miRNA- 30c及其靶基因MTA- 1在子宮內膜癌裸鼠皮下移植瘤中的作用

孔祥怡，周懷君

(南京大學醫學院附屬鼓樓醫院 婦產科，江蘇 南京　210008)

miRNA- 30c及其靶基因MTA- 1在子宮內膜癌裸鼠皮下移植瘤中的作用

孔祥怡，周懷君

(南京大學醫學院附屬鼓樓醫院 婦產科，江蘇 南京210008)

[摘要]目的：探討過表達miRNA- 30c對子宮內膜癌裸鼠皮下移植瘤生長的影響。方法：應用子宮內膜癌Ishikawa細胞系建立子宮內膜癌裸鼠皮下移植瘤模型，予裸鼠皮下移植瘤內多點注射miRNA- 30c前體表達質粒，并以陰性質粒及PBS為對照。測量移植瘤體積，計算腫瘤生長抑制率；熒光定量PCR技術檢測移植瘤組織miRNA- 30c表達水平；蛋白質印跡技術檢測移植瘤組織MTA- 1蛋白表達水平；免疫組化技術檢測移植瘤組織E- cadherin表達及微血管密度(MVD)。結果：成功建立子宮內膜癌裸鼠皮下移植瘤模型，miRNA- 30c質粒治療明顯抑制腫瘤生長，抑制率為(46.98±5.13)%(P<0.01)；上調移植瘤組織中miRNA- 30c的表達(P<0.05)，下調MTA- 1蛋白表達(P<0.05)，下調移植瘤組織MVD(P<0.05)，上調移植瘤組織E- cadherin表達(P<0.05)。結論：過表達miRNA- 30c可以通過下調MTA- 1表達明顯抑制子宮內膜癌裸鼠皮下移植瘤的生長。

[關鍵詞]miRNA- 30c； 子宮內膜癌； 裸鼠； 移植瘤

微小RNA(miRNA)是一類廣泛存在于真核細胞中的由內源性基因編碼的長度為18～25個核苷酸的非編碼單鏈RNA，不僅參與胚胎早期發育、細胞增殖分化、細胞凋亡等正常生命活動[1]，而且可以通過調控細胞的增殖、代謝、分化以及凋亡等行為影響腫瘤的發生發展及侵襲轉移[2]。女性生殖道惡性腫瘤之一的子宮內膜癌近年來發病率在世界范圍內呈持續上升趨勢，在西方國家已經成為發病率最高的婦科腫瘤[3]。子宮內膜癌與miRNA的相關研究逐漸增多，目前有研究證實miR- 30c[4]以腫瘤轉移相關基因1(MTA- 1)為靶基因，上調miR- 30c(miR- 30c)表達可以下調Ishikawa及HEC- 1B細胞系中靶基因mRNA及蛋白質的表達，抑制細胞增殖及遷移侵襲能力[4- 5]。本實驗通過構建子宮內膜癌裸鼠皮下移植瘤模型探討過表達miR- 30c在動物體內對于移植瘤生長的影響，進一步探究miR- 30c在子宮內膜癌中的作用。

1材料與方法

1.1材料

子宮內膜癌Ishikawa細胞株由北京大學醫學院魏麗惠教授惠贈。BALB/c nunu雌性裸鼠18只，14～15周齡，購于南京大學動物模式中心[許可證號：SCXK(蘇)2009- 0017]，由鼓樓醫院動物房飼養，SPF級。DMEM高糖培養基、胎牛血清(GIBCO公司)，miR- 30c前體表達質粒(pRNAT- CMV3.2- Neo- miR- 30c)及陰性質粒(pRNAT- CMV3.2- neg)(GeneScript公司)，質粒大提試劑盒(Tiangen公司)，LipofectamineTM 2000(Invitrogen公司)，MTA- 1一抗(ab50263)(Abcam公司)，GAPDH一抗(Bioworld Technology公司)，山羊抗小鼠HRP標記抗體(Bioworld Technology公司)，兔抗山羊免疫組化抗體(武漢博士德公司)，PrimeScript? RT reagent Kit、SYBR? RT reagent Kit(Takara公司)。

1.2方法

1.2.1Ishikawa細胞的培養及裸鼠皮下移植瘤模型的建立在37 ℃、體積分數為5%的 CO2、飽和濕度條件下，于含 10 % 胎牛血清的DMEM高糖培養基中培養Ishikawa細胞，將處于對數期生長的細胞常規胰酶消化，1 500 r·min-1離心5 min收集細胞。PBS重懸計數，調整細胞濃度為5×107個·ml-1。每只裸鼠右側肩胛區皮下注射細胞懸液200 μl，注射后觀察皮下出現局部包塊，無出血、破潰。

1.2.2質粒的擴增及提取miR- 30c前體表達質粒(pRNAT- CMV3.2- Neo- miR- 30c)以及陰性質粒(pRNAT- CMV3.2- Neo)由GeneScript公司構建合成，并轉化大腸桿菌。將1 ml含有質粒的大腸桿菌菌液加入4 ml LB培養基中于搖床上(37 ℃180 r·min-1)搖至渾濁，再在100 ml LB培養基中擴大培養，搖菌過夜至渾濁。應用質粒大提試劑盒(Tiangen公司)按照說明書提取質粒，并用紫外分光光度計測質粒DNA濃度。

1.2.3荷瘤裸鼠分組治療及處理待腫瘤體積到60 mm3時隨機分為miR- 30c治療組、miR- N對照組及PBS對照組3組，每組6只。質粒與LipofectamineTM 2000按質量體積比1∶2混合，以Opti- MEM稀釋至體積為150 μl，并以150 μl PBS為空白治療，分別瘤內多點注射，每3 d 1次，共7次。期間每天觀察裸鼠一般狀況，記錄各組裸鼠的進食、活動反應、皮膚毛發情況，每3 d稱量體重1次并測量皮下移植瘤長、短徑，計算體積[體積(mm3)=長徑(mm)×短徑2(mm)×1/2]。末次治療后3 d脫頸處死裸鼠，剝離腫瘤，測量腫瘤體積、質量，計算腫瘤生長抑制率[抑瘤率(%)=(1-治療組平均瘤體體積/空白對照組平均瘤體體積)×100%]。

1.2.4熒光定量PCR(Realtime- PCR)檢測腫瘤組織miR- 30c表達水平用Trizol法提取移植瘤組織中的總RNA，紫外分光光度計測定 RNA 濃度，取2 μg總RNA逆轉錄成cDNA。再取2 μg cDNA進行實時熒光定量PCR反應，擴增條件：95 ℃ 30 s，1個循環；95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，40個循環。引物序列如下：microRNA- 30c(RT)5′- GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATT CGCACTGGATACGACGCTGA- 3′，microRNA- 30c(FW)5′- GCCGCTGTAAACATCCTACACT- 3′，microRNA- 30c(RW)5′- GTGCAGGGTCCGAGGT- 3′，U6(FW)5′- CT CGCTTCGGCAGCACA- 3′，U6(RW)5′- AACGCTTCACG AATTTGCGT- 3′。相對表達量采用公式RQ=2- △△Ct，Ct是熒光達到熒光閾值的循環數，△△Ct=(Ct目的基因-Ct管家基因)實驗組-(Ct目的基因-Ct管家基因)對照組。

1.2.5蛋白質印跡法檢測移植瘤組織MTA- 1蛋白表達水平應用RIPA蛋白裂解液提取移植瘤組織中的總蛋白，BCA蛋白測定試劑盒測定總蛋白濃度，上樣量50 μg。10%聚丙烯酰胺凝膠電泳后將蛋白轉移至PVDF膜， 用10%脫脂奶粉封閉2 h。分別加入MTA- 1一抗(1∶500)和GAPDH一抗(1∶10 000)4 ℃過夜后室溫孵育4 h。TBST漂洗6次(5、5、10、10、15、15 min)后加入二抗(1∶10 000)室溫孵育2 h，TBST漂洗6次(5、5、10、10、15、15 min)。ECL試劑顯色，暗室中進行 X 線膠片曝光，拍照光密度掃描條帶，檢測各組中MTA- 1和 GAPDH 所對應條帶的A值，對AMTA- 1/AGAPDH的值進行統計學分析。

1.2.6免疫組化檢測移植瘤組織相應蛋白的表達石蠟切片常規處理至抗原修復,5%BSA封閉20 min，vWF、E- cadherin一抗4 ℃過夜孵育，PBS沖洗3次后滴加生物素標記的二抗，37 ℃孵育30 min后DAB試劑顯色，蘇木素復染后封片。針對vWF抗體染色行微血管密度(MVD)計數，具體方法即先在40倍鏡下觀察整張切片的血管分布情況，選擇切片中棕黃顆粒最密集的3個區域(即“熱點”)，在200倍鏡下計數每個區域中vWF陽性細胞，求其平均值。針對E- cadherin抗體染色于400倍光鏡下隨機取5個視野對陽性染色進行觀察，計算E- cadherin陽性染色細胞的百分率。

1.3統計學處理

2結果

2.1過表達miR- 30c抑制裸鼠移植瘤生長

成功建立裸鼠皮下移植瘤模型，種瘤后7～10 d皮下移植瘤逐漸形成，待14 d左右腫瘤體積約60 mm3后開始不同的干預治療。治療過程中3組裸鼠在負瘤初期一般狀態逐漸變差，隨著腫瘤增長及治療次數增加治療組裸鼠一般狀態逐漸穩定，而兩對照組裸鼠一般狀態繼續變差，出現消瘦、腹瀉等不良反應，實驗結束時全部裸鼠存活。治療結束后3組裸鼠皮下移植瘤體積均較前有所增長，但在第3次治療后治療組裸鼠皮下移植瘤的增長速度明顯受到抑制(圖1)，在第7次治療后3 d處死裸鼠獲得離體移植瘤標本，測量其體積及質量發現治療組移植瘤體積及質量均明顯小于兩對照組(圖2、表 1)。通過以上實驗結果證實miR- 30c質粒可以有效抑制裸鼠皮下移植瘤增長。

2.2移植瘤組織中miR- 30c的表達

成功建立裸鼠皮下移植瘤模型后分組對其進行瘤內注射治療，末次治療后3 d脫頸處死裸鼠，剝離腫瘤，用Trizol法提取移植瘤組織中的總RNA，紫外分光光度計測定RNA濃度，取2 μg總RNA逆轉錄成cDNA進行Realtime- PCR實驗。實驗結果顯示miR- 30c治療組移植瘤組織中miR- 30c表達明顯高于其他兩組(圖3)，提示miR- 30c質粒瘤內注射治療能夠上調移植瘤組織中miR- 30c表達。

aP<0.05，bP<0.01

圖13組裸鼠皮下移植瘤體積增長趨勢

Fig 1The growth of xenograft in three groups

圖2末次治療后3組裸鼠皮下移植瘤離體狀態

Fig 2The xenograft after treatment in three groups

表1 末次治療后3組裸鼠皮下移植瘤體積、質量及抑瘤率

Tab 1The volume， weight of xenograft and inhibitory rate in three groups after the last treatment

組 別移植瘤體積/mm3移植瘤質量/g抑瘤率/%miR-30c治療組534.60±26.18a0.67±0.03a46.98±5.13miR-N對照組872.32±74.601.09±0.0913.41±7.04PBS對照組1007.48±51.091.13±0.06—

a 與對照組比，P<0.01

2.3移植瘤組織中MTA- 1蛋白的表達

成功建立裸鼠皮下移植瘤模型后分組對其進行瘤內注射治療，末次治療后3 d脫頸處死裸鼠，剝離腫瘤，應用RIPA蛋白裂解液提取移植瘤組織中的總蛋白，BCA蛋白測定試劑盒測定總蛋白濃度，上樣量50 μg進行蛋白質印跡實驗。實驗結果顯示，miR- 30c治療組移植瘤組織中MTA- 1蛋白表達明顯低于其他兩組。移植瘤組織中miR- 30c表達后可以明顯下調移植瘤組織中MTA- 1蛋白表達。見圖4。

aP<0.05

圖3各組移植瘤組織中miR- 30c表達水平

Fig 3The miR- 30c expression of xenograft in three groups

aP<0.05

圖4各組裸鼠移植瘤組織MTA- 1蛋白相對表達

Fig 4The relative MTA- 1 expression of xenograft in three groups

2.4移植瘤組織中MVD及E- cadherin蛋白的表達

對各組裸鼠移植瘤組織進行免疫組化實驗，針對vWF抗體染色行MVD計數，結果顯示miR- 30c治療組腫瘤組織中vWF表達較其他兩組表達減弱，MVD減少，提示miR- 30c治療可以下調移植瘤組織中vWF蛋白表達，抑制新生血管形成。針對E- cadherin抗體染色結果顯示在miR- 30c治療組中E- cadherin蛋白細胞表達陽性率明顯高于其他兩組(圖5、表2)。綜合以上實驗結果提示，miR- 30c過表達可以抑制移植瘤血管形成及上皮-間質轉化。

圖5各組移植瘤組織中MVD及E- cadherin蛋白表達情況

Fig 5The MVD and E- cadherin expression of xenograft in three groups

表2各組移植瘤組織中MVD及E- cadherin蛋白表達情況

Tab 2The MVD and E- cadherin expression of xenograft in three groups

組 別MVDE-cadherin/%PBS對照組52.12±3.1281.25±4.60miR-N對照組50.67±2.5679.26±5.12miR-30c治療組34.26±1.25a94.69±6.04a

a 與對照組比，P<0.05

3討論

miR- 30c是miRNA- 30家族中的一員，研究發現miR- 30c在子宮內膜癌[6]、乳腺癌[7]、前列腺癌[8]、甲狀腺癌[9]、結腸癌[10]及肝癌[11]等惡性腫瘤組織中均低表達于相應的正常組織，且在發生淋巴結轉移的甲狀腺癌腫瘤組織中低表達于早期甲狀腺癌腫瘤組織[9]，另外低表達miR- 30c與乳腺癌患者發生三苯氧胺耐藥及較差的預后[12- 13]以及腎臟透明細胞癌患者較短的無進展存活率相關[14]，提示miR- 30c的低表達與腫瘤的發生及進展存在密切關系。進一步的研究發現在卵巢癌中miR- 30c通過作用于轉錄活化因子3(ATF3)調節溶血磷脂酸通路調控腫瘤進展[15]，在肝癌中以IER2為靶基因調控腫瘤細胞的遷移侵襲能力[16]，在結腸癌中調節去整合素金屬基質蛋白酶19(ADAM19)表達調控腫瘤的生長及轉移[10]，進一步揭示了miR- 30c的抑癌作用。然而另一些研究顯示miR- 30c在間皮瘤細胞中高表達[17]，在卵巢癌組織中高表達于良性卵巢腫瘤組織及交界性腫瘤組織[18]，并且與惡性間皮瘤患者較差的預后[17]及肺癌患者的化療抵抗相關[19]，說明miR- 30c在腫瘤的發生發展中同樣具有促進作用，這可能與腫瘤發生的組織特異性及發病原因不同有關，然而具體機制仍然需要進一步探究。

我們已經證實miR- 30c在子宮內膜癌組織中低表達于正常內膜組織，并通過熒光素酶報告實驗證實了是miR- 30c直接作用于MTA- 1抑制其表達，從而抑制子宮內膜癌細胞株的增殖及侵襲能力[4- 5]，提示miR- 30c- MTA- 1通路在子宮內膜癌細胞水平的調控中起著重要作用。為進一步探究miR- 30c- MTA- 1通路的作用本研究建立了裸鼠皮下移植瘤模型，并通過miR- 30c質粒的瘤內治療發現miR- 30c質粒可以有效上調移植瘤組織中miR- 30c的表達，下調MTA- 1蛋白，并能夠抑制裸鼠皮下移植瘤組織生長及新生血管的形成，提示在裸鼠模型中上調miR- 30c的表達可以有效抑制腫瘤的進展，與我們的細胞水平研究結果一致。

MTA- 1在子宮內膜癌組織中低表達[20]，并作為致癌基因參與調控乳腺癌[21]、結腸癌[22]等腫瘤的進展，有研究顯示MTA- 1通過下調E- cadherin的表達促進上皮-間質轉化從而增加食管癌細胞的轉移能力[23]。我們已經證實上調miR- 30c表達在下調MTA- 1表達同時可以抑制子宮內膜癌細胞株的遷移、侵襲能力。本研究對裸鼠移植瘤組織進行了免疫組化實驗，結果表明miR- 30c下調MTA- 1表達的同時降低了腫瘤組織中MVD的形成，并增加了E- cadherin染色陽性率，而新生血管的形成及上皮-間質轉化是腫瘤發生侵襲、轉移的重要條件，并且上皮-間質轉化的發生與子宮內膜癌的進展密切相關[24]，這提示MTA- 1在子宮內膜癌中可能通過調節微血管的新生及上皮-間質轉化影響腫瘤的轉移，參與調解腫瘤的進展。

綜上所述，miR- 30c及其靶基因MTA- 1在子宮內膜癌組織生長及侵襲、轉移過程中起著重要的調節作用，為進一步研究其具體調節機制及進一步探尋以miR- 30c- MTA- 1通路為靶點的新型靶向治療方法奠定了基礎，為臨床治療提供了新的方向。

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The function of miRNA- 30c and MTA- 1 in xenograft of endometrial carcinoma in nude mice

KONG Xiang- yi,ZHOU Huai- jun

(DepartmentofGynecologyandObstetrics,NanjingDrumTowerHospitalAffiliatedto

NanjingUniversityMedicalSchool，Nanjing210008,China)

[Abstract]Objective：To investigate the inhibition effect on tumor growth by up- regulating the expression of miRNA- 30c in nude mice model. Methods：Subcutaneous xenografts of mude mice models with Ishikawa cells were established，the mice were treated with miRNA- 30c expression plasmid intratumorally，controled by negative control plasmid and PBS.Then， the xenograft volume was measured and inhibition ratio of tumor proliferation was calculated. Moreover，the expression of miRNA- 30c was analysed by Realtime- PCR and the expression of MTA- 1 protein was analysed by Western blot， the microvessel density and expression of E- cadherin were detected by immunohistochemistry. Results：The subcutaneous xenografts models of mude mice were established successfully.Treatment with miRNA- 30c expression plasmid inhibited the growth of xenograft and the inhibitory rate was(46.98±5.13)%(P<0.01).The expression of miRNA- 30c was up- regulated(P<0.05) and MTA- 1 protein expression was down- regulated (P<0.05)respectively. Immunohistochemistry showed that the microvessel density decreased(P<0.05)，the expression of E- cadherin increased(P<0.05). Conclusion：Up- regulation of miRNA- 30c can inhibit the growth of xenograft in nude mice model of endometrial carcinoma by down- regulating MTA- 1．

[Key words]miRNA- 30c； endometrial carcinoma； nude mice； xenograft

[收稿日期]2015- 12- 24[修回日期] 2016- 01- 28

[基金項目]中央高校基本科研業務苗圃項目(021414340294)

[作者簡介]孔祥怡(1987-)，女，黑龍江牡丹江人，住院醫師。E- mail:xiangyikong@126.com

[通信作者]周懷君E- mail:zhouhj2007@126．com

[中圖分類號]R737.33； R- 33； R- 332

[文獻標識碼]A

[文章編號]1671- 6264(2016)03- 0364- 07

doi：10.3969/j.issn.1671- 6264.2016.03.016

[引文格式] 孔祥怡,周懷君.miRNA- 30c及其靶基因MTA- 1在子宮內膜癌裸鼠皮下移植瘤中的作用[J].東南大學學報:醫學版,2016,35(3):364- 370.

·論著·