅度較大(P<0.05)。見圖5。

a.LNP； b.CNP

圖3HE染色觀察LNP與CNP形態×100

Fig 3Morphology observation of LNP and CNP by HE staining×100

a.LNPCs； b.CNPCs

圖4第2代LNPCs與CNPCs細胞凋亡率

Fig 4Cell apoptosis rate of LNPCs and CNPCs at P2

aP<0.05

圖5CNPCs相對于LNPCs髓核表型基因的mRNA表達量

Fig 5Messenger RNA expression levels of nucleus pulposus phenotypic markers of CNPCs rate to LNPCs

3討論

人NPCs形態在出生前后與胚胎發育期體形較大、含液泡結構的NCs非常相似[2]，而且這些NCs在10歲左右逐漸死亡和(或)被體形較小的NPCs取代，這也是IDD征象出現的時期[9- 11]，暗示NCs的死亡和(或)向NPCs轉變可能啟動IDD。隨著椎間盤的逐漸成熟，不僅細胞形態發生改變，細胞所處微環境及細胞外基質組分也發生改變，逐漸由嬰兒期髓核組織中高細胞數量、低細胞外基質的組分轉變為成年后的低細胞數量、高細胞外基質組分[12]。我們研究發現，原代及傳代后(第1、2代)的CNP中NCs數量顯著高于LNP，且NCs數量隨傳代次數增加而逐漸減少。NCs的死亡和(或)向NPCs轉變可能與滲透壓、營養、氧含量等微環境因素有關，NPCs對椎間盤“惡劣”微環境的耐受性更強[2，13]。然而，這種含液泡結構的NCs的丟失是因細胞死亡或者轉變為NPCs仍不清楚[1]。我們研究還發現，越靠近未完全消化的組織塊，含液泡結構的NCs越多。我們建議，在消化含有NCs的組織時要控制好消化時間。充分的組織消化有利于形成單細胞懸液，而過長的消化時間可能不利于NCs的分離與培養。集落較大時細胞生長速度緩慢，這與Turner等[7]的研究一致。在培養這種含有未完全消化組織塊的原代細胞時，要根據集落的大小合理安排傳代時間，不一定待所有集落完全相互融合時傳代。

細胞外基質代謝失衡與IDD密切有關[14]，NCs能促進細胞外基質的合成[8]。在軟骨發育不良狗與非軟骨發育不良狗(椎間盤中仍含有NCs)的對照研究中發現，前者所提取細胞對凋亡相關蛋白的抑制作用明顯低于后者，其椎間盤更容易發生退變[2，15]。軟骨細胞與細胞外基質中的蛋白多糖，整合素，Ⅱ、Ⅳ型蛋白密切相關，同時影響組織的應力保護及滲透壓[16]。我們研究發現，CNP中含液泡結構的NCs數量明顯高于LNP，細胞外基質豐富，而NPCs數量較少。NCs的液泡結構參與椎間盤微環境的滲透壓調節[17]，暗示細胞外基質含量的多少可能與NCs中的液泡結構有關。我們設想，髓核組織所承受的總壓力(p0)、細胞外基質所受壓力(p1)及細胞所承受的壓力(p2)之間的變量關系(p0=p1+p2)與NCs液泡結構的丟失有關。當p0不變的前提下，p1的增大(對應細胞外基質增多)會引起p2的減小，即細胞承受壓力減小，含液泡結構的NCs數量相應增多，這與我們HE染色結果相一致，也與軟骨發育不良狗中NCs較少的現象相符。

位于椎間盤中心區域的NCs是脊索動物在早期胚胎發育時期由脊索發育形成的[12]。人、牛、羊、馬及軟骨發育不良狗椎間盤中的這種含液泡結構的NCs在出生前后就逐漸消失，而在成年的豬、兔、鼠及非軟骨不良狗中仍存在NCs[2]。因此，這些含有NCs的動物被認為可能不是理想的動物模型[18]。然而，相關研究發現成年后NCs并未消失，只是形態上逐漸轉變為NPCs[17]，且在那些出生前后NCs就逐漸消失的物種(牛、羊、馬)中，直到成年時IDD的發生率也無明顯增加，這種細胞形態及大小的轉變可能是應機體成熟及功能變化所需的一種選擇效應，也有可能是某些物種的特異性發育[1，14，19]，并不認為是退變開始的標志[17]。這也暗示了在椎間盤動物模型的選擇上，要著重于解剖結構及椎間盤的力學特性方面，而不是關注這些動物中有無NCs方面。我們研究發現，含較多NCs的第2代CNPCs與LNPCs的凋亡率差異無統計學意義(P<0.05)，SD大鼠可作為理想的動物模型。

細胞移植療法是修復甚至逆轉IDD的研究熱點[7]。自體NPCs再植術可有效緩解病人的下腰痛癥狀[3]，延緩IDD進程[5]。椎間盤髓核組織中的細胞能夠很好地適應椎間盤低氧、高滲、偏酸、營養匱乏、周期性力學負荷的“惡劣”微環境[20]，因此自體椎間盤細胞被認為是細胞移植療法中最理想的種子細胞[9]。然而，通過針刺抽吸正常椎間盤組織會誘導加速IDD，且這些正常的椎間盤組織中細胞數量較少，單節段椎間盤抽取的細胞量可能達不到移植療法的治療量[2]。此外，退變椎間盤中的細胞老化率及基質降解酶活性較高，基質合成能力低下，均達不到細胞移植療法的要求[2]。髓核組織中的NCs除了能維持細胞外基質組分外，還能促進NPCs及間充質干細胞增殖[8，13]、抑制NPCs凋亡[15]、調節細胞內外滲透壓平衡[17]、分泌某些細胞因子來修復甚至逆轉IDD[8]，被認為是理想的種子細胞。然而，人NCs在10歲之前就死亡和(或)被NPCs替代，富含NCs的組織只能從更加年輕或胎兒尸體中提取，嚴重限制富含NCs組織或細胞移植療法的臨床應用[8]。椎間盤是低血管化的免疫豁免組織，發生移植物免疫排斥反應的風險較低[4]，暗示著外源性富含NCs組織或細胞移植到人椎間盤組織來修復IDD有可能成功。Liu等[21]研究發現人多能干細胞在滅活豬髓核細胞外基質的誘導下可分化為高表達NCs表型[brachyury(T)、Krt8、Krt18]的細胞，促進Acan及Col2a1的表達，表明在含有NCs物種的髓核細胞外基質中可能含有與NCs活性、增殖及分化相關的細胞因子。在有合適誘導人類多功能干細胞定向分化的生物材料或細胞因子前提下，有望獲取更多適合椎間盤生物療法的種子細胞，從而推動生物療法的發展。

低血管化椎間盤髓核組織中的氧含量較低，常氧狀態下的NPCs也高表達Hif1α及Hif2α，有異于其它軟骨細胞，被認為是NPCs表型[22]。髓核細胞外基質主要由蛋白多糖及膠原蛋白組成，而Acan與Col2a1分別占蛋白多糖及膠原蛋白的比重最大，有異于纖維環細胞[23]，被認為是NPCs表型[24]。brachyury(T)、Krt8、Krt18、Krt19被認為是NCs表型[2，6]。在退變的人[12]及軟骨發育不良狗[2，15]椎間盤髓核組織中brachyury(T)低表達。髓核組織與纖維組織中的細胞相比，前者高表達Krt8、Krt18、Krt19[25]，且在人退變椎間盤髓核組織中表達下降，也被認為是健康NPCs表型[26]。髓核區域低血管化、糖酵解的特性易化乳糖積聚，Car蛋白與酸堿代謝平衡有關，對髓核組織偏酸微環境的緩沖、NPCs的活性及功能的維持有重要意義[27]，且Car3、12在脊索及出生前后的髓核組織中高表達，也被認為是健康NPCs表型基因[26]。我們對比研究了LNPCs與CNPCs中上述NPCs表型的表達情況，發現第2代CNPCs與LNPCs相比，Hif2α、Acan、Brachyury(T)、Krt8、Krt18及Krt19的表達顯著下調(P<0.05)。 有意思的是，在液泡結構NCs較多的第2代CNPCs中，NCs表型brachyury(T)、CK- 8、CK- 18/19下調幅度最大，Acan、Col2a1并未增加，甚至顯著下調Acan，而與酸堿代謝平衡相關的Car卻大幅度上調。相關研究發現，體外培養時間的增加會下調NCs表型brachyury(T)、Krt8、Krt18，上調NPCs Sox- 9、Col2a1表型[6]。成人髓核組織中也表達brachyury(T)、Krt8、Krt18、Krt19等NCs表型[2]。在持續壓力作用下的豬椎間盤組織培養模型中，NCs的丟失與brachyury(T)、Krt8、Acan、Col2a1無顯著相關性[17]。在NCs共培養系統中，NCs并不能顯著上調Acan等NPCs表型的表達[20]。培養系統、細胞種系、培養時間、所選用的支架材料、培養基的不同均能顯著影響細胞表型[28]。這種表型的差異還可能歸因于以下幾點：(1) 含液泡結構NCs的凋亡[17]；(2) NPCs及髓核干細胞的增殖[17]；(3) NCs向NPCs或纖維樣細胞轉化[2]；(4) 髓核干細胞向NPCs或纖維樣分化[2]。

CNP中細胞培養效率高[29]、力學負荷小[30]、NCs數量多、組織量大、易取材的特性，可能更有利于IDD的研究。而NCs有維持細胞外基質組分及促細胞增殖方面的特性，可作為理想的種子細胞。但不容忽視的是，體外單層常氧條件下培養的LNPCs與CNPCs的表型存在差異，這種表型差異是否有利于抵御氧化應激、酸堿代謝平衡等微環境作用有待進一步研究。單層培養系統不能很好地模擬體內低氧、高滲、營養匱乏、偏酸及周期性力學負荷等復雜多元的微環境[20]。高糖培養引起的氧化應激反應上調NCs自噬相關基因，經線粒體損傷途徑引起細胞自噬[31]。臨床研究發現，糖尿病患者更容易遭受脊柱退行性疾病困惱[32]。本實驗選用的是低糖的DMEM/F12培養基，然而糖含量更低的α- 最低基礎培養基(minimum essential medium)與DMEM/F12培養基相比，前者顯著上調細胞外基質組分Col2a1、Acan的表達，可能更適合NCs的培養[13]。NCs與NPCs相比，NCs對養分[33]、滲透壓[13]要求較高，在體內椎間盤“惡劣”微環境刺激下，NCs可能難以存活。因此，我們在關注NCs在椎間盤修復前景的同時也要考慮其局限性。

本實驗選用的是體形較小的SD大鼠，其脊柱解剖結構及生物力學與人及某些大動物相比均有較大差異[34]。細胞移植療法在犬科動物[34]、兔形目動物[5，9]及嚙齒目動物[9]關于延緩IDD方面都得到積極的療效。然而，這種積極療效能否應用到人身上仍是不容忽視的問題。自體細胞移植療法已經開展了臨床試驗[7]，相信在醫務工作者及研究人員的不懈努力下，這些問題不日將得以解決，NCs與NPCs移植療法在治療椎間盤退行性疾病方面將發揮更大作用。

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cultivation and observation of rat lumbar and caudal vertebra nucleus pulposus tissues and cells and comparative study on nucleus pulposus phenotypic markers

KANG Xin- gui1，WU Xiao- tao2，WANG Feng1，SHI Rui1，CAI Feng1，ZHU Hou- yi1

(1.MedicalSchoolofSoutheastUniversity，Nanjing210009，China; 2.DepartmentofSpineSurgeryCenter，ZhongdaHospital，SoutheastUniversity，Nanjing210009，China)

[Abstract]Objective： To isolate， culture and observe nucleus pulposus tissues and cells from the lumbar and caudal intervertebral disc of rat， and to compare the nucleus pulposus phenotypic markers. Methods: The whole spine was separated from 12- week- old Sprague Dawley rats under the sterile condition. The weights of lumbar and caudal nucleus pulposus tissues were measured by analytical balance. Lumbar and caudal nucleus pulposus cells were cultured by adherent cultivation approach. Lumbar and caudal nucleus pulposus tissues morphology and cellular morphologic changes were noted by HE staining and continuous observation under inverted phase contrast approach， respectively. Lumbar and caudal nucleus pulposus cells apoptosis rates were analyzed with flow cytometry. Messenger RNA expression levels of nucleus pulposus phenotypic markers of lumbar and caudal nucleus pulposus cells at P2 were determined by real- time polymerase chain reaction array analysis. Results: The total and single weights of lumbar nucleus pulposus tissues were significantly lower than those of caudal nucleus pulposus tissues(P<0.05). Lumbar and caudal nucleus pulposus cells were isolated and cultured successfully. The adherence time of the primary cells(the cell fusion reached 70%) in lumbar group was significantly longer than that in caudal group in prithany generation(P<0.05). The numbers of notochordal cells in lumbar group were significantly lower than those in caudal group at P2(P<0.05). HE staining showed that the numbers of notochordal cells， the extracellular matrix in caudal group were abandant than those in lumbar group， however， the numbers of nucleus pulposus cartilage cells were lower than those in lumbar group. The cell apoptosis rates had no significant differences between lumbar and caudal nucleus pulposus cells at P2(P>0.05). Messenger RNA expression levels of nucleus pulposus phenotypic markers in caudal group were significant lower expression of Hif2α， aggrecan， Brachyury(T)， Cytokeratin8， 18，19(P<0.05)， and lower expression of Brachyury(T)， Cytokeratin8， 18， and 19 was more steeper， and significant higher expression of Carbonic anhydrase3，12. Conclusion: Compared with the lumbar nucleus pulposus， caudal nucleus pulposus has more notochordal cells， a better cellular status， more tissue， easier assessible， which is more suitable for experiment as a seed cell. Messenger RNA expression levels of nucleus pulposus phenotypic markers have a difference between lumbar and caudal nucleus pulposus cells cultured in monolayer in vitro．

[Key words]intervertebral disc; nucleus pulposus; phenotypic marker; caudal vertebra; lumbar; rats

[收稿日期]2016- 02- 16[修回日期] 2016- 03- 10

[基金項目]國家自然科學基金資助項目(81272035，81572170，81572190，81201423)

[作者簡介]康新桂(1989-)，男，山東青島人，在讀碩士研究生。E- mail:xinguikang@163.com

[通信作者]吳小濤E- mail:wuxiaotao@medmail.com.cn

[中圖分類號]Q813.1； R- 33； R681.5

[文獻標識碼]A

[文章編號]1671- 6264(2016)03- 0293- 09

doi：10.3969/j.issn.1671- 6264.2016.03.001

[引文格式] 康新桂,吳小濤,王鋒,等.大鼠尾椎與腰椎髓核組織及細胞的分離培養以及髓核表型的對比研究[J].東南大學學報:醫學版,2016,35(3):293- 301.

·論著·