小反芻獸疫病毒F基因缺失體的克隆、表達及鑒定

鄧瑞雪蒙學蓮曾巧英才學鵬

（1.甘肅農業大學動物醫學院，蘭州 730070；2.中國農業科學院蘭州獸醫研究所 家畜疫病病原生物學國家重點實驗室，蘭州 730046）

小反芻獸疫病毒F基因缺失體的克隆、表達及鑒定

鄧瑞雪1蒙學蓮2曾巧英1才學鵬2

（1.甘肅農業大學動物醫學院，蘭州 730070；2.中國農業科學院蘭州獸醫研究所 家畜疫病病原生物學國家重點實驗室，蘭州 730046）

旨在研究小反芻獸疫病毒（PPRV）囊膜與宿主細胞的融合機制，構建F基因缺失體，并且在原核細胞內表達。鑒于F基因中包含的兩段保守序列HR1和HR2在融合過程中具有關鍵性作用，分別構建pET30a-HR1和pET30a-HR2原核表達載體，將測序正確的重組質粒轉化到大腸桿菌BL21（DE3）細胞內進行IPTG誘導表達，在最優表達條件下大量表達，并利用鎳瓊脂糖凝膠純化蛋白。結果顯示，獲得的重組蛋白與預期大小一致且以可溶性方式表達，純化的蛋白純度大于90%；重組蛋白與抗His標簽抗體和抗PPRV Nigeria 75/1株陽性血清均能發生反應，證明重組蛋白具有反應原性。

F基因缺失體；原核表達；小反芻獸疫病毒

小反芻獸疫（PPR），俗稱羊瘟，是由副黏病毒科（Paramyxoviridae）麻疹病毒屬（Morbillivirus）小反芻獸疫病毒（PPR virus，PPRV）引起的一種烈性、接觸性傳染病，主要感染山羊和綿羊［1］。該病危害嚴重，發病率達100%，若伴發其他疾病其死亡率可達100%，是世界動物衛生組織（OIE）法定必須報告的動物疫病，也是我國農業部制定的《法定動物疫病病種名錄》中規定的Ⅰ類動物疫病［2］。自2007年我國西藏首次發生PPR疫情疫情以來，該病已在我國20多個省 份發生，對我國的養殖戶造成了重大經濟損失，對我國的養羊業構成了嚴重威脅。

PPRV基因組是單股負鏈無節段RNA，共編碼6種結構蛋白和兩種非結構蛋白，分別為核衣殼蛋白（N）、磷蛋白（P）、囊膜基質蛋白（M）、纖突糖蛋白（F）、血凝素（H）和大蛋白（L）以及 C、V非結構蛋白。F蛋白和H蛋白是構成病毒表面纖突的兩種糖蛋白，是決定病毒感染成功與否的關鍵因素，其中F蛋白通過促進病毒囊膜和細胞膜融合，使直接釋放的N蛋白進入細胞漿，從而幫助病毒進入宿主細胞［3］。一般認為副黏科病毒的F蛋白促使細胞融合必須與H蛋白或HN蛋白共同參與，但有實驗表明，PPRV F蛋白可使雞紅細胞溶解，在感染初期可導致溶血和細胞融合［1，4］。由此證明，PPRV F蛋白在無HN蛋白參與的情況下仍能表現出融合功能。

作為融合的直接作用蛋白，F蛋白不僅直接參與病毒囊膜與宿主細胞膜的融合，而且也可以介導宿主臨近細胞間的融合。F蛋白為了獲得融合活性，必須由無生物學活性F0前體形式裂解成二硫鍵連接的融合前形式F1+F2異源二聚體，F1形成了膜錨定亞單位，這個亞單位在副黏病毒中有一些保守序列，其中有4個片段已經被深入研究，這4個片段分別是位于新生成N-端的融合多肽（FP）、2個七肽重復區（HR1和HR2）以及跨膜區（TM）。這些保守序列編譯的多肽FP、HR1、HR2和TM共同介導宿主細胞膜和病毒囊膜的融合，在融合過程中，FP插入到宿主細胞膜，HR1和HR2相互作用使得病毒囊膜和宿主細胞膜相互靠近，它們的靠近進一步引起了融合［5，6］。F蛋白HR1和HR2在融合觸發時重新定位，形成穩定的六螺旋束（6-HB），在PPRV-F蛋白HR1和HR2形成的六螺旋束中，HR1是三聚體，HR2是單體。PPRV-F蛋白的HR1和HR2均能影響合胞體的形成，而且HR2的影響效果更強，FP在發揮融合活性時可能插入靶細胞膜中啟動融合過程。

因此，鑒于F蛋白HR1和HR2在病毒融合過程的重要作用，本研究對小反芻獸疫的 F蛋白的七肽重復區進行原核表達，旨在獲得高純度的蛋白抗原，為進一步研究小反芻獸疫病毒F蛋白介導的融合過程奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

原核表達載體 pET-30a（+）、質粒PCAGGSFLAG-F，羊抗 PPRV Nigeria75/1 株多克隆抗體均由家畜疫病病原生物學國家重點實驗室保存；pMD19-T Simple Vector、Premix TaqTM（Ex TaqTMVersion 2.0）購自TaKaRa公司；大腸桿菌Trans5α Chemically Competent Cell，BL21（DE3）Chemically Competent Cell購自北京全式金生物技術有限公司，限制性內切酶BamHⅠ和XhoⅠ購自NEB，T4連接酶購自 Promega，Mouse Anti-His Tag Monoclonal Antibody購自北京中杉金橋生物技術有限公司，Goat Anti-Mouse IgG/HRP antibody購自北京博奧森生物技術有限公司，DNA凝膠回收試劑盒和質粒小量提取試劑盒購自愛思進生物技術（杭州）有限公司，Biodlight Western Chemiluminescent HRP Substrate購自巴傲得生物科技有限公司；鎳瓊脂糖凝膠 FF購自北京韋氏博慧色譜科技有限公司；其他常規試劑均為進口或國產分析純級產品。

1.2 方法

1.2.1 引物的設計與合成 根根據PPRV Nigeria75/1中F基因堿基序列，利用Oligo 6.0分別設計用于擴增F基因HR1和HR2的特異性引物，分別在兩對引物的上游、下游引入BamHⅠ和XhoⅠ酶切位點（表1）。

表1 引物設計

1.2.2 目的片段的擴增及表達載體的構建 以本實驗室保存的F基因全長PCAGGS-FLAG-F質粒為模板，分別以兩對特異性引物PCR擴增獲得目的基因。反應體系為50 mL：上、下游引物各2 mL，2×Premix Taq 25 mL，模板1 mL，ddH2O 20 mL。PCR反應條件：94℃ 5 min；95℃ 1 min，54℃ 40 s，72℃ 40 s，35個循環；72℃延伸8 min。切膠回收目的片段，對目的片段及載體進行雙酶切，膠回收酶切產物，連接轉化，挑取單克隆，PCR及雙酶切鑒定，將初步鑒定的陽性克隆送至蘇州金唯智生物科技有限公司北京分公司進行測序。

1.2.3 重組蛋白表達菌株的確定 將篩選出的陽性重組質粒轉化到BL21（DE3），挑取單克隆，提取質粒進行PCR和雙酶切鑒定，選取陽性克隆送至蘇州金唯智生物科技有限公司北京分公司進行測序，測序正確的分別命名為pET30a-HR1和pET30a-HR2。

1.2.4 重組蛋白表達 將過夜培養的陽性pET30a-HR1和pET30a-HR2重組菌液按1%的量分別轉接于含50 μg/mL Kan的LB液體培養基中，37℃，200 r/min振蕩培養至OD600達到0.6-0.8時加入終濃度為1 mmol/L的IPTG，37℃誘導6 h，離心收集菌液，-70℃凍融3次，冰浴中超聲裂解20 min，然后13 000 r/min離心15 min，分別收集上清和沉淀，用與上清等體積的PBS重懸沉淀，將上清和沉淀分別進行SDS-PAGE電泳分析目的蛋白表達情況。

1.2.5 重組蛋白表達誘導條件的確定 選取表達克隆，過夜培養，按1%的比例分別轉接于含50 μg/mL Kan的LB液體培養基中，37℃，200 r/min振蕩培養至OD600為0.6-0.8時分成三組，第一組誘導的條件為37℃、6 h，IPTG的終濃度依次為0、0.2、0.4、0.6、0.8和1 mmol/L；第二組誘導溫度37℃，IPTG終濃度1 mmol/L，誘導時間依次為2、4和6 h；第三組誘導時間為6 h，IPTG終濃度為1 mmol/L，誘導溫度依次為21℃、28℃和37℃。收集菌體，8 mol/L尿素裂解，SDS-PAGE分析對比確定最優表達條件。

1.2.6 表達產物的純化 在最優條件下大量表達重組蛋白，12 000 r/min離心5 min，PBS洗2次，按照每克菌體濕重加10 mL PBS的比例重懸，-70℃凍融3次，冰浴中超聲裂解，13 000 r/min離心15 min，收集上清，按照鎳瓊脂糖凝膠 FF說明書操作。

1.2.7 表達產物的鑒定 將純化重組蛋白進行SDSPAGE電泳，用eBlotTMProtein Transfer System轉移到PVDF膜上，5%脫脂奶粉37℃封閉1 h，用PBST洗滌3次，每次10 min；加入Mouse Anti-His Tag Monoclonal Antibody（1∶1 000），37℃孵育1 h，同上洗滌；加入Goat Anti-Mouse IgG/HRP antibody（1∶4 000），37℃孵育40 min，同上洗滌后用Biodlight Western Chemiluminescent HRP Substrate顯色試劑盒進行ECL顯色，化學發光成像儀分析。平行實驗以兔抗PPRV Nigeria 75/1株F蛋白多克隆抗體為一抗（按1∶50稀釋），Mouse Anti-Rabbit IgG/HRP antibody（按1∶4 000稀釋）為二抗進行Western blot，對表達的蛋白進行免疫活性分析。

2 結果

2.1 HR1和HR2基因的擴增

根據所設計的特異性引物，以PCAGGS-FLAG-F重組質粒為模板，成功擴增獲得了與預期目的條帶大小一致的條帶，HR1大小為189 bp，HR2大小為153 bp（圖1）。

圖1 目的基因的PCR擴增

2.2 HR1和HR2基因重組表達載體的構建與鑒定

回收純化目的條帶，用BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切PCR產物和表達載體pET-30a（+），將目的產物亞克隆至pET-30a（+），獲得重組質粒pET-30a（+）/HR1、pET-30a（+）/HR2，經雙酶切（圖2）、PCR 鑒定結果正確，測序結果與原序列一致，成功構建了HR1和HR2的原核表達載體。

2.3 表達產物的SDS-PAGE分析

SDS-PAGE分析結果（圖3）表明，在37℃、IPTG終濃度為1 mmol/L的條件下誘導6 h獲得了與目的蛋白大小接近的重組蛋白，而轉染空載體pET-30a（+）的菌株在相同條件下未表達出相應的蛋白條帶，并且重組蛋白大多數出現在上清中，說明所表達的蛋白為可溶性表達。

圖2 重組質粒的酶切鑒定

圖3 表達產物的SDS-PAGE分析

2.4 表達條件的優化

經過對誘導溫度、時間及誘導劑IPTG用量的篩選，確定構建的原核基因工程菌最佳反應條件pET-30a（+）-HR1為28℃、IPTG終濃度為1 mmol/L、200 r/min、誘導6 h，pET-30a（+）-HR2為28℃、IPTG終濃度為0.4 mmol/L、200 r/min、誘導6 h。

2.5 表達產物純化結果

將超聲裂解所得的上清與鎳瓊脂糖凝膠FF混合均勻，用不同咪唑濃度的緩沖液洗脫，SDS-PAGE電泳。結果（圖4）顯示，pET30a-HR1在300 mmol/L咪唑濃度時，目的蛋白的洗脫量最大，雜質蛋白量最小；pET30a-HR2在100 mmol/L咪唑濃度時，目的蛋白的洗脫量最大，雜質蛋白量最小。

圖4 表達產物純化結果SDS-PAGE分析

2.6 Western blotting分析

用抗His標簽抗體作為一抗的Western blotting鑒定，結果（圖5）顯示，誘導后的pET-30a（+）-HR1/BL21（DE3）和pET-30a（+）-HR2/BL21（DE3）均在預期分子量大小處出現特異性條帶，說明重組蛋白獲得表達，且與His標簽表達為融合蛋白，利于后續的蛋白純化。用羊抗PPRV Nigeria 75/1株多克隆抗體作為一抗的Western blotting結果（圖6）顯示，與抗His標簽的抗體作為一抗的結果一致，證明重組蛋白具有良好的反應原性。

圖5 純化的表達產物Western blot分析

圖6 純化的表達產物Western blot分析

3 討論

在病毒感染過程中，病毒囊膜和宿主細胞膜的融合是非常重要的一步。作為融合的直接作用蛋白，副黏科病毒F蛋白不僅直接參與病毒囊膜與宿主細胞膜的融合，也可以介導宿主臨近細胞間的融合。

在F蛋白介導的宿主細胞和病毒囊膜的融合過程中，F基因的保守序列表達的融合多肽FP、2個七肽重復區蛋白HR1和HR2以及跨膜區蛋白TM起著重要的作用，其中HR1和HR2可以拉近病毒囊膜蛋白和宿主細胞受體的距離，進而導致了融合。在PPRV-F蛋白HR1和HR2形成的六螺旋束中，HR1是三聚體，HR2是單體，即HR1分子以α螺旋的形式形成三聚體核心，HR2分子同樣以α螺旋的形式反向平行結合于HR1分子形成的溝槽中，這種結構被認為是F蛋白最穩定的構象。雖然F蛋白晶體結構中缺乏TM區的結構，但最近的研究表明副黏病毒F蛋白TM區是蛋白錨定于細胞膜所必需的，TM區連接到三聚體上可能有助于穩定融合前構象。F蛋白的重折疊產生了新的亞基，破壞了許多融合前的構象，整體上產生一種更緊湊和穩定的結構，FP采用一種對融合具有重要意義的螺旋結構，而且FP的結構與自身和TM都相關［7，8］。有報道認為一些副黏病毒的胞質區也與融合活性有關。

在副黏病毒感染中，抗F蛋白的抗體對阻止感染和防止病毒在體內的擴散起主要作用［9］，蛋白單抗能完全抑制新城疫病毒（NDV）在雞體內的生長，防止雞群死亡［10］。NDV F蛋白DNA疫苗能夠有效保護雞群抵抗強毒NDV的感染［11-13］。近年來，國內外學者對F蛋白的研究日益增多。在參與VLPs裝配方面，證明編碼F蛋白的基因參與了NDV［14］和MV［15，16］的VLPs裝配。PPRV F蛋白TM區對VLPs的裝配和釋放無明顯影響，但會對細胞的狀態產生影響［17］。Rahaman等［18］證明PPRV F蛋白的HR1和HR2均能抑制合胞體的形成，而且HR2的抑制效果更強。目前，HR1或HR2單獨介導宿主細胞膜和病毒囊膜的融合機制還不清楚。

在原核表達系統中，雖然蛋白多易以包涵體形式表達，導致蛋白不能正確折疊成天然結構而無生物學活性，但由于目的蛋白、載體及表達條件的不同，也可表達出有活性的重組蛋白。在pET系統中，鑒于pET30a（+）載體具有標簽小、影響較小的優點，本實驗選用pET30a（+）作為載體，構建了重組質粒pET30a/HR1和pET30a/HR2，并設置了不同的表達條件，期望表達出可溶性的、有活性的蛋白。

Western blotting結果表明，分別以抗His標簽的抗體和抗PPRV的陽性血清作為一抗，重組工程菌誘導表達樣品均在預期分子量大小處檢測到特異性條帶，而陰性對照中未出現大小一致的條帶，這說明成功表達了融合蛋白，表達的融合蛋白具有良好的特異性和免疫反應性。這為后續研究PPRV F基因缺失體對病毒囊膜和宿主細胞膜融合的影響奠定了基礎。

4 結論

構建pET30a（+）/HR1和pET30a（+）/HR2重組表達載體，將其轉化BL21（DE3），在IPTG誘導下成功表達出帶His標簽的融合蛋白，最佳表達條件分別為：pET-30a（+）-HR1誘導溫度28℃、IPTG終濃度為1 mmol/L、搖床轉速200 r/min、誘導時間6 h；pET-30a（+）-HR2誘導溫度28℃、IPTG終濃度為0.4 mmol/L、搖床轉速200 r/min、誘導時間6 h。通過鎳瓊脂糖凝膠 FF分離出高純度的融合His標簽的蛋白。

Western blotting分析顯示，這兩種蛋白與抗His標簽的抗體和抗PPRV Nigeria 75/1株多克隆抗體均能發生特異性反應，即重組蛋白具有良好的特異性和反應原性。

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（責任編輯 馬鑫）

Cloning，Expression and Identification of F Gene Deletants from Peste Des Petits Ruminants Virus

DENG Rui-xue1MENG Xue-lian2ZENG Qiao-ying1CAI Xue-peng2
（1. College of Veterinary Medicine，Gansu Agricultural University，Lanzhou 730070；2. State Key Laboratory of Veterinary Etiological Biology，Lanzhou Veterinary Research Institute， Chinese Academy of Agricultural Sciences，Lanzhou 730046）

The F gene deletants were constructed and expressed in prokaryotic cell in order to clarify the fusion mechanism between the envelope of peste des petits ruminants virus（PPRV）and the host cells. Considering the key roles in the fusion process，HR1 and HR2，the two conserved fragments of F gene，were cloned into prokaryotic expression vector pET-30a，respectively. The recombinant plasmid pET30a-HR1 and pET30a-HR2 with the confirmed correct sequences were transformed into Escherichia coli BL21（DE3）and expressed by the induction of IPTG. The fusion proteins were largely expressed under the optimal condition and purified using the nickel agarose gel. The results showed that the relative molecular masses of the fusion proteins expressed in form of soluble protein were consistent with the expectation，and the purities of the expressed proteins were over 90%. The fusion proteins reacted with both anti-His tag antibody and anti-PPRV Nigeria75/1 positive serum，indicating that the fusion protein had reactionogenicity.

F gene deletant；prokaryotic expression；peste des petits ruminants virus

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.05.031

2015-12-22

國家自然科學基金項目（31300142），蘭州市科技計劃項目（2013-4-40）

鄧瑞雪，男，碩士，研究方向：預防獸醫學；E-mail：drxd1@163.com

曾巧英，女，教授，研究方向：預防獸醫學；E-mail：zengqy@gsau.edu.cn

才學鵬，男，研究員，研究方向：家畜寄生蟲的研究；E-mail：caixp@163.vip.com