以基因芯片探究針刺瀉法對應激性高血壓前期大鼠腎臟基因表達的影響

紀　智，郭　文，朱華超，謝曉佳，孫啟勝，劉清國

(北京中醫藥大學針灸推拿學院，北京 100029)

以基因芯片探究針刺瀉法對應激性高血壓前期大鼠腎臟基因表達的影響

紀智，郭文，朱華超，謝曉佳，孫啟勝，劉清國*

(北京中醫藥大學針灸推拿學院，北京 100029)

摘要：目的運用基因芯片技術檢測針刺瀉法對應激性高血壓前期大鼠腎臟基因表達的影響并分析其內在機理。方法雄性Wistar大鼠27只，隨機分為空白組、模型組、模型+針刺瀉法組，每組9只。造模方法：噪聲結合足底電擊刺激，周期為14 d。造模同時針刺瀉法組取曲池穴、太沖穴進行干預，模型組和空白組每天做與針刺組相同的抓取刺激。在造模前1天、第3、5、7、9、11、13、15天測量大鼠的血壓，并觀察其生理學行為學改變。第15天量取血壓后取材，用Rat Gene 2.0 Array technology進行基因芯片分析。結果造模期間空白組血壓始終保持正常水平。模型組在造模第3天即突破了120 mmHg(P<0.01)，并在后來的第5、7、9、11、13、15天持續升高至較高水平(P<0.01)。造模過程中大鼠出現尖叫、咬架、小便變黃、毛質粗糙、眼睛充血等變化，且血壓始終處于120～139 mmHg范圍內，說明造模成功。模型+針刺瀉法組的血壓值在第5、7、9、11、13、15天均明顯低于模型組。基因表達頻譜結果顯示：與模型組相比，模型+針刺瀉法組有106個基因表達升高，92個基因表達降低。其中高血壓相關基因CYP1A1、IGFBP-1的表達也發生相應變化。結論針刺太沖、曲池并施以瀉法，可明顯降低應激性高血壓前期大鼠的血壓，并影響其腎臟的基因表達。

關鍵詞：針灸療法；瀉法；應激性高血壓前期；基因芯片

應激性高血壓[ 1]的發病機理復雜，其內在機制主要包含下丘腦—垂體—腎上腺皮質軸(HPA)[2 ]，腎素—血管緊張素—醛固酮系統(RAS)[3 ]，交感神經—腎上腺髓質系統(SAM)[4 ]。美國JNC7中提出“高血壓前期”(120～139/80～89 mmHg)的概念，旨在引起醫務人員和公眾對于高血壓前期這一特殊階段的重視[5 ]。因為這一人群的基數大，進展至高血壓的比例高，罹患冠心病、腦卒中與終末期腎病的概率大，并已經出現了靶器官的損傷和相應基因和蛋白的表達的改變[6 ]。研究[7-8 ]表明，針刺治療對血壓的降低作用，主要通過調節神經系統、免疫系統和血管內皮細胞實現。而在本課題組既往多項實驗結果[ 9-10 ]中發現，針刺瀉法降血壓的效果最佳，明顯高于針刺補法組和靜留針組。

基因芯片技術是目前發展迅速的一項生物技術，用于檢測和分析基因表達。具有高通量、高靈敏性、高效率的特點，可同時監測多個基因。這樣的特點為分析研究受高血壓影響的多個基因提供了可能[11 ]。之前的研究著重于中后期高血壓的治療和對靶器官的保護，少有對于高血壓前期基因表達和干預的研究。本研究將探查針刺瀉法對應激性高血壓前期的調控作用，并應用基因芯片技術監測重點基因，從基因層面系統地闡釋其作用機理，從而為針刺預防和治療高血壓提供新的思路。

1 材料與方法

1.1實驗動物與分組選用健康成年SPF級Wistar大鼠27只，雄性，體質量(220±30)g。由北京維通利華實驗動物中心提供。飼養環境舒適清潔，通風良好，定期紫外線消毒。室溫控制在(20±1)℃，濕度50%，光線模擬自然環境的12 h晝夜交替。自由進食及飲水，每日清掃糞便，更換墊料。采用完全隨機設計法，利用隨機數字表將Wistar大鼠分為空白組、模型組、模型+針刺瀉法3組，每組9只。

1.2動物模型制備本實驗采用目前最通行的，電擊足底結合噪聲刺激的方式，制備應激性高血壓大鼠模型。模型組和模型+針刺瀉法組大鼠，每天上午8∶00-10∶00 、下午2∶00-4∶00 各接受1 次電擊足底結合噪聲應激刺激。應激時將動物放在(22 cm×22 cm×26 cm) 籠內，籠子底部由細的銅柵構成，通過銅柵給動物足底電脈沖刺激，刺激脈沖每2～25 s之間隨機發生1次，刺激脈沖電壓為80 V，持續時間50 ms/次，電刺激時由蜂鳴器發出噪聲(80～100 db，時程50 ms)。1.3干預方式將各組大鼠舒適的固定于特質鼠套中，露出四肢，固定20 min。針刺瀉法組取太沖穴(雙側)、曲池(雙側)，取穴參照《實驗針灸學》教材：于后肢足背1、2趾骨凹陷處取太沖穴，直刺1 mm；于橈骨近端，肘關節外側前方凹陷中取曲池穴，直刺4 mm。采用中研太和牌一次性25號0.5寸毫針(無錫佳健醫療器械有限公司生產)。以右手為刺手,太沖穴大拇指作用力向后時用力捻轉，然后輕力向前退回，捻轉幅度360°/次，60次/min，持續捻轉1 min，10 min后再行針1次，共留針20 min。空白組和模型組進行與針刺瀉法組相同的捉抓刺激。干預方式，1次/d，由同一人員操作，保持相同干預方式14 d直至取材。

1.4取材方法及觀測指標實驗第15天量取大鼠尾動脈血壓后，將其麻醉后斷頭處死，立即置于冰盤中剪取雙腎，用液氮快速冷凍固定后存放在-80 ℃冷凍室內。于造模結束2 h后測量大鼠尾動脈收縮壓，測試環境保持(22±2) ℃恒溫。大鼠在36 ℃環境中預熱15 min，用無創血壓儀在大鼠安靜清醒的狀態下測取血壓值。每只大鼠測量3次，取平均值。實驗開始前1天測量1次，實驗第3、5、7、9、11、13、15 天各測量1次。應用mirVana miRNA isolation Kit技術從27只大鼠中分別提取RNA。每組樣本應用Gene Chip Rat GENE 2.0 ST Array 進行基因表達頻譜分析，并重復3次。應用Affymetrix protocol對每組樣本進行標記和芯片雜交。應用Affymetrix Gene Chip 645系統進行芯片雜交，隨即應用Affymetrix Gene Chip 450系統進行洗染。最后應用Affymetrix Gene Chip 7G microarray scanner 進行掃描。

1.5數據分析將掃描后的CEL格式圖像輸入到Affymetrix Expression console software，對基因芯片圖像進行數據分析。使用Robust Multichip Average 算法對基因表達數據進行歸一化處理和分析。而后將歸一化后得到的CHP格式的數據，輸入Transcriptome Analysis console中進行下一步分析。通過比較3組之間基因表達差異，通過fold-change值觀察基因上調或下調的變化趨勢,其中fold-change值≥1.5的為差異基因。篩選出兩樣本之間差異表達基因之后，通過超幾何檢驗的方法，進行差異表達基因的Go功能富集分析。

2結果

2.1各組大鼠收縮壓變化15 d中，空白組大鼠的收縮壓一直處于正常水平。相比之下模型組在造模第3天即突破120 mmHg(P<0.01)，并在后來的第5、7、9、11、13、15天持續升高至較高水平(P<0.01)。模型+針刺瀉法組的血壓值上升相對平緩，在第5、7、9、11、13、15天均明顯低于模型組。說明太沖、曲池穴施以針刺瀉法，可有效抑制應激性前期高血壓大鼠血壓升高。

2.2各組大鼠基因表達變化基因表達頻譜結果fold change值顯示，與空白組比較，模型組有187個基因表達發生了變化。其中有99個基因表達升高，88個基因表達降低。與模型組相比，針刺瀉法干預改變了198個基因的表達，其中有106個基因表達升高，92個基因表達降低(P<0.05，fold change≥1.5)。基因表達頻譜結果顯示，有43個基因表達在模型組中升高，在模型+電針組降低；另有34個基因表達在模型組中降低，在模型+電針組中升高。

2.3Go功能富集分析本實驗還進行了Go功能富集分析來探查在針刺瀉法的干預下，表達發生改變的基因所相關的生理功能，結果如圖1所示，包含生理功能和細胞組分。最終得出與差異基因相關的功能條目為chemical，stress，stimulus，biotic stimulus，protein folding，external biotic stimulus，extracellular region part，unfolded protein binding，endoplasmic reticulum lumen，external stimulus(富集分值最高的10個，enrichment值≥10)等。

圖1　Go功能富集分析結果

3討論

原發性高血壓中應激性高血壓所占比率高達22.2%，而焦慮、緊張等情緒是造成應激性高血壓的主要原因[12 ]。本實驗所采用的電擊足底結合噪聲刺激的方式，為身體和心理的多重刺激，類似人類生活的多應激源環境，是目前最成熟和通用的應激性高血壓模型制作方式。實驗中與空白組相比，模型組大鼠血壓有大幅度升高，且出現跳起、尖叫、咬架、大便硬、小便黃、毛發粗糙、眼睛充血等變化，符合人類高血壓中肝陽上亢的證候表現。這說明本次實驗造模成功，也驗證了長期身心壓力可導致血壓升高的理論。

本實驗模型處于高血壓前期，氣陰虧耗尚輕，屬肝陽上亢的實證，故針刺采用瀉法最為適宜。而根據前期課題研究結果表明，瀉法組降壓效果明顯優于補法組和靜留針組。在本次實驗過程中,第5天開始針刺瀉法組的血壓相比模型組有明顯下降，與筆者的前期研究結果一致。曲池、太沖2穴為臨床高血壓治療常用穴，其降壓效果已經大量實驗研究證實。曲池穴是手陽明大腸經合穴，“合主逆氣而泄”,且大腸經屬金能克肝木，故針刺曲池穴有平肝瀉火的作用。太沖穴為肝之原穴，為“一身氣化發生之始”“握升降之樞”。具疏肝行氣之功，是治療高血壓病的要穴。曲池、太沖配伍，一臟一腑、一陰一陽，共奏調氣降逆、平肝潛陽、柔肝熄風之功。

高血壓的發病與多個基因相關，并受到多方面環境的影響。因此，通過檢測所有相關基因的表達并分析組間差異的方法，可較系統的分析高血壓的調控機制。本研究基因芯片結果表明模型組與空白組之間，針刺瀉法+模型組與模型組之間的基因表達，均存在明顯的差異。其中一些基因表達的差異已被證實與高血壓相關。

CYP1A1是CYP基因家族的一員，負責合成細胞色素P450酶[13 ]。IGFBP-1是胰島素生長因子結合蛋白基因家族中的一員，負責合成胰島素生長因子結合蛋白1[14 ]。IGFBP-1蛋白在血漿中循環，并結合胰島素樣生長因子IGF-1，IGF-1與IGFBP-1結合后，其半衰期得以延長,與細胞表面受體的相互作用也發生改變。研究[15 ]表明IGF-1是一種心血管疾病的保護因子,可通過誘導一氧化氮(NO)的合成，從而產生舒張血管的功能。高血壓患者血清IGF-1濃度升高，并隨著血壓水平和病情嚴重程度更加明顯[16 ]。基因芯片結果表明，CYP1A1、IGFBP-1基因可能是應激性高血壓前期的靶基因之一，而針刺瀉法可以抑制CYP1A1、IGFBP-1基因的表達。針刺瀉法可能通過干預CYP1A1、IGFBP-1基因的表達，起到降壓效果，其具體機理尚待進一步研究。

本實驗結果表明，針刺太沖、曲池并施以捻轉瀉法，可明顯降低應激性高血壓前期大鼠血壓值，并影響其腎臟的基因表達。

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Twirling-reducing needling manipulation on gene expression in kidney of stress-induced pre-hypertension rats

JI Zhi,GUO Wen,ZHU Huachao,XIE Xiaojia,SUN Qisheng,LIU Qingguo*

(School of Acupuncture,Moxibustion and Tuina,Beijing University of Chinese Medicine,Beijing 100029,China)

Abstract：ObjectiveTo study the effect of twirling-reducing needling manipulation(TRNM) on gene expression in kidney of stress-induced pre-hypertension rat by gene chip technology.MethodsTwenty-seven,male Wistar rats were randomly divided into 3 groups (n=9/group):blank control group,model control group and model+TRNM group.Foot-shocks combined with generated noise was applied in the preparation of stress-induced pre-hypertension model and lasted for 14 days.Twirling-reducing needling manipulation was used on Taichong(LR3) and Quchi(LI11) of TRNM group along the molding cycle.The model control and blank control group rats were grabbed in the same restrainers for 20min without any other intervene.Systolic blood pressure(SBP) was tested one day before work and on the 3 rd,5 th,7 th,9 th,11 th,13 th and 15 th day.Gene expression profiles was determined by Rat Gene 2.0 Array technology.ResultsSBP of blank control group rats stayed normal along the modeling cycle.At the 3rd day,SPB of model control group elevated to 120 mmHg(P<0.01),and continuously rose to 139 mmHg,along with changes like irritation,squealing,yellow urination and bloodshot eyes,which indicates the success of modeling.SBP of TRNM group was significantly lower (P<0.01) than model control group since the 5 th day.Microarray analysis showed that compared with model control group,106 genes were upregulated and 92 genes were downregulated in TRNM group.The expression of CYP1A1 and IGFBP-1,which have a close relationship with hypertension and organ damage,was significantly changed by Twirling-reducing needling.ConclusionTwirling-reducing needling manipulation at Taichong and Quchi can significantly lower the SBP of stress﹣induced pre-hypertension rats and effect its gene expression in kidney.

Keywords：acupuncture;twirling-reducing needling manipulation;stress-induced pre-hypertension;gene chip

DOI:10.13463/j.cnki.cczyy.2016.03.007

基金項目：國家自然科學基金“基于系統生物學的針刺對應激性前期高血壓的調控機制與干預靶點的研究”(81373727)。

作者簡介：紀智(1990-)，男，碩士研究生，主要從事針灸臨床及機理研究。

*通信作者：劉清國，男，教授，電話-13691517881，電子信箱-liuqingguo999@vip.sina.cn

中圖分類號：R245.3

文獻標志碼：A

文章編號：2095-6258(2016)03-0458-04

(收稿日期:2015-11-19)