長鏈非編碼RNA RP11- 191L9.4促進前列腺癌PC- 3細胞的遷移和侵襲

王京，黃燁清，許斌，陳明

(1.東南大學 醫學院，江蘇 南京　210009； 2.東南大學 附屬中大醫院，江蘇 南京　210009)

長鏈非編碼RNA RP11- 191L9.4促進前列腺癌PC- 3細胞的遷移和侵襲

王京1，黃燁清1，許斌2，陳明2

(1.東南大學 醫學院，江蘇 南京210009； 2.東南大學 附屬中大醫院，江蘇 南京210009)

[摘要]目的：探討長鏈非編碼RNA RP11- 191L9.4對前列腺癌PC- 3細胞增殖、遷移及侵襲能力的影響。方法：熒光定量PCR檢測RP11- 191L9.4 siRNA在PC- 3細胞中的敲除效率； 通過MTT實驗和克隆形成實驗觀察在PC- 3細胞中低表達RP11- 191L9.4對其增殖的影響；通過transwell細胞遷移實驗檢測敲低RP11- 191L9.4的表達對PC- 3細胞的遷移能力影響；通過Matrigel侵襲實驗檢測敲低RP11- 191L9.4的表達對PC- 3細胞侵襲能力的影響。結果：向前列腺癌細胞系PC- 3中轉染RP11- 191L9.4 siRNA 48 h后，qPCR檢測PC- 3細胞中RP11- 191L9.4明顯低表達；MTT及克隆形成實驗結果顯示，敲低RP11- 191L9.4的表達能顯著抑制PC- 3細胞的增殖；transwell遷移實驗結果顯示，敲低RP11- 191L9.4的表達能減弱PC- 3細胞的遷移能力；Matrigel膠細胞侵襲實驗結果顯示，敲低RP11- 191L9.4的表達能減弱PC- 3細胞的侵襲能力。結論：轉染RP11- 191L9.4 siRNA能顯著抑制PC- 3細胞中RP11- 191L9.4的表達，而敲低RP11- 191L9.4的表達可顯著抑制前列腺癌細胞PC- 3增殖、遷移及侵襲能力。

[關鍵詞]lncRNA； RP11- 191L9.4； 前列腺癌； 細胞增殖； 細胞遷移； 腫瘤侵襲

前列腺癌是我國男性的常見惡性腫瘤之一，目前認為前列腺癌與年齡、雄激素、高動物脂肪攝入以及遺傳等因素相關，但其確切發病機制仍不清楚[1]。長鏈非編碼RNA(long non- coding RNA， lncRNA)是長度大于200個核苷酸的非編碼RNA，約占RNA總量的98%，多數位于細胞核或細胞質內，在真核細胞中被普遍轉錄[2]。研究發現多種lncRNA在人的腫瘤組織和正常組織中存在顯著的差異性表達，并且lncRNA很可能在腫瘤的發生發展過程中起著促癌或抑癌的作用[3]。目前研究表明，多種lncRNA與前列腺癌的發生、發展、轉移等有著非常密切的關系。我們課題組在前期工作中從收集到的前列腺癌組織及相應癌旁組織中應用芯片篩選出表達水平有顯著差異的一批lncRNA，其中RP11- 191L9.4在癌組織中的表達水平相比對應的癌旁組織有顯著提升。而目前有關長鏈非編碼RNA RP11- 191L9.4未見相關報道。本研究在前列腺癌細胞系PC- 3細胞中敲低RP11- 191L9.4的表達后發現，細胞的增殖、遷移和侵襲等能力均受到明顯影響。

1材料和方法

1.1材料

人前列腺癌細胞PC- 3購自上海細胞庫；RP11- 191L9.4 siRNA(干擾RNA)及negative siRNA由上海吉瑪制藥技術有限公司合成；逆轉錄試劑盒(Thermoscientific公司)；實時熒光定量PCR檢測所需SYBR Green染料(Roche公司)；MTT試劑盒(碧云天公司)；DMEM/F- 12培養基、opti- MEM和胎牛血清(Gibco公司)；胰酶(Sigma公司)；LipofectamineTM2000、TRIzol(Invitrogen公司)；Matrigel(BD 公司)；6/24/96孔細胞培養板、transwell小室購自Corning公司。

1.2細胞培養和轉染

在37 ℃、體積分數5%CO2孵箱中用含1%雙抗和10%胎牛血清(fetalbovineserum，FBS)的DMEM/F12培養基培養PC- 3細胞。第1天用不含雙抗的培養基將PC- 3細胞接種于6孔板中，次日當細胞匯合度約為50%時，每孔加入400 μl 配制好的含有lipofectaminTM2000和siRNA的轉染培養基opti- MEM，水平晃勻，在37 ℃、體積分數5%CO2培養箱中孵育4～6 h后吸去舊培養基，每孔加入2 ml完全培養基。RP11- 191L9.4 siRNA正向序列5′- UCAUUGAGAUCAUGGAUUUUU- 3′，反向序列5′- AAAUCCAUGAUCUCAAUGAUU- 3′； negative siRNA正向序列5′- UUCUCCGAACGUGUCACGU TT- 3′，反向序列5′- ACGUGACACGUUCGGAGAATT- 3′。

1.3實時熒光定量聚合酶鏈反應(PCR)檢測轉染后PC- 3細胞lncRNA RP11- 191L9.4的表達量

用TRIzol提取前列腺癌細胞PC- 3的總mRNA，逆轉錄為cDNA，逆轉錄反應條件：42 ℃ 30 min，85 ℃ 5 min，用實時熒光定量PCR試劑盒進行檢測。RP11- 191L9.4上游引物5′- TGTGGCCTCAGCTGAAAGTGAG- 3′，下游引物5′- AGTGTGAATCTGCAGAGCTGGC- 3′；內參基因GAPDH上游引物5′- GAAATCCCATCACCACTT CCAGG- 3′,下游引物5′- GAGCCCCAGCCTTCTCCATG- 3′。實時熒光定量PCR反應條件：94 ℃ 5 min、94 ℃ 15 s、60 ℃ 1 min，40個循環。溶解曲線溫度設定為60～95 ℃，每個樣品設置3個復孔；應用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測特異性。

1.4噻唑藍(MTT)法檢測siRNA對PC- 3細胞增殖的影響

實驗組細胞轉染siRNA，對照組細胞轉染siNC，48 h后胰酶消化，收集細胞，加入完全培養基，調整細胞懸液濃度鋪板到96孔板，實驗組和對照組各設置4行，每行設置5個復孔，每孔細胞調密度至2 000 個·孔-1，體積分數5%CO2、37 ℃孵育，由次日開始加MTT，每天兩組各加1行，連續加4 d。每孔加入20 μl MTT試劑，繼續于培養箱中孵育4 h后逐一吸凈孔內培養液，每孔加入150 μl二甲基亞砜(DMSO)，將96孔板置搖床上低速振蕩10 min后上機檢測。在無細胞的孔中加入DMSO作為調零孔，在酶聯免疫檢測儀OD490 nm處測量各孔的吸光值。

1.5克隆形成實驗檢測細胞增殖活性

將轉染48 h后的實驗組和對照組細胞用胰酶消化，收集細胞，加入完全培養液重懸，計數細胞，以1 000 個·孔-1密度接種于6孔板(實驗組和對照組各3孔)，每孔加入2 ml完全培養液，水平方向晃動培養板使細胞均勻分布。培養7 d后吸去各孔培養基，磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗2次，每孔加1 ml 4%多聚甲醛固定20 min，吸去多聚甲醛，PBS漂洗2次，每孔加入1 ml結晶紫染色液，20 min后吸去結晶紫染色液，將6孔板置于自來水下沖洗，晾干后計算集落數。

1.6transwell遷移實驗檢測細胞遷移

轉染48 h后將實驗組及對照組細胞胰酶消化，收集細胞，用無血清培養基重懸，細胞計數并調整細胞密度至1×106ml-1，取100 μl加入上室，下室所在24孔板加入600 μl完全培養基，37 ℃、體積分數5%CO2、95%飽和濕度培養箱中孵育8 h后用PBS清洗transwell小室后放入24孔板，小室所在24孔板每孔加入600 μl 95%甲醇室溫固定15 min。吸出固定液，24孔板中每孔加入600 μl 0.2%結晶紫染液，室溫作用20 min，PBS洗滌輕洗后顯微鏡下計數穿過濾膜的細胞，同時觀察下層液體中是否有掉落細胞。小室的細胞計數以顯微鏡下5個視野的細胞平均數為準。

1.7Matrigel侵襲實驗檢測細胞侵襲能力

將Matrigel膠置于4 ℃融化后，于冰上與無血清培養基混勻稀釋(稀釋比例為：Matrigel膠∶培養基=1∶8)；將Transwell小室放入24孔板中，在上室內加入200 μl稀釋的Matrigel膠，37 °C、體積分數5%CO2和95%飽和濕度培養箱內孵育1 h，使小室表面形成Matrigel膠涂層；用0.25%的胰酶消化細胞，離心后加入無血清培養基制成單細胞懸液，調整細胞濃度為1×106ml-1；將100 μl細胞懸液加入Transwell小室的上室，小室所在的24孔板加入600 μl完全培養基；將24孔板置于37 ℃、體積分數5%CO2和95%飽和濕度培養箱內培養24 h，95%甲醇固定20 min；PBS洗滌后用0.2%結晶紫染色20 min；PBS洗滌輕洗后顯微鏡下計數穿過濾膜的細胞，同時觀察下層液體中是否有掉落細胞。小室的細胞計數以顯微鏡下5個視野的細胞平均數為準。

1.8統計學處理

2結果

2.1轉染RP11- 191L9.4 siRNA后 PC- 3細胞lncRNA RP11- 191L9.4 的表達

實驗組和對照組分別轉染RP11- 191L9.4 siRNA和negative siRNA，48 h后提取總RNA，逆轉錄為cDNA，qPCR檢測兩組細胞中RP11- 191L9.4的表達。結果顯示，實驗組細胞中RP11- 191L9.4表達水平明顯降低(圖1)，說明RP11- 191L9.4 siRNA能夠有效干涉RP11- 191L9.4的表達，使細胞中RP11- 191L9.4的表達明顯減少。

RP11- 191L9.4 siRNA轉染48 h后進行qPCR檢測，每組設3個復孔，siRNA為實驗組，siNC為對照，2- ΔΔCt為縱坐標

圖1qPCR 檢測PC- 3前列腺癌細胞中RP11- 191L9.4 表達水平的敲低效果

qPCR was used after transfection of RP11- 191L9.4 siRNA,each group had 3 holes,siRNA as experimental group,siNC for comparison,2- ΔΔCtas the ordinate

Fig 1The effect of low expression of RP11- 191L9.4 after the siRNA transfection in PC- 3 cell

2.2轉染RP11- 191L9.4 siRNA對PC- 3細胞增殖能力的影響

通過MTT實驗連續4 d檢測各組細胞的增殖活性，以時間為橫軸、490 nm吸光值為縱軸繪制增殖曲線。與對照組相比，轉染RP11- 191L9.4 siRNA的實驗組PC- 3吸光值明顯降低，說明細胞增殖活性明顯下降，從檢測第2天至第4天差異有統計學意義(t2 d=3.991，P<0.01;t3 d=2.455，P<0.05;t4 d=3.748，P<0.01)。見圖2。

與對照組相比，RP11- 191L9.4被敲低后第 2、3、4天吸光值明顯減少，差異具有統計學意義,P<0.05

圖2RP11- 191L9.4敲低后與對照組PC- 3前列腺癌細胞增殖速度的定量分析

Compared with control group,the absorbance value decreased significantly at the 2，3，4 day in experimental group,the difference was statistically significant (P<0.05)

Fig 2Quantitative analysis of prostate cancer cell proliferation rate of experimental group and controll group

2.3轉染RP11- 191L9.4 siRNA對前列腺癌細胞PC- 3克隆形成能力的影響

克隆形成實驗結果顯示,PC- 3細胞中RP11- 191L9.4表達被敲低后單個細胞形成細胞集落的能力顯著減弱(圖3)，克隆形成實驗和MTT實驗的結果都表明敲低RP11- 191L9.4的表達能夠抑制前列腺癌PC- 3細胞的增殖。

2.4轉染RP11- 191L9.4 siRNA對前列腺癌細胞PC- 3遷移能力的影響

Transwell遷移實驗結果顯示，與對照組相比，轉染RP11- 191L9.4 siRNA的實驗組PC- 3細胞穿過膜的細胞數顯著減少(圖4)，差異有統計學意義(P<0.05)，表明RP11- 191L9.4能夠促進PC- 3細胞的遷移。

2.5轉染RP11- 191L9.4 siRNA對前列腺癌PC- 3細胞侵襲能力的影響

基質凝膠小室侵襲實驗結果顯示，轉染RP11- 191L9.4 siRNA的實驗組PC- 3細胞進入到小室下層的數量明顯減少(圖4)，表明RP11- 191L9.4能夠促進PC- 3細胞的侵襲。

RP11- 191L9.4被敲低后克隆形成數量明顯少于對照組，差異具有統計學意義，aP<0.01

圖3RP11- 191L9.4 敲低與對照組PC- 3前列腺癌細胞平板克隆形成對比

The number of clone formation in experimental group was significantly less than that in the control group,the difference was statistically significant,aP<0.01

Fig 3The comparison of clone formation between experimental group and control group

3討論

前列腺癌是威脅老年男性健康的常見腫瘤之一，其發病率呈逐年上升趨勢，已成為泌尿系統的第2大腫瘤。lncRNA是長度大于200 nt無蛋白編碼能力的長鏈非編碼RNA，其穩定存在于血液、尿液等體液中，并具有組織特異性和疾病特異性。lncRNA可在細胞層次和分子水平調控基因表達，以往研究表明在細胞水平lncRNA與細胞增殖[4]、細胞凋亡[5]、細胞分化[6]、胚胎干細胞的自我更新修復[7]等方面有關；在分子層次，lncRNA和染色質重塑[8]、X染色體失活[9]等有關。在轉錄后水平，可以通過選擇性剪接、加帽加尾等多種方式靶向調控(抑制或促進)目的基因表達[10]。近幾年的研究成果表明，lncRNA與多種惡性腫瘤有著密切的關系[11- 13]。前列腺癌的發生發展過程中也有lncRNA的參與，例如，Prensner等通過比對前列腺癌組織和癌旁組織發現，lncRNA SChLAP1在癌組織中表達上調并可通過對抗SWI/SNF染色質修飾物復合體增加前列腺癌細胞的侵襲及轉移能力[14]；Zhu等研究發現lncRNA H19- miR- 675軸通過靶向調控目的基因TGFBI抑制前列腺癌的轉移[15];Hung等研究認為lncRNA PCGEM1作為c- Myc和雄激素受體的共激活劑促進前列腺癌的發生發展[16]；Luo等研究發現lncRNA MEG3在前列腺癌組織中低表達，并用體內外實驗發現lncRNA MEG3可以抑制細胞的增殖、促進細胞凋亡而最終抑制前列腺癌的發生發展[17]。

轉染RP110191L9.4 被敲低后穿過traswell小室(上)及基質凝膠的細胞數明顯少于對照組，差異具有統計學意義， aP<0.01

圖4RP11- 191L9.4 敲低與對照組NC PC- 3前列腺癌細胞遷移及侵襲對比

The cell number of traversing the matrigel in experimental group was significantly less than that in the control group,the difference was statistically significant,aP<0.01

Fig 4The comparison of migration and invasion between experimental group and control group

RP11- 191L9.4基因位于人類染色體的22q13.31，目前有關長鏈非編碼RNA RP11- 191L9.4在腫瘤中的作用未見報道。本課題組在前期工作研究中發現RP11- 191L9.4在前列腺癌組織中相對表達上調，提示RP11- 191L9.4可能在前列腺癌中發揮類癌基因的作用。本實驗通過RNAi實驗證明了RP11- 191L9.4降低表達能抑制前列腺癌細胞的增殖，說明RP11- 191L9.4可能通過促進增殖參與前列腺癌的形成。通過干涉RP11- 191L9.4的表達，其遷移和侵襲能力減弱，表明RP11- 191L9.4可能促進前列腺癌的轉移，這對于進一步揭示前列腺癌的發生發展及轉移機制具有重要意義。而在本實驗的基礎上進一步探索RP11- 191L9.4發揮作用的分子機制，明確其發揮作用的靶向基因和信號通路，將為前列腺癌的診治提供新的分子標志物及治療靶標。

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Effection of lncRNA RP11- 191L9.4 on the migration and invasion of prostate cancer cell PC- 3

WANG Jing1，HUANG Ye- qing1，XU Bin2，CHEN Ming2

(1.SchoolofMedicine，SoutheastUniversity，Nanjing210009，China; 2.ZhongdaHospital，SoutheastUniversity，Nanjing210009，China)

[Abstract]Objective：To explore the effect of lncRNA RP11- 191L9.4 on the proliferation，migration and invasion ability of prostate cancer PC- 3 cells.Methods：qPCR assay was used to confirm the low expression level of RP11- 191L9.4 after the transfection of RP11- 191L9.4 siRNA.MTT assay and colony- forming unit assay were performed to evaluate the effect of RP11- 191L9.4 knock- down on PC- 3 cell proliferation. Transwell migration assay was used to evaluate the effect of RP11- 191L9.4 knock- down on the migration ability of PC- 3 cells. Matrigel invasion assay was used to evaluate the effect of RP11- 191L9.4 knock- down on the invasion ability of PC- 3 cells. Results：The expression level of RP11- 191L9.4 was significantly knocked down by the transfection of siRNA.MTT assay and colony forming unit assay showed that reducing the expression of RP11- 191L9.4 can significantly weaken the proliferation ability of PC- 3 cells. The result of transwell migration assay indicated that reducing the expression of RP11- 191L9.4 in PC- 3 cells obviously suppressed its migration ability. The result of Matrigel invasion assay demonstrated that reducing the expression of RP11- 191L9.4 significantly suppressed the invasion ability of PC- 3 cells. Conclusion：RP11- 191L9.4 level in PC- 3 cells can be efficiently knocked down with the transfection of RP11- 191L9.4 siRNA， and knock down the expression level of RP11- 191L9.4 can significantly suppress the ability of proliferation，migration and invasion in PC- 3 cells．

[Key words]lncRNA； RP11- 191L9.4; prostate cancer； cell proliferation； cell migration； tumor invasion

[收稿日期]2015- 12- 30[修回日期] 2016- 01- 27

[基金項目]國家自然科學基金(81370849，81300472，81202034)，臨床醫學科技專項——新型臨床診療技術攻關基金(BL2013032)，教育部博士點基金(20120092120071)，江蘇省自然科學基金(BK2012336)，南京市科技發展項目基金(201201053)，東南大學新教師基本科研項目基金(3290002402)資助項目

[作者簡介]王京(1990-)，男，蒙古族，河南南陽人，在讀碩士研究生。E- mail:332319938@qq.com

[通信作者]陳明E- mail:mingchenseu@126.com

[中圖分類號]R737.25; R- 33; R329.25

[文獻標識碼]A

[文章編號]1671- 6264(2016)03- 0305- 06

doi：10.3969/j.issn.1671- 6264.2016.03．003

[引文格式] 王京,黃燁清,許斌,等.長鏈非編碼RNA RP11- 191L9.4促進前列腺癌PC- 3細胞的遷移和侵襲[J].東南大學學報:醫學版,2016,35(3):305- 310.

·論著·