發酵條件對紅曲產洛伐他汀的影響

張江寧，丁衛英，楊　春

（山西省農業科學研究院農產品加工研究所，山西太原　030006）

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發酵條件對紅曲產洛伐他汀的影響

張江寧，丁衛英，楊春

（山西省農業科學研究院農產品加工研究所，山西太原030006）

摘要：試驗從紅曲霉固態發酵條件入手，通過選擇不同碳源和氮源，研究其對洛伐他汀產量的影響，最終確定以葡萄糖和蛋白胨作為輔助碳源和氮源，此時洛伐他汀產量最高。

關鍵詞：發酵條件；紅曲霉；洛伐他汀

0　引言

紅曲在我國有著悠久的歷史，主要應用于發酵食品、色素等方面。近年來，紅曲霉的次級代謝物洛伐他汀成為研究的熱點，它是一種膽固醇合成抑制劑，能有效地抑制膽固醇生物合成過程中關鍵酶HMG- Co還原酶的活性［1］。洛伐他汀產量受培養基［2］和培養條件的影響很大，在條件不適時產量極微，甚至不產生。因此，本試驗從紅曲霉固態發酵條件入手，通過選擇不同碳源和氮源，研究其對洛伐他汀產量的影響，為科學利用紅曲霉提供技術支持。

1　材料與方法

1.1材料

菌種，安卡紅曲取自中國典型培養物保藏中心。

1.2儀器和試劑

SW- CJ- 2G型超凈工作臺，蘇州凈化設備有限公司產品；GMSX- 280型高壓滅菌鍋，北京市永光明醫療儀器廠產品；甲醇（色譜純），天津市康科德科技有限公司產品；95%乙醇（分析純），萊陽經濟技術開發區精細化工廠產品。

洛伐他汀，配置成200 mg/L的標準溶液；乙醇提取液（75%）的配制為25 mL蒸餾水中加入無水乙醇75 mL，混勻；中性氧化鋁預處理柱用中性氧化鋁置于130℃烘箱中烘烤4 h，使用前稱5 g裝柱（玻璃柱），用10 mL甲醇活化。

1.3培養基

斜面培養基采用土豆培養基；種子液培養基（g/L）為葡萄糖60 g，蛋白胨20 g，NaNO310 g，MgSO4·7H2O 5 g，KH2PO410 g，121℃滅菌20 min［3］；固態發酵培養基：大米經清洗，放置于水中浸泡15 h后取出，蒸煮至大米顆粒分散、微黏狀態。蒸煮后的大米置于塑料發酵培養瓶中，于121℃，0.1 MPa的滅菌鍋內滅菌30 min。

1.4培養方法

（1）試管斜面菌種培養。挑取1環貯藏菌種接種于斜面培養基中，于31℃恒溫箱中擴大培養1周，置于4～5℃冰箱中貯藏備用。

（2）孢子懸液的制備。斜面種子試管加無菌生理鹽水，將孢子刮下置于三角瓶中。以轉速200 r/min在搖床上放置0.5～1.0 h，觀察孢子狀態，孢子完全活化分散開后，用無菌脫脂棉過濾孢子液，濾液即為單孢子懸液，最后將孢子稀釋至質量分數約為1× 106～1×107個/ mL。

（3）固態發酵。將三角瓶中的孢子懸液按照一定的接種量接種，于裝有50 g固態發酵培養基的250 mL培養容器中，于30℃恒溫培養20 d［4］。

1.5洛伐他汀含量測定方法［5］

1.5.1色譜條件

色譜柱采用Phenomenex kromasil 5U 100A C18型，250 mm×4.6 mm×5 μm；流動相為甲醇+水（90+ 10），流速1.0 mm/min，壓力140 Bar，波長237 nm，保留時間5～6 min，進樣體積10 μL；該方法檢出最小質量分數為2 mg/kg。

1.5.2測定步驟

（1）標準曲線配制。用洛伐他汀標準溶液200mg/L逐級配制0，0.04，0.10，0.50，1.00，2.00，5.00，10.00，20.00 mg/L標準系列。

（2）樣品處理及測定。準確稱取混勻樣品1.0 g 于25 mL容量瓶或試管中，加入乙醇提取液15 mL左右（平行做3份），超聲波提取30 min，補加提取液至刻度，收集濾液。準確吸取濾液5.0 mL，通過預先活化好的中型氧化鋁小柱，用9.0 mL甲醇（3.0，3.0，3.0 mL分3次）洗脫。收集洗脫液定容10.0 mL，用高效液相色譜測定。通過被測樣品液組分與標準液保留時間對比進行定性，利用被測樣品液組分的峰面積與標準液峰面積對比進行定量。

（3）結果計算。

1.6培養條件對洛伐他汀產量的影響

1.6.1碳源種類對洛伐他汀產量的影響

分別添加5%的葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、可溶性淀粉、甘油［6］、玉米粉為附加碳源，按照固態發酵方法進行固態發酵，通過1.5中的檢測方法檢測洛伐他汀的含量。

1.6.2氮源種類對洛伐他汀產量的影響

分別添加2%的有機氮源大豆粉［7］、蛋白胨［8］、酵母膏，以及無機氮源NaNO3［9］，NH4NO3，NH4Cl為附加氮源。

2　結論

2.1碳源種類對洛伐他汀產量的影響

碳源是紅曲霉生長代謝重要的物質之一，提供菌體代謝所需要的能量，同時也是構成菌體細胞及各種代謝產物的主要成分。

碳源種類對洛伐他汀產量的影響見圖1。

由圖1可知，葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、可溶性淀粉、甘油、玉米粉作為附加碳源時都能不同程度的增加，其中葡萄糖作為附加碳源時洛伐他汀的產量最高，達到13.6 mg/g，有顯著差異，因此葡萄糖是該菌株固態發酵的最適碳源。

2.2氮源種類對洛伐他汀產量的影響

圖1　碳源種類對洛伐他汀產量的影響

氮在微生物的生長代謝中具有重要的作用，因為氮元素是構成微生物細胞內核酸和蛋白質的重要成分。因此，在微生物生長過程和代謝產物的合成過程中，氮源也是必須的。以固態發酵培養基為基本培養基進行發酵，檢測洛伐他汀的含量，以蛋白胨為附加氮源洛伐他汀的產量最高，與其他幾種氮源相比差異比較明顯。大豆粉與酵母膏之間差異不顯著，NaNO3與NH4Cl之間差異也不顯著，總體來講有機氮源洛伐他汀產量大于無機氮源，因此選擇影響最大的蛋白胨作為固態發酵生產洛伐他汀的氮源。

氮源種類對洛伐他汀產量的影響見圖2。

圖2　氮源種類對洛伐他汀產量的影響

3　結論

本試驗通過對洛伐他汀固態發酵條件的分析，確定了分別以葡萄糖和蛋白胨作為發酵生產洛伐他汀的輔助碳源和氮源，此外還有一些其他因素對發酵產物也有著不可忽視的影響。例如，接種量大小、發酵溫度與發酵時間，同時紅曲中的洛伐他汀含量達到較高值時，其中的毒害物質桔霉素含量的高低也是應關注的關鍵點，在以后的工作中有待進一步研究。

參考文獻：

［1］沈平，伍軍，李浩然，等.紅曲固態發酵生產洛伐他汀的實驗條件優化［J］.北京農學院學報，2005（3）：47-79.

［2］童愛均，呂旭聰，劉曉艷，等.固體發酵基質和外加碳氮源對紅曲霉色素產量的影響［J］.中國調味品，2015（5）：5-10.

［3］陳勉華，吉達維，馬人杰，等.不同發酵基質對紅曲重要代謝產物的影響［J］.中國釀造，2013（3）：22-24.

［4］許贛榮，陳曄，陳蘊，等.無桔霉素高比例開環式莫納可林K紅曲產品的生產［J］.食品與發酵工業，2004（10）：59-63.

［5］羅仁才，孫開奇，謝申猛，等.紅曲中洛伐他汀總量的測定方法［J］.衛生研究，2003（2）：157-158.

［6］Miyake T，Uchitomi K，Zhang M Y，et al. Effects of the principal nutrients on lovastatin production by monascus pilosus［J］. Biosci Biotechnol Biochem，2006，70（5）：1 154-1 159.

［7］熊曉輝，張李陽，韋策，等.紅曲霉菌產Monacolin K固體發酵條件的優化［J］.無錫輕工大學學報，2004，23（1）：9-13.

［8］董永勝，劉同軍，賈士儒，等.紅曲霉固態發酵生產Monacolin K工藝條件的研究［J］.食品研究與開發，2007（6）：27-30.

［9］童振字，周立平，陳旭峰.響應面法優化紅曲霉菌株Monascus purpureus WX液態發酵產Monacolin K工藝條件［J］.浙江工業大學學報，2007（1）：35-40.

Effects of Fermentation Conditions of Monascus Lovastin Production

ZHANG Jiangning，DING Weiying，YANG Chun
（Agricaltural Products Processing Research Insitute，Shanxi Acadeing of Agricultural Science，Taiyuan，Shanxi 030006，China）

Abstract：In this experiment，the operational factors on lovastatin in yield by solid- state fermentation are studied，the result show that the optimum conditions is glucose and peptone as additive carbon source and nitrogen source.

Key words：fermentation；monascus；lovastatin

中圖分類號：TQ463

文獻標志碼：A

doi：10.16693/j.cnki.1671- 9646（X）.2016.05.014

文章編號：1671- 9646（2016）05a- 0050- 02

收稿日期：2016- 01- 30

基金項目：山西省青年科技研究基金項目（2015021144）。

作者簡介：張江寧（1981—），女，碩士，助理研究員，研究方向為食品科學。