乳腺癌腦轉移細胞系靶向肽體的表達與特異性鑒定

楊姣姣，張瑩，沈宇清，王潔，付波，張建瓊

(東南大學醫學院 病原生物學與免疫學系，江蘇 南京　210009)

乳腺癌腦轉移細胞系靶向肽體的表達與特異性鑒定

楊姣姣，張瑩，沈宇清，王潔，付波，張建瓊

(東南大學醫學院 病原生物學與免疫學系，江蘇 南京210009)

[摘要]目的：構建pFUSE- hIgG2- Fc2- BRBP1真核表達質粒表達BRBP1- Fc肽體，并驗證其與乳腺癌腦轉移細胞系(231- BR)的結合特異性。方法：合成帶有EcoRⅠ、NcoⅠ酶切位點的腦轉移性乳腺癌特異性肽BRBP1片段，利用該雙酶切位點將其定向插入pFUSE- hIgG2- Fc2質粒，構建真核表達質粒pFUSE- hIgG2- Fc2- BRBP1。將測序正確的重組質粒轉染至293T細胞真核表達BRBP1- Fc肽體，用蛋白質印跡實驗驗證蛋白表達，酶聯免疫吸附試驗、細胞免疫熒光等方法證實BRBP1- Fc肽體與231- BR細胞結合特異性。結果：成功構建重組質粒pFUSE- hIgG2- Fc2- BRBP1，蛋白質印跡法檢測到BRBP1- Fc肽體的表達，分子質量約為37 kDa，并且證實BRBP1- Fc肽體與231- BR細胞特異性結合。結論：成功構建了真核表達重組質粒pFUSE- hIgG2- Fc2- BRBP1,表達了BRBP1- Fc肽體，并鑒定了其與231- BR細胞的結合特異性。

[關鍵詞]肽體； 真核表達； 乳腺癌； 腦轉移

自1989年構建CD4- Fc融合蛋白來阻止人類免疫缺陷病毒(HIV)攻擊T細胞以來，Fc融合蛋白的應用得到越來越多的關注[1]。Fc融合蛋白是由肽或蛋白與免疫球蛋白(IgG)的Fc段鉸鏈區融合而成，最早由Amgen公司命名為肽體。肽體整合了肽或蛋白的固有功能以及IgGFc段的結合特性，具有重要的生物學功能。

我們在前期工作中利用專一性腦轉移乳腺癌細胞系231- BR[2]，通過噬菌體展示肽庫全細胞篩選技術獲得與靶細胞特異性結合的肽BRBP1[3]，在充分驗證其結合特異性的基礎上，利用該肽進行了分子成像和靶向遞送抗腫瘤藥物的研究，結果均顯示出良好的成像及治療效果[4]。在此基礎上本實驗利用基因重組技術構建 pFUSE- hIgG2- Fc2- BRBP1真核表達載體[5]，表達BRBP1- Fc肽體并鑒定其與231- BR細胞的結合特異性，為尋找BRBP1肽的受體以及進一步研究BRBP1的生物學功能奠定基礎。

1材料與方法

1.1菌株、細胞和質粒

大腸桿菌DH5α 感受態為作者所在實驗室制備，293T細胞、231- BR、MCF- 7乳腺癌細胞系及pFUSE- hIgG2- Fc2質粒為本實驗室保存。

1.2試劑

T4 DNA連接酶和限制性內切酶(EcoRⅠ、NcoⅠ)購于NEB 公司；胎牛血清 (FBS)、DMEM 培養基購自Gibco 公司；多聚甲醛 (PFA)、DAPI 核酸染料購自Sigma- Aldrich 公司；胰蛋白酶購自AMRESCO 公司；瓊脂粉購自OXOID 公司；牛血清白蛋白(BSA)購自AMRESCO公司；引物合成、DNA Polymerase在上海捷瑞公司；DNA Marker購自TaKaRa公司；DNA測序在上海華大基因有限公司；質粒提取試劑盒購自美國AXYGEN公司；DNA電泳凝膠回收試劑盒購自TransGen Biotech公司；胰蛋白胨購自OXOID 公司；Lipofectamine?2000轉染試劑購自Invitrogen公司；小鼠抗人Fc單抗購自Fitzgerald公司；超濾管購自Merck Millipore公司。其余未特殊注明的試劑均為國產分析純。

1.3設計與合成目的片段

合成帶有EcoRⅠ、NcoⅠ酶切位點的BRBP1目的片段，正義鏈序列為5′- AATTCGGGTGGAGGTATGTAT CCTTGGACGGAGCCTAGTTATCTTTCTAATGGTGGAGG TTCGCC- 3′，反義鏈序列為5′- CATGGGCGAACCTCCA CCATTAGAAACATAACTATTCTCCGTCCAAGACTACAT ACCTCCACCCG- 3′。將二者等比例混合均勻，于100 ℃水浴鍋中變性10 min后自然冷卻至室溫。

1.4構建pFUSE- hIgG2- Fc2- BRBP1表達質粒

將pFUSE- hIgG2- Fc2載體與合成的BRBP1目的片段分別用EcoRⅠ、NcoⅠ雙酶切，凝膠回收純化產物。將兩個片斷用T4 DNA連接酶16 ℃連接過夜，然后將連接產物轉化到大腸桿菌DH5α 中，37 ℃培養過夜。挑取單個菌落接種于含博來霉素的LB培養基中，37 ℃振蕩過夜。用質粒試劑盒抽提質粒，用EcoRⅠ、NcoⅠ雙酶切初步鑒定外源基因的插入，同時質粒DNA送上海華大基因有限公司進行測序分析。

1.5pFUSE- hIgG2- Fc2- BRBP1重組質粒瞬時轉染293T細胞系

用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養基培養293T細胞，細胞鋪于6孔板至70%～80%融合，按照Invitrogen公司提供的Lipofectamine?2000 Transfection Reagent試劑說明書進行轉染操作。將重組質粒以及空載分別轉染293T細胞，后者所表達的Fc蛋白作為陰性對照。

為了提高建筑的防水效果，避免屋頂和墻壁上的水接觸后出現裂縫和漏水，建筑施工企業在進行防水工作時需要再次創新，提高材料的防水效果。目前，我國房屋施工中的屋面防水工程采用聚合物水泥地基復合涂料施工技術，有效實現了技術創新，提高了房屋墻體和屋面的防水性能。

1.6蛋白收集與蛋白質印跡法鑒定

轉染6 h后棄掉細胞培養基換成不含FBS的DMEM進行培養，48 h后收集細胞上清。用超濾管將上清濃縮至300 μl左右，取10 μl用于蛋白質印跡鑒定。將濃縮蛋白經聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS- PAGE)分離，然后轉至聚偏二氟乙烯膜(PVDF)上，用 5%BSA常溫封閉2 h，加入鼠抗人Fc 抗體(1∶1 000)，4 ℃過夜，TBST洗膜5次，每次8 min，加入辣根過氧化物酶標記的抗鼠 IgG二抗(1∶5 000)，室溫孵育1 h，TBST洗膜5次，每次8 min。ECL顯色觀察結果。

1.7ELISA

用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養基培養231- BR細胞、MCF- 7細胞，細胞鋪于96孔板至80%融合時分別加Fc蛋白、BRBP1- Fc蛋白和稀釋10、100倍的蛋白孵育，每個濃度各3個復孔，37 ℃孵育2 h。加入HRP- 兔抗人IgG Fc抗體(1∶500)，37 ℃孵育1 h。加入100 μl·孔-1TMB 顯色10 min，加入2 mol·L-1H2SO4終止反應，用酶標儀檢測OD450吸光度。

1.8細胞免疫熒光競爭抑制實驗

將細胞按 5×104孔-1密度接種于24 孔板(內置細胞爬片)，培養至70%～80%融合；加入熒光標記肽BRBP1- (5- TAMRA) 和BRBP1- Fc蛋白的混合物，保持熒光肽濃度不變(5 μmol·L-1)，BRBP1- Fc蛋白濃度梯度增加(5×10-6、5×10-5、5×10-4、5×10-3、5×10-2μmol·L-1)37 ℃，30 min；加入4% PFA，室溫固定20 min；DAPI 進行細胞核染色，封片觀察。

1.9統計學處理

應用SPSS 19軟件包進行統計分析。實驗至少重復3次，定量數據用平均值±標準差表示。采用單因素方差分析(one- way ANOVA)進行統計分析，P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1BRBP1- Fc重組質粒的構建及鑒定

重組質粒pFUSE- hIgG2- Fc2- BRBP1用EcoRⅠ、NcoⅠ雙酶切得到約4 200 bp條帶(BRBP1大小48 bp，片段過小，故不能從圖中看見)，如圖1示，與預期結果相符。經過測序分析，與NCBI- Blast比對可知序列正確，構建成功。

M.上海捷瑞公司rDL10004- 100；BRBP1- Fc.重組質粒pFUSE- hIgG2- Fc2- BRBP1

圖1重組質粒pFUSE- hIgG2- Fc2- BRBP1酶切分析

M.Shanghai Generay Biotech CO. (rDL10004- 100)；BRBP1- Fc.recombinant plasmid pFUSE- hIgG2- Fc2- BRBP1

Fig 1Restriction enzyme digestion of the recombinant plasmid pFUSE- hIgG2- Fc2- BRBP1

2.2蛋白質印跡法檢測蛋白表達

分別將pFUSE- hIgG2- Fc2空載和pFUSE- hIgG2- Fc2- BRBP1重組質粒轉染至293T細胞，收集上清蛋白，使用抗Fc單抗鑒定肽體的表達。如圖2示，Fc蛋白大小約35 kDa，BRBP1- Fc蛋白大小約37 kDa，表明構建的真核表達質粒在293T細胞中表達。

2.3BRBP1- Fc蛋白與231- BR 細胞系結合特異性鑒定

2.3.1ELISA方法檢測結合特異性從前期實驗結果可知，BRBP1與腦轉移性乳腺癌細胞231- BR細胞

M.Fermentas公司蛋白分子質量標記；control.無任何轉染質粒的細胞上清；Fc.轉染pFUSE- hIgG2- Fc2空質粒的上清；BRBP1- Fc.轉染pFUSE- hIgG2- Fc2- BRBP1重組質粒的上清

圖2蛋白質印跡法檢測Fc蛋白和BRBP1- Fc蛋白的表達

M.Protein ladder from Fermentas; control.cell supernatant without transfection; Fc.cell supernatant transferred with plasmid pFUSE- hIgG2- Fc2; BRBP1- Fc.cell supernatant transferred with recombinant plasmid pFUSE- hIgG2- Fc2- BRBP1

Fig 2Western blotting analysis of Fc protein and BRBP1- Fc peptibody

特異性結合，與自發轉移潛能很低的乳腺癌細胞系MCF- 7細胞不結合[3]。本實驗利用ELISA方法檢測BRBP1- Fc肽體和231- BR、MCF- 7細胞的結合情況。如圖3所示，與對照組Fc蛋白相比，BRBP1- Fc肽體和231- BR細胞呈現特異性結合(1.118±0.08vs. 0.346±0.097，P<0.01);與MCF- 7細胞相比，BRBP1- Fc肽體和231- BR細胞呈現特異性結合 (1.118±0.08vs. 0.360±0.059，P<0.01)。并且，BRBP1- Fc肽體與231- BR呈現濃度依賴性的結合。以上結果均表明，BRBP1- Fc蛋白保留了BRBP1的結合特異性，即與231- BR細胞特異性結合，與MCF- 7細胞不結合。

2.3.2競爭免疫熒光法檢測結合特異性通過BRBP1- Fc肽體競爭BRBP1- (5- TAMRA)與231- BR細胞的結合，檢測肽體和231- BR細胞的結合特異性。如圖4所示，在熒光肽濃度不變的情況下，隨著肽體濃度的升高熒光信號逐漸減弱，這表明BRBP1- Fc肽體可有效競爭抑制BRBP1- (5- TAMRA)與231- BR細胞的結合。

3討論

低分子質量多肽在疾病的診斷、治療等生物醫學研究中具有重要的應用價值，多肽分子由于其分子質量小、組織滲透性好、免疫原性弱和半衰期短等特點使其成為構建分子影像探針的良好選擇。基于靶向性多肽構建的分子探針可用于人體光學分子成像、磁共振分子成像等多種成像模式。例如，Sturm等將靶向性多肽ASY連接熒光基團FITC后用于人食管癌熒光分子成像[6]；Pilch等將肽段偶聯Gd 劑構建磁共振分子

aP<0.05

圖3ELISA方法檢測BRBP1- Fc肽體和231- BR細胞的特異性結合

Fig 3ELISA analysis of binding specificity of BRBP1- Fc peptibody with 231- BR cells

圖4細胞免疫熒光試驗檢測BRBP1- Fc肽體和231- BR細胞的特異性結合

Fig 4Immunofluorescence analysis of binding specificity of BRBP1- Fc peptibody with 231- BR cell

成像探針CREKA- dL- (DOTA- Gd)，成功用于人的前列腺癌的T1加權成像及動脈粥樣硬化斑塊成像[7]。除成像之外，靶向多肽分子還可用于人類疾病治療。作為胰高血糖素樣肽- 1受體的激動劑(Byetta?， Amylin Pharmaceuticals， Inc.)治療2型糖尿病；作為促性腺激素受體的激動劑(Zoladex?， AstraZeneca; Lupron?， Abbott)來治療前列腺癌和子宮內膜異位癥[1]。盡管如此，由于肽屬于小分子物質，容易被分解代謝，分子半徑小于腎小球濾過膜孔徑，可被快速降解排出體外，嚴重影響了多肽在生物醫學領域的應用。針對這一不足，目前已研發出很多方法來提高肽的穩定性及藥代動力學特征[8]，其中就包括將肽與IgG的Fc片段融合表達，也就是表達肽體，在保持多肽結合特異性的基礎上提高其在體內的半衰期，降低腎清除率[9]。此外，融合有Fc段的肽體可以和免疫細胞表面的Fc受體相互作用，繼而調動免疫細胞的效應功能，對疾病的治療和疫苗的研發尤為重要[10]。總之，從生物物理角度來講，親水性的IgG- Fc片段增加了肽體的溶解性、穩定性；多肽的二聚體結構使其親合力也明顯增加；從技術上來看，肽體可通過protein- G/A親和層析，簡單、有效地純化以利于后續大量生產。至2011年，已經有6種基于肽體的藥物成功上市，有4種藥物正處于臨床3期實驗階段，還有許多其它藥物處于臨床不同階段研究當中[11]。

乳腺癌作為一種嚴重危害中國女性健康的惡性腫瘤，患病率和死亡率均居全球女性惡性腫瘤首位。乳腺癌是引發腦轉移的第2位實體惡性腫瘤，乳腺癌腦轉移的發生率占轉移性乳腺癌病例的10% ～16%。隨著醫療技術的發展，乳腺癌轉移灶的治療方法已有很大進步，但是腦部轉移灶的治療仍然存在很多難以解決的問題，這類患者的生存期中位數很短，通常診斷后1年死亡率達80%。目前缺乏理想的分子標志物用于臨床預測、診斷、治療乳腺癌腦轉移[12]。

本實驗室前期通過噬菌體篩庫技術獲得腦轉移乳腺癌細胞系特異性結合多肽BRBP1，通過體內、外試驗均證實該多肽和231- BR細胞特異性結合，基于BRBP1肽構建的近紅外熒光分子成像探針可實現腦轉移性乳腺癌皮下移植瘤模型鼠腫瘤活體近紅外熒光成像，基于BRBP1 肽構建BRBP1- TAT- KLA 復合肽可顯著增強該復合肽的體內抗腫瘤作用，抑制乳腺癌生長及腦轉移灶的形成。本研究中我們利用DNA重組技術成功表達了BRBP1- Fc肽體，并用ELISA、細胞免疫熒光競爭抑制實驗驗證BRBP1- Fc肽體仍具有BRBP1的特性，即和231- BR細胞特異性結合，為尋找BRBP1的受體以進一步探討其生物學功能，并擴展其在體內外的應用范圍奠定了良好基礎。

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The expression and characterization of peptibody targeting to human brain metastatic breast cancer cells

YANG Jiao- jiao，ZHANG Ying，SHEN Yu- qing，WANG Jie，FU Bo，ZHANG Jian- qiong

(DepartmentofMicrobiologyandImmunology，MedicalSchoolofSoutheastUniversity，Nanjing210009，China)

[Abstract]Objective：To construct eukaryotic expression vector of pFUSE- hIgG2- Fc2- BRBP1 and identify its recombinant protein expression and specific binding with 231- BR cells. Methods：BRBP1 sequence with EcoRⅠ， NcoⅠenzymes was synthesized by gene company and subcloned into pFUSE- hIgG2- Fc2 vector. After the region was sequenced， the plasmid was transfected into 293T cell line. The expression of the recombinant plasmid in 293T cells was proved by Western blotting.The specific binding was observed by enzyme linked immunosorbent assay and immunofluorescence method. Results：BRBP1 had been constructed into expression vector pFUSE- hIgG2- Fc2 successfully. The expression of BRBP1- Fc fusion protein with a molecular weight 37 kDa was detected by Western blotting. The binding specificity with 231- BR cell was also identified. Conclusion：We have successfully constructed the recombinant plasmid (pFUSE- hIgG2- Fc2- BRBP1) which was expressed in 293T cells and had high binding specificity with 231- BR cell．

[Key words]peptibody; eukaryotic expression; breast cancer; brain metastasis

[收稿日期]2015- 12- 25[修回日期] 2016- 01- 31

[基金項目]國家自然科學基金資助項目(81371609)

[作者簡介]楊姣姣(1989-)，女，山西翼城縣人，在讀碩士研究生。E- mail：15805158176@163.com

[通信作者]張建瓊E- mail：zhjq@seu.edu.cn

[中圖分類號]R737.9; R- 33

[文獻標識碼]A

[文章編號]1671- 6264(2016)03- 0322- 05

doi：10.3969/j.issn.1671- 6264.2016.03．007

[引文格式] 楊姣姣,張瑩,沈宇清,等.乳腺癌腦轉移細胞系靶向肽體的表達與特異性鑒定[J].東南大學學報:醫學版,2016,35(3):322- 326.

·論著·