龍南鉀礦區常見蕨類植物可培養內生真菌的多樣性

錢　旭， 甘會云， 杜勇濤， 張　鮮， 陳　曄， 樊有賦

( 九江學院 藥學與生命科學學院， 江西 九江 332000 )

龍南鉀礦區常見蕨類植物可培養內生真菌的多樣性

錢旭， 甘會云， 杜勇濤， 張鮮， 陳曄*， 樊有賦

( 九江學院 藥學與生命科學學院， 江西 九江 332000 )

摘要：植物內生真菌作為一類特殊的微生物資源，與宿主在長期的生態系統演化過程中形成了互惠共生關系,通過多樣化途徑來增強植物體的營養生理和抗性機能，對宿主植物產生多種有益生物學作用，在植物演替過程中具有重要的生態學意義。這種特殊微生物資源近年來倍受關注，而利用植物-真菌共生體強化植物在礦區逆境中生長，提高礦區生物修復效率是一個新的研究熱點。為探明鉀礦區不同蕨類植物內生真菌的物種多樣性、群落組成以及生態分布規律，該研究以芒萁、狗脊、禾稈蹄蓋蕨、海金沙、華中鐵角蕨、井欄邊草和烏蕨等植物為材料，采用組織分離、形態學鑒定等方法，對其內生真菌多樣性進行分析。結果表明：從7種植物中共分離獲得377株內生真菌，總分離率在2.50%～4.52%之間。經鑒定377個菌株隸屬于鏈格孢屬、曲霉屬、枝孢菌屬和輪枝孢屬等25個分類單元，其中鏈格孢屬、曲霉屬、枝孢菌屬和輪枝孢屬等在所有被調查蕨類植物中都有分布，為優勢屬，共計為185株，占總株數的49.07%，但它們在每種植物的分布存在明顯差異；7種蕨類植物內生真菌總定植率為葉高于根狀莖 (P<0.05)，多樣性指數在0.502～0.867之間，但每種植物及其不同組織部位的內生真菌定植率和多樣性指數存在一定的差異；從相似性分析來看，同一個鉀礦區不同蕨類植物內生真菌菌群之間的相似性程度較低，相似性系數在0.189～0.587之間。該研究結果不僅豐富了植物內生真菌種質資源，而且為進一步開展植物內生真菌強化宿主植物在鉀礦區生長適應機制的研究奠定了基礎。

關鍵詞：鉀礦區， 蕨類植物內生真菌， 優勢菌群， 多樣性指數， 相似性系數

鉀是植物生長發育必需元素之一，土壤中的鉀可分成礦物鉀(占90%左右)、緩效鉀(2%～8%)和速效鉀(0.1%～0.2%)。礦物鉀是植物難以利用的鉀，如長石和白云母中的鉀。各種形態鉀的含量及其相對活性，決定了鉀對植物的有效性。如何將礦物鉀中營養元素溶出，形成有利于植物吸收的活性物質倍受關注(蔣梅茵，1982；徐曉燕和馬毅杰,2001; 潘大偉等,2005)。植物內生真菌作為一類特殊的微生物資源，具有分布廣、種類多等特點。自20世紀80年代以來，國內外學者對溫帶、亞熱帶、熱帶、鹽堿地等不同生境植物內生真菌多樣性進行了調查研究(Tejesvi，2011；Jyoti et al，2012；Kristin et al，2012；劉愛榮等，2010)。研究表明，植物內含有較豐富的內生真菌資源，受組織、環境等因素的影響體現出一定的組織、宿主差異性(郭良棟，2000)。植物內生真菌與宿主在長期的生態系統演化過程中形成了互惠共生關系,對宿主植物產生多種有益生物學作用(郭良棟，2000；Atsatt & Whiteside，2014)。應用植物—微生物共生體強化植物在礦區逆境中生長已成為新的研究熱點(牛之欣等，2009)。

目前，內生真菌的宿主植物研究主要集中在種子植物，而有關蕨類等孢子植物內生真菌多樣性及其生態功能活性研究的報道卻相對很少(張君誠等，2010；鄒文欣等，2001)。蕨類植物是一類較原始的高等植物，也是較早的陸生植物。現存的蕨類植物約有12 000種，世界各地均有分布，具有豐富的物種多樣性。蕨類植物具有抗逆境能力強、生長迅速、繁殖能力強等特點，是較理想的植物修復資源(褚磊等，2007)。具有內生真菌定植的蕨類植物有Pteridiumaquilinu,Equisetumhyemale,Botrychiumternatum,Huperziaserrata,Huperziaserratavar.longipetiolata,Huperziaappressa,Huperziacrispata,Phlegmariuruscryptomerianus,Schizaeapusilla，Nodulisporiumsp.，Nephrolepisexaltata等(Gabel et al，1996；Petrini et al，1992；Sati et al，2006，2009；石瑋等，2005；鞠鏨等，2009；樊有賦等，2008；巫婷玉等，2012；詹壽發等，2007，2012；Riyaz-UI-Hassan et al，2013; Thangavelu & Kandasamy，2012)，但對蕨類植物內生真菌的種類、形態結構、生態分布等尚缺乏全面系統地研究。

相對于豐富的蕨類植物資源，還有大量蕨類植物的內生真菌亟待研究，特別是礦區環境蕨類植物內生真菌的研究。本研究對采自江西省龍南縣鉀礦區7種常見蕨類植物進行內生真菌的分離、純化和形態學鑒定，以探索鉀礦區蕨類植物內生真菌的物種多樣性、群落組成以及生態分布規律，為進一步探究植物內生真菌對宿主植物在礦區適應影響機制提供了理論依據。

1材料與方法

1.1 樣地概況

龍南縣安基山鉀礦區位于江西省最南端龍南縣程龍鎮(114°23′～114°59′ E、24°29′～25°1′ N)，占地面積15 000 m2，年產鉀礦0.9 萬t，開采多年，礦區內已堆積大量廢棄裸露礦渣(礦渣由鉀長石、白云母、黑云母等礦物組成，按照NY/T 889-2004標準測定礦渣速效鉀為13.714 mg/mL，占全鉀0.015%)，生長在礦渣上的植物只有少數蕨類等草本植物，無木本植物生長。

1.2 樣品采集處理

2013年7月上旬于江西省龍南縣程龍鎮安基山鉀礦區采集芒萁(Dicranopterislinearis)、狗脊(Woodwardiajaponica)、禾稈蹄蓋蕨(Athyriumyokoscense)、烏蕨(Stenolomachusanum)、海金沙(Lygodiumjaponicum)、華中鐵角蕨(Aspleniumsarelii)、井欄邊草(Pterismultifida)等7種常見蕨類植物樣本。采集方法：在隨機20 個10 m2樣地內采集健康植株(每樣地間距200 m)，7 種植物各采集20 株健康植株。去除枯葉，地上葉部剪成10 cm帶葉柄段片，立即放入無菌塑料袋中，地下根狀莖連同土壤一起放入無菌塑料袋中，分別貼上標簽放入低溫采集箱內帶回實驗室，4 ℃冰箱保藏，葉在2 d內處理完畢，根狀莖在7 d內處理完成。

1.3 內生真菌分離純化

1.3.1 培養基改良的馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA，2%)培養基為分離、純化培養基，配比：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，10%蕨葉(蕨葉為每種植物自身葉片，如分離芒萁內生真菌采用芒萁葉)水提液100 mL，加蒸餾水定容至1 000 mL，自然pH(使用前在培養基中加80 U/mL慶大霉素1 mL)。

促孢培養基：KH2PO41.0 g，KNO31.0 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，KCl 0.5 g，淀粉0.2 g，葡萄糖0.2 g，蔗糖0.2 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 000 mL，自然pH。 1.3.2 分離純化按常規無菌操作方法(樊有賦等，2008；巫婷玉等， 2012；詹壽發等，2012)，葉部從每種植物樣品中隨機選取20段帶有葉片的小段片，自來水沖洗干凈；按下列程序進行表面消毒：體積分數75%乙醇漂洗2～3 min、無菌水沖洗3次，25% NaClO溶液漂洗5 min、無菌水沖洗3～4次，再用75%乙醇沖洗1 min、無菌水沖洗5次；將樣品置于無菌濾紙上吸干水分，剪成0.5 cm × 0.5 cm的片段，從每種植物樣品中隨機選取80個葉柄和80個葉片接到改良的PDA平板上，置于28 ℃恒溫培養箱中黑暗培養3～10 d，每天觀察，若發現組織塊周圍有菌落長出，則將菌轉接入斜面，經純化后得到內生真菌菌株。根狀莖在用25%NaClO溶液漂洗5 min、無菌水沖洗3～4次后，用0.1%升汞溶液浸泡5～8 s，無菌水沖洗4～5次，再用75%乙醇沖洗1 min、無菌水沖洗5次，其它步驟同地上部分。分離純化獲得的菌株保存于九江學院藥學與生命科學學院真菌研究室(JJTU)。

1.4 內生真菌的鑒定

依據菌落形態、產孢方式、孢子形態特征和產孢結構對菌株進行鑒定。將不產孢菌株在促孢培養基上進行促孢培養，并檢查其產孢情況，產孢后按上述方法進行鑒定。經促孢培養后仍不產孢的菌株則根據菌落表面特征、菌絲顏色、菌絲生長速率等分為無孢類群的不同組。真菌屬的鑒定主要依據Barnett & Hunter(1998)；Keith et al(2011)等相關文獻。

1.5 數據統計分析

定植率(Colonization rates,CR)是指樣本中受內生真菌侵染的組織塊數占樣本全部組織塊數的百分數；分離率(Isolation rate，IR)：分離到的某一指定類型內生真菌的菌株數占樣品組織塊總數比值；分離頻率(Isolation frequency，IF)：某一指定類型內生真菌的菌株數占獲得總內生真菌菌株數比值。

采用Shannon指數(H)進行內生真菌種群的多樣性水平分析。H=-∑[ni/Nln(ni/N)]。式中，ni為第i個內生真菌菌株數目，N為全部內生真菌菌株數。

采用Jaccard相似性指數(Cj)對不同植物間內生真菌組成的相似程度進行比較和分析。Cj=c/(a+b-c)。式中，a是一種植物內生真菌的種類數，b是另一種植物內生真菌的種類數，c是兩種植物共同具有的內生真菌種類數，比較兩種植物之間內生真菌種類組成的相似程度。

2結果與分析

2.1 內生真菌分離率和定植率

從龍南鉀礦區7種常見蕨類植物的葉片、葉柄和根狀莖的1 680個組織塊中共分離獲得377個菌株。從表1可見，7種蕨類植物內生真菌的總分離率在2.50%～4.52%之間，其中烏蕨的內生真菌總分離率最高(4.52%)，其它6種蕨類植物總分離率依次為禾稈蹄蓋蕨(3.63%)>海金沙(3.27%)>華中鐵角蕨(3.21%)>狗脊(2.74%)>井欄邊草(2.56%)>芒萁(2.50%)。在7種蕨類植物中烏蕨的內生真菌總定植率最高(22.92%)，其余依次為禾稈蹄蓋蕨(17.08%)>華中鐵角蕨(16.25%)>海金沙(15.83%)>狗脊(15.42%)>井欄邊草(15.00%)>芒萁(14.17%)。從不同組織部位來看，7種蕨類植物內生真菌總分離率和定植率的趨勢為葉高于根狀莖。這說明蕨類植物內生真菌存在最主要部位是葉，而不是莖。

表 1　鉀礦區7種蕨類植物內生真菌分離率和定植率

注： *為占總株數的百分數，P<0.05。

Note： * indicates the percentage of total strains number，P<0.05.

每種植物不同部位的內生真菌分離率和定植率存在差異，其中狗脊、禾稈蹄蓋蕨、海金沙、烏蕨、芒萁等5種植物內生真菌的定植率和分離率依次為葉柄>葉片>根狀莖，華中鐵角蕨、井欄邊草內生真菌的定植率和分離率依次為葉片>根狀莖>葉柄。

2.2 內生真菌類群組成

從鉀礦區7種常見蕨類植物中共分離獲得內生真菌377個菌株，經鑒定屬于鏈格孢屬(Alternaria)、曲霉屬(Aspergillus)、枝孢菌屬(Cladosporium)和輪枝孢屬(Verticillium)等25個分類單元(表2)。根據分離頻率判斷曲霉屬、枝孢菌屬、輪枝孢屬、鏈格孢屬和Exophiala等屬為7種植物內生真菌的優勢屬，其分離頻率分別為14.58%、13.26%、7.69%、7.16%和6.37%，5個屬共獲得菌株為185株，占總株數的49.07%。這5個分類單元從每種植物中分離獲得的菌株數存在明顯差異，鏈格孢屬在芒萁中最多(6株)，曲霉屬在狗脊中最多(12株)，枝孢菌屬在烏蕨中(16株)，Exophiala在禾稈蹄蓋蕨中最多(6株)，輪枝孢屬在井欄邊草中較多(7株)。其它20個分類單元在7種植物中分類獲得菌株數也存在一些差異，其中Penicillium除芒萁外均可從其它6種植物中分離獲得，并在井欄邊草中最多(7株)，Phomachrysanthemicola，Sclerococcum和Scytalidiym等3個分類單元獲得的菌株數最少，主要分布在禾稈蹄蓋蕨和烏蕨中。

2.3 不同植物的內生真菌分布

表1研究結果表明，同一礦區不同植物中內生真菌存在明顯差異，其中從烏蕨植物中獲得76個菌株，占總株數的20.16%。其中禾稈蹄蓋蕨占15.92%、海金沙占14.59%、華中鐵角蕨占14.32%、狗脊占12.20%、井欄邊草占11.41%、芒萁占11.14%。

表2結果表明，每種植物內生真菌優勢屬不同。其中，狗脊的內生真菌優勢屬為Aspergillus、Penicillium、Cladosporium和Monilia，共計25個菌株，占其總株數的54.35%；禾稈蹄蓋蕨的內生真菌優勢屬為Cladosporium、Aspergillus、Exophiala和Fusarium，共計33個菌株，占其總株數的54.10%；烏蕨的內生真菌優勢屬為Cladosporium、Monilia、Fusarium、Oidiodendron、Aspergillus和Alternaria，共計46個菌株，占其總株數的60.53%；海金沙內生真菌的優勢屬為Aspergillus、Cladosporium、Phomopsis和Penicillium，共計21個菌株，占其總株數的38.18%；華中鐵角蕨內生真菌優勢屬為Aspergillus、Verticillium、Alternaria、Exophiala和Phomopsis，共計29個菌株，占其總株數的53.70%； 井欄邊草的內生真菌優勢屬為Penicilli-um、Verticillium、Aspergillus和Cladosporium，共計25個菌株，占其總株數的58.14%；芒萁內生真菌的優勢屬為Alternaria、Cephalosporium、Cladosporium、Verticillium和Aspergillus，共計29個菌株，占其總株數的69.05%。

表 2　鉀礦區7種蕨類植物內生真菌種群組成

2.4 蕨類植物的內生真菌多樣性與相似性

由表3可知，每種蕨類植物內生真菌的多樣性指數不同，從高到低的順序為烏蕨(0.867)>禾稈蹄蓋蕨(0.728)>海金沙(0.692)>華中鐵角蕨(0.650)>狗脊(0.553)>井欄邊草(0.553)> 芒萁(0.553)，其中烏蕨內生真菌多樣性最為豐富，多樣性指數為0.867，芒萁內生真菌多樣性最低，多樣性指數為0.5020。從組織部位來看，內生真菌的多樣性指數順序為葉片(1.69)>葉柄(1.374)>根狀莖(1.105)；每種植物不同組織部位的內生真菌多樣性指數存在差異，其中狗脊、禾稈蹄蓋蕨、海金沙和烏蕨等4種植物的多樣性指數依次為葉柄>葉片>根狀莖， 而華中鐵角蕨和井欄邊草的內生真菌多樣性指數依次為葉片>根狀莖>葉柄，芒萁不同組織部位內生真菌的多樣性指數為葉柄=葉片>根狀莖。

表 3　蕨類植物內生真菌的多樣性指數

對鉀礦區7種常見蕨類植物內生真菌相似性分析表明， 不同植物之間內生真菌種類組成的相似性

表 4　7種鉀礦區常見蕨類植物內生真菌相似性系數

系數在0.189 2～0.587 3之間(表4)，說明同一個鉀礦區不同蕨類植物內生真菌菌群之間的相似性程度較低。其中，狗脊與華中鐵角蕨的內生真菌為中等相似，相似性系數為0.5873；而狗脊與芒萁的內生真菌為極不相似，相似性系數為0.1892。芒萁的內生真菌與其它6種植物內生真菌相似性均較低。

3討論

本研究從江西龍南鉀礦區7種常見蕨類植物的1 680個組織塊中共分離獲得377個菌株，經鑒定屬于Alternaria，Aspergillus，Cladosporium和Verticillium等25個分類單元。根據分離頻率判斷Aspergillus，Cladosporium，Verticillium，Alternaria和Exophiala等為7種蕨類植物內生真菌的優勢屬。

從分離率、定植率來看，7種蕨類植物內生真菌的總分離率在2.50%～4.52%之間，總定植率為14.17%～22.92%，說明在鉀礦區蕨類植物中有一定數量的植物內生真菌定植。與非鉀礦區其它蕨類植物內生真菌的分離率相比要低，如廬山石韋、狗脊、槲蕨等植物分離率在4.75%～5.67%(詹壽發等，2007，2012；巫婷玉等，2012；樊有賦等，2008)；與鉛鋅礦廢棄礦區相比鉀礦區蕨類植物內生真菌的分離率偏低，如李東偉等(2012)報道的鉛鋅礦廢棄礦區的硬毛南芥(Arabishirsuta)、魚骨松(Acaciadecurrens)、白檀(Symplocospaniculata)、毛萼香茶菜(Rabbosiaeriocalyx)、蚤輟(Arenariaserpyllifolia)和倒掛刺(Rosalongicuspis)等種子植物內生真菌的分離率在0.42～0.93之間。

從不同組織部位來看，7種蕨類植物葉的內生真菌總分離率和定植率都明顯高于根狀莖的內生真菌分離率和定植率(P<0.05)(表1)，說明蕨類植物內生真菌存在最主要部位是葉。可能與蕨類植物各部位組織結構有關，所研究7種蕨類植物為真蕨類，并且真蕨類植物葉在形態、結構上較發達，葉分為葉片和葉柄，葉片的內部結構為表皮、葉肉組織和葉脈，葉柄的內部結構為表皮、皮層和中柱，它們表皮均有氣孔分布，內生真菌可能主要通過自然孔口(氣孔)和葉表皮細胞間隙侵入植物體內，蕨類植物莖為根狀莖，其內部結構為表皮、皮層和中柱，表皮無氣孔，蕨類植物根狀莖的內生真菌是通過莖表皮細胞間穿過皮層機械組織細胞間隙侵入到根狀莖的皮層薄壁細胞(詹壽發等，2012)；也可能與礦區土壤環境有關，因為礦區土壤貧瘠，有些真菌難以在這種環境中生存，故侵入蕨類植物根狀莖內生真菌數量較少，而地上部分葉可以接受空氣中大量真菌孢子，孢子通過不同途徑侵入葉內定植。具體影響內生真菌在蕨類植物不同組織部位分布差異的因素需要進一步探究。

龍南鉀礦區7種常見蕨類植物內生真菌多樣性指數在0.502～0.867之間，可見鉀礦區蕨類植物內生真菌較為豐富。從相似性分析結果來看，不同植物之間內生真菌種類組成的相似性系數在0.189 2～0.587 3之間，除了狗脊與華中鐵角蕨、禾稈蹄蓋蕨與烏蕨的內生真菌相似性為中等相似外，其它植物之間內生真菌的相似性都比較低，說明同一個鉀礦區不同蕨類植物內生真菌菌群之間的相似性程度較低，這是否表明鉀礦區蕨類植物內生真菌的宿主具有一定專一性還有待進一步研究。

致謝感謝中國科學院微生物研究所郭良棟研究員給予的幫助和指導。

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Diversity of culturable endophytic fungi separated from seven common ferns in potassium mine areas in Longnan, South Jiangxi Province

QIAN Xu， GAN Hui-Yun， DU Yong-Tao， ZHANG Xian， CHEN Ye*， FAN You-Fu

(SchoolofPharmacyandLifeSciences，JiujiangUniversity， Jiujiang 33200， China )

Abstract:Plant endophytic fungi is a special kind of microorganisms mutualistic ally symbiosed with host plants. The special microbial resources have attracted tremendous interests in recent years, because of their potential to address problems associated with enhanced plant growth in environmental stress of mines and to improve the efficiency of ecological restoration. With a long peoriod of evolution, endophytic fungi and their host plants have formed a closemutual symbiotic relationship. Many beneficial biological effects have been made on the host plants, and they have the important ecological significance in plant community succession process. It is widely attracted using plants-microorganisms to enhance plant growth in environmental stress of mines, and to improve biological restoration efficiency, and its significance to host plants has become a new hot issue. In order to make clear the species diversity, community composition and ecological distribution of endophytic fungi, we carried out our work among 7 species of common ferns in potassium mine areas in Longnan, South Jiangxi Province. They are Dicranopteris linearis, Woodwardia japonica, Athyrium yokoscense, Stenoloma chusanum, Lygodium japonicum, Asplenium sarelii and Pteris multifida. And we analyzed the diversity of endophytic fungi, using the method of tissue isolation, morphological identification. The results showed that 377 strains of endophytic fungi were isolated from 7 species of plants, and the separation rate ranged from 2.50% to 4.52%. All of 377 strains belong to 25 genera, and among them, Alternaria, Aspergillus, Cladosporium and Verticillium,which are found in all these 7 fern species, indicated that they were dominant, but there were obvious differences in the distribution in each fern species. The total separation rate and the colonization rate of entophytic fungi from leaves are generally greater than that from the rhizomes, but there are some differences in the total separation rate and the colonization rate from different parts of each fern species. The diversity indexes of endophytic fungi range from 0.502 to 0.867 in the seven species of ferns. It indicated that there was high diversity of endophytic fungi in potassium mines and the low similarity of endophytic fungi in different ferns in the same mine areas. The similarity coefficients of the endophytic fungi in the seven species of ferns were from 0.189 to 0.587. The results of this study would not only enrich germplasm resources of plant endophytic fungi, but also would offer basic data for further research on the mechanism that endophytic fungi could strengthen the adaptation of the host plant on mineral nutrition and stress physiology in potassium mine areas.

Key words:potassium mine areas, endophytic fungi in ferns, dominant endophytic fungi, diversity index, similarity coefficient

DOI:10.11931/guihaia.gxzw201408021

收稿日期:2014-12-14修回日期： 2015-01-14

基金項目：國家自然科學基金(31360064, 51264014)[Supported by the National Natural Science Foundation of China(31360064, 51264014)]。

作者簡介：錢旭(1992-)，男，河南鄲城人，研究方向為真菌多樣性，(E-mail)1321483416@qq.com。 *通訊作者： 陳曄，教授，研究方向為植物內生真菌多樣性，(E-mail)chenyejjtc@126.com。

中圖分類號：Q939.5

文獻標識碼：A

文章編號：1000-3142(2016)03-0342-07

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