TC- 1癌蛋白高表達促進人BT549乳腺癌細胞遷移

張麗娜，趙虎子，張永臣，趙蕾，王北，萬青，沈傳陸

(東南大學醫學院 病理學與病理生理學系，江蘇 南京　210009)

TC- 1癌蛋白高表達促進人BT549乳腺癌細胞遷移

張麗娜，趙虎子，張永臣，趙蕾，王北，萬青，沈傳陸

(東南大學醫學院 病理學與病理生理學系，江蘇 南京210009)

[摘要]目的:構建甲狀腺癌基因- 1(TC- 1)真核表達質粒，觀察TC- 1癌蛋白高表達對人乳腺癌細胞遷移的影響。方法:用蛋白質印跡方法檢測TC- 1癌蛋白在培養的人MCF- 7和BT549乳腺癌細胞中表達；從MCF- 7細胞中提取總RNA，通過實時PCR(RT- PCR)擴增人TC- 1 cDNA全長開放讀碼框架(ORF)，并插入真核表達載體Flag- pcDNA3.0中構建Flag- TC- 1- pcDNA3.0重組質粒；經限制性內切酶和DNA測序鑒定后，該重組質粒用于轉染BT549細胞，進行蛋白質印跡分析鑒定Flag- TC- 1融合蛋白表達；進行細胞劃痕實驗，觀察TC- 1對BT549細胞遷移的影響。結果:TC- 1蛋白在人MCF- 7乳腺癌細胞中顯著表達，而BT549細胞中表達極低；人MCF- 7乳腺癌細胞TC- 1全長ORF的RT- PCR產物為337 bp；重組質粒Flag- TC- 1- pcDNA3.0經BamH Ⅰ和Xho Ⅰ雙酶切出現特征性的327 bp片段；DNA測序證實TC- 1全長ORF序列正確無誤，以正確的閱讀框架插入Flag- pcDNA3.0載體中。蛋白質印跡結果顯示該重組質粒轉染的BT549細胞表達的Flag- TC- 1融合蛋白可被抗Flag抗體特異性識別，分子質量約為13.6 kDa，符合預期；劃痕實驗結果顯示，高表達TC- 1的BT549細胞遷移性增加。結論:內源性TC- 1蛋白在人BT549乳腺癌細胞中表達極低，Flag- TC- 1融合蛋白高表達促進BT549細胞遷移。

[關鍵詞]甲狀腺癌基因- 1； 乳腺癌細胞； 真核表達； 遷移

甲狀腺癌基因- 1(thyroid cancer- 1，TC- 1)是2000年從乳頭狀甲狀腺癌和正常甲狀腺組織的差異基因中篩選得到的，可以導致甲狀腺細胞惡性轉化[1]，并且是惡性甲狀腺囊腫的標志物[2]。TC- 1定位于8p11.2，其mRNA全長1 327 bp，開放閱讀框321 bp，編碼一種含106個氨基酸的固有無序蛋白(natively disordered protein)；經研究發現，TC- 1在大腸癌[3]、肺癌[4]、舌鱗狀細胞癌[5]和胃癌[6]等腫瘤細胞中也有重要作用，促進細胞的增殖分化，調節細胞的侵襲、轉移。乳腺癌的發展被普遍認為與癌基因的擴增及過表達有密切聯系，有研究發現TC- 1 mRNA在50%的乳腺癌細胞系中表達增加，其過表達能使正常乳腺上皮細胞惡性轉化為腫瘤細胞，但是TC- 1在乳腺癌細胞系中的作用機制尚不明確，對乳腺癌細胞遷移的影響還未見報道。

轉基因通常是指利用一定的載體和導入方法將外源基因導入細胞，使其在靶細胞內表達[7]，轉基因技術為研究癌基因的生物學功能提供了重要基礎。本研究擬構建TC- 1真核表達質粒用于轉染乳腺癌細胞，以觀察TC- 1高表達對乳腺癌細胞相關的生物學功能變化影響，來研究TC- 1的功能及其在乳腺癌發生發展中的作用。

1材料與方法

1.1材料

凝膠回收試劑盒和質粒小量提取試劑盒購于Axygen公司；限制性內切酶(BamHⅠ、XhoⅠ)、T4 DNA連接酶、Trizol、反轉錄試劑盒、PCR試劑盒均購于大連TaKaRa生物有限公司；DNA Marker 和蛋白Marker 購于Fermentas公司；抗TC- 1抗體、抗Flag抗體和辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗兔IgG購于Santa Cruz 公司；增強型ECL發光試劑盒購自Thermo SIENTIFIC公司；大腸桿菌DH5α、質粒Flag- pcDNA 3.0及人MCF- 7和BT549乳腺癌細胞均由本課題組保存。其他常規試劑均為國產分析純。

1.2TC- 1基因片段的RT- PCR擴增

在用Trizol 試劑制備MCF- 7細胞總RNA后進行反轉錄反應，以反轉錄的cDNA為模板，用上游引物(5′TAGGATCCATGAAAGCAAAGCGAAG 3′)和下游引物(5′TGCTCGAGTCAGTGAACTTTGATGG 3′)進行PCR反應，擴增出人TC- 1 cDNA完整開放讀碼框架(open reading frame，ORF)。PCR反應條件為預變性94℃ 2min，1個循環；變性98℃ 10s，退火56℃ 10s， 延伸72℃ 1min，35個循環；總延伸72℃ 7min， 1個循環。將PCR擴增產物經1.2%瓊脂糖凝膠電泳，回收純化。

1.3Flag- pcDNA3.0/TC- 1重組質粒的構建

將回收純化的TC- 1RT- PCR產物用BamH Ⅰ和XhoⅠ雙酶切后，用T4 DNA連接酶與經同樣雙酶切的Flag- pcDNA 3.0載體進行連接，生成Flag- TC- 1融合蛋白真核表達質粒Flag- TC- 1- pcDNA 3.0。將連接產物轉化E.coliDH5a 感受態細胞后置于搖床，37℃、250 r·min-1振蕩培養1 h，涂布于含100μg·ml-1氨芐青霉素的LB細菌培養板，37℃過夜培養。挑取單菌落培養并提取質粒DNA，用BamH Ⅰ和XhoⅠ雙酶切后對陽性克隆進行序列測定。

1.4細胞培養

人MCF7乳腺癌細胞被置于含10%胎牛血清、2nmol·L-1谷氨酰胺、100U·L-1青霉素和100μg·L-1鏈霉素的DMEM(高糖，GIBCO)培養基中；人BT549乳腺癌細胞被置于含10%胎牛血清的RPMI- 1640(GIBCO)培養基中，于體積分數為5%CO2、37℃ 培養，待細胞80%～90%基本融合后傳代培養。

1.5細胞轉染

將對數生長期的細胞以每孔3×105個細胞接種于35mm培養皿或6孔培養板中過夜培養18～20h，使細胞融合度達到90%左右；棄原培養液，重新加入新鮮的DMEM完全培養液1ml，繼續培養0.5～1h；分別用50μl無血清的DMEM培養液稀釋1μg質粒DNA和3μl LipoD293TM后，將LipoD293TM稀釋液加入到質粒DNA稀釋液中，混勻后常溫下孵育15min；將質粒DNA- LipoD293TM混合物滴加到上述含細胞的35mm 培養皿或6孔培養板的孔中，混勻后培養12h；吸去轉染混合液，加入DMEM完全培養液繼續培養18～20h， 然后已轉染的細胞被用于各個實驗。

1.6蛋白質印跡檢測

用冰冷PBS溶液洗轉染后的細胞2遍，加入100μl RIPA細胞裂解液。收集細胞裂解物置冰浴孵育10 min，然后4℃、12 000 g離心10 min，取上清液進行SDS(十二烷基硫酸鈉)- 聚丙烯酰胺凝膠電泳和轉膜。分別用抗TC- 1抗體、抗Flag抗體和抗GAPDH抗體及相應的HRP標記的二抗檢測TC- 1、Flag- TC- 1和GAPDH(作為上樣對照)，然后與增強型化學發光底物反應，以顯示各蛋白條帶。

1.7劃痕實驗

以Flag- pcDNA 3.0空載體質粒為對照，用Flag- TC- 1- pcDNA 3.0轉染BT549細胞，20h后用20μl微量移液器槍頭在培養皿底部作“1”字形劃痕；用37℃預溫的PBS洗細胞3遍以洗去脫落的細胞及其碎片，加入1ml含2%FBS的RPMI 1640培養液，置于37℃、體積分數5%的CO2飽和濕度培養箱中培養，于0、12和24h時間點分別用顯微鏡(×100)觀察并拍攝記錄劃痕邊緣細胞遷移變化。

2結果

2.1內源性TC- 1癌蛋白在人MCF- 7和BT549乳腺癌細胞中的差異性表達

已有研究表明TC- 1 mRNA在約50%的乳腺癌病人癌組織中表達增加[8]，但TC- 1在人MCF- 7和BT549乳腺癌細胞中的表達尚不清楚。我們用抗TC- 1抗體檢測了MCF- 7和BT549細胞中內源性TC- 1癌蛋白表達水平，發現TC- 1蛋白在MCF7細胞中顯著高表達，相反在BT549細胞中表達極低(圖1)，在過度曝光時，可見微弱TC- 1蛋白條帶(結果未顯示)。這些結果表明人MCF- 7和BT549乳腺癌細胞差異性表達內源性TC- 1癌蛋白。

圖1人MCF7和BT549乳腺癌細胞差異性表達內源性TC- 1癌蛋白

Fig 1Differential expression of endogenous TC- 1 oncoprotein in human MCF7 and BT549 breast cancer cells

2.2Flag- TC- 1- pcDNA3.0重組質粒的構建和表達

RT- PCR擴增得到的TC- 1 cDNA完整ORF，經瓊脂糖凝膠電泳后出現1條337 bp 左右的DNA條帶(圖2)，大小與預期相符。將該RT- PCR產物用BamH Ⅰ和XhoⅠ雙酶切后插入經同樣雙酶切的真核表達載體Flag- pcDNA 3.0 質粒中，生成重組質粒Flag- TC- 1- pcDNA 3.0。該質粒經BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切時出現327 bp特征性片段(圖3)。DNA序列測定證實序列無誤(結果未顯示)。

M.DNA分子質量標記；TC- 1.TC- 1 PCR產物

圖2TC- 1的RT- PCR產物

M.DNA ladder；TC- 1.TC- 1 PCR products

Fig 2RT- PCR products of TC- 1

M.DNA分子質量標記；1、2、3.Flag- TC- 1- pcDNA 3.0質粒單克隆菌落的編號

圖3Flag- pcDNA 3.0/TC- 1重組質粒酶切鑒定

M.DNA ladder；1、2、3.number of FLAG- TC- 1- pcDNA3.0 coloniesFig 3Identification of recombinant plasmid Flag- TC- 1- pcDNA 3.0 by restriction enzyme digestion

以Flag- pcDNA 3.0空載體為對照，用Flag- TC- 1- pcDNA 3.0轉染BT549細胞后收集細胞裂解物，用抗Flag抗體進行蛋白質印跡實驗，結果顯示Flag- TC- 1- pcDNA 3.0 轉染細胞在約13.6 kDa蛋白分子質量處出現蛋白表達條帶，符合預期；而空載體轉染的細胞未見蛋白條帶(圖4)。這些結果表明，Flag- TC- 1- pcDNA 3.0重組質粒能在人BT549乳腺導管癌細胞中表達Flag- TC- 1融合蛋白。

圖4Flag- TC- 1融合蛋白在人BT549乳腺導管癌細胞中的表達Fig 4Expression of Flag- TC- 1 fusion protein in human BT549 breast ductal carcinoma cells

2.3高表達TC- 1癌蛋白的人BT549乳腺導管癌細胞遷移性增加

TC- 1高表達能使人正常乳腺上皮細胞惡性轉化為腫瘤細胞，但對乳腺癌細胞遷移性是否有影響還未見報道。我們分別用Flag- pcDNA 3.0空載體和Flag- TC- 1- pcDNA 3.0重組質粒轉染人BT549乳腺導管癌細胞，進行劃痕實驗。結果顯示，在劃痕后12 h空載體轉染的BT549乳腺導管癌細胞的劃痕大小幾乎無明顯變化，而TC- 1轉染乳腺癌細胞的劃痕已縮小近50%；24 h后空載體對照細胞的劃痕大小僅縮小不到1/3，而高表達TC- 1的BT549癌細胞的劃痕已接近消失(圖5)。這些結果表明，TC- 1高表達增強人BT549乳腺導管癌細胞的遷移性。

3討論

研究發現，TC- 1在乳頭狀甲狀腺癌組織中表達增高，并證實過表達TC- 1的正常甲狀腺細胞增殖迅速，無錨定依賴生長良好，較未導入TC- 1的甲狀腺細胞凋亡率明顯降低[9]。自2000年在甲狀腺癌組織中發現TC- 1高表達后[10]，人們發現TC- 1在許多腫瘤組織中都過表達，而且在正常組織中，尤其是心、肝、肺和胎盤也有表達，并參與細胞周期的調控、基因轉錄和翻譯。近幾年的研究表明，TC- 1在胃癌、肺癌等細胞株中，正向調控Wnt/β- 連環蛋白信號傳導通路，上調此信號通路中的許多靶基因，包括血管內皮生長因子、G1/S- 特異性周期蛋白- D1、基質金屬蛋白酶7、c- myc原癌基因等，而這些靶基因編碼多種腫瘤相關蛋白[11]，已經被證實與腫瘤的增殖、侵襲、遷移等行為密切相關。Yang等[8]對7個乳腺癌細胞系及100例乳腺癌組織進行系統的研究，證實了TC- 1等基因定位于8p11.2，該染色體區域在乳腺癌發生發展具有重要作用；TC- 1在人乳腺上皮細胞中具有惡性轉化功能。

2011年St Gallen根據(雌激素受體)ER、(孕激素受體)PR和(人表皮生長因子受體- 2)Her2 3種分子標志物的表達將乳腺癌進行分子分型[12]，發現MCF7細胞是ER、PR和Her2陽性，BT549細胞是ER、PR和Her2 陰性，而三陰性乳腺癌遷移性強，內分泌治療和分子靶向治療無效。本實驗發現，TC- 1在人MCF- 7乳腺癌細胞中高表達，而在人BT549乳腺導管癌細胞中表達極低，這種現象可能是由于MCF7細胞中抑制遷移的細胞學或組織學因素多，BT49細胞中促進遷移的力量比較大導致的。我們用RT- PCR方法從MCF- 7細胞中擴增出TC- 1 cDNA完整ORF，構建了TC- 1真核表達質粒Flag- TC- 1- pcDNA 3.0，用該質粒轉染BT549細胞后發現，TC- 1高表達增強人乳腺癌細胞遷移性。

圖5高表達TC- 1癌蛋白的人BT549乳腺癌細胞劃痕實驗分析

Fig 5Scratch- wound assays of human BT549 breast cancer cells overexpressing TC- 1 protein

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TC- 1 overexpression stimulates migration of human BT549 breast cancer cells

ZHANG Li- na，ZHAO Hu- zi，ZHANG Yong- chen，ZHAO Lei，WANG Bei，WAN Qing，SHEN Chuan- lu

(DepartmentofPathologyandPathophysiology，MedicalSchoolofSoutheastUniverstiy，Nanjing210009，China)

[Abstract]Objective： To investigate impact of thyroid cancer- 1(TC- 1) overexpression on the migration of human breast cancer cells after construction of the TC- 1 eukaryotic expression plasmid. Methods: Western blot was used to detect the TC- 1 expression in the cultured human MCF- 7 and BT549 breast cancer cells. Subsequently， the total RNA was extracted from the MCF- 7 cells， and the full length open reading frame(ORF) of TC- 1 cDNA was amplified by RealTime- PCR(RT- PCR) and then inserted into the eukaryotic expression vector Flag- pcDNA3.0 to generate recombinant plasmid Flag- TC- 1- pcDNA3.0. After identification by restriction enzyme digestion and DNA sequencing， the recombinant plasmid was transfected into the BT549 cells. The expression of Flag- TC- 1 fusion protein in the transfected cells was monitored by using Western blot. Scratch- wound assays were performed to observe impact of TC- 1 overexpression on migration of the BT549 cells. Results: Human MCF- 7 breast cancer cells expressed TC- 1 protein at a high level while the protein level was extremely low in BT549 cells. The RT- PCR product of TC- 1 from the MCF- 7 cells was 337 bp， which was consistant with the full length ORF of the gene. The recombinant plasmid Flag- TC- 1- pcDNA3.0 was identified with double digestion using BamH Ⅰ and Xho Ⅰ， in which a characteristic fragment of 327 bp appeared， and the full length ORF of TC- 1 cDNA sequence was confirmed by direct automated sequencing. After the BT549 cells were transfected with the recombinant plasmid， Flag- TC- 1 fusion protein expressed in the cells was specifically recognized by anti- Flag antibody. As expected， the molecular weight of the fusion protein is about 13.6 kDa. Then， the scratch- wound assays were performed in the transfected cells and showed that overexpression of TC- 1 increased migration of the BT549 cells. Conclusions: The endogenous TC- 1 protein level is extremely low in human BT549 breast cancer cells and overexpression of Flag- TC- 1 fusion protein stimulates migration of the cells．

[Key words]thyroid cancer- 1 gene; breast cancer cells; eukaryotic expression； migration

[收稿日期]2015- 12- 30[修回日期] 2016- 02- 05

[基金項目]國家自然科學基金資助項目(81272261)

[作者簡介]張麗娜(1988-)，女，山東聊城人，在讀碩士研究生。E- mail：imzhanglina@126.com

[通信作者]沈傳陸E- mail:shencl37@163.com

[中圖分類號]R736.1; R737.9

[文獻標識碼]A

[文章編號]1671- 6264(2016)03- 0314- 06

doi：10.3969/j.issn.1671- 6264.2016.03．005

[引文格式] 張麗娜,趙虎子,張永臣,等.TC- 1癌蛋白高表達促進人BT549乳腺癌細胞遷移[J].東南大學學報:醫學版,2016,35(3):314- 319.

·論著·