聚羥基丙烯酸和4%中性緩沖甲醛對蘇木精伊紅染色及熒光原位雜交檢測乳腺癌HER-2基因影響的比較

陳志強，王 瑩，米賢軍，陳 昂，鐘守軍，黃華勇，鄧文同，劉超凡，徐秀梅，代新珍

南方醫科大學附屬中山博愛醫院病理科，廣東 中山528400

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聚羥基丙烯酸和4%中性緩沖甲醛對蘇木精伊紅染色及熒光原位雜交檢測乳腺癌HER-2基因影響的比較

陳志強，王 瑩，米賢軍，陳 昂，鐘守軍，黃華勇，鄧文同，劉超凡，徐秀梅，代新珍

南方醫科大學附屬中山博愛醫院病理科，廣東 中山528400

［摘要］背景與目的：適當的組織固定、透明脫蠟是蘇木精伊紅(hematoxylin eosin，HE)染色及熒光原位雜交（fluorescence in situ hybridization，FISH)檢測乳腺癌HER-2基因一個重要的步驟。該研究旨在對比環保固定液聚羥基丙烯酸和4%中性緩沖甲醛固定制作的組織切片HE染色優良率，熒光原位雜交檢測兩者固定制作的乳腺癌組織切片的HER-2基因擴增陽性率，探討其替代傳統固定液4%中性緩沖甲醛的可行性。方法：收集中山市博愛醫院2011年3月—2015年1月門診及住院部送檢的乳腺癌69例、乳腺纖維腺瘤41例、子宮平滑肌瘤40例、宮頸組織25例、胎盤組織25例，各取材2塊，每例標本的2塊組織用抽簽法隨機分2組，一組采用4%中性緩沖甲醛固定制作HE切片200張，另一組采用聚羥基丙烯酸固定制作HE切片200張。依據切片染色情況判定切片等級，采用SPSS 19.0比較兩者HE染色優良率；兩組乳腺浸潤性導管癌組織再各制作切片69張，采用SPSS 19.0比較FISH技術檢測的HER-2基因擴增率。結果：① 聚羥基丙烯酸、4%中性緩沖甲醛固定組組織切片HE染色優質片分別為155張、166張，優良片41張、33張，中等片3張、1張，差片1張、0張，染色優良率分別為98.0%、99.5%，兩組間優良率差異無統計學意義(χ2=1.33，P=0.25)。② 聚羥基丙烯酸、4%中性緩沖甲醛固定組組織切片FISH陽性率分別為26.09%、23.19%，兩組間陽性率差異無統計學意義(χ2=0.50，P＞0.05)。結論：聚羥基丙烯酸固定制作的組織切片HE染色效果及熒光原位雜交檢測乳腺癌HER-2基因擴增效果跟傳統固定液4%中性緩沖甲醛相比差異無統計學意義，符合環保要求，有推廣使用的可能。

［關鍵詞］聚羥基丙烯酸；甲醛；組織切片；蘇木精伊紅染色；乳腺癌；HER-2基因；熒光原位雜交

Correspondence to: CHEN Zhiqiang E-mail: 765228687@qq.com

甲醛固定組織制作蠟塊是蘇木精伊紅(hematoxylin eosin，HE)染色及熒光原位雜交（fluorescence in situ hybridization，FISH)檢測乳腺癌HER-2基因必不可少的步驟。但甲醛具有刺激性，并增加周圍人群免疫疾病和癌癥的風險［1］。隨著人們環保意識的提高，甲醛的危害性逐漸讓人們產生能否尋求作為病理學固定“金標準”試劑［2］-4%中性緩沖甲醛環保替代品的想法。事實上，在過去的20年中，國內外學者一直在嘗試使用各種新型環保固定劑替代甲醛應用于病理工作的研究。本研究旨在探討環保試劑替代傳統試劑在HE染色、FISH技術中的可行性，為摸索出綠色病理所需之環保產品提供參考依據。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 主要試劑及儀器

聚羥基丙烯酸固定液由廣州市艾發生物醫學技術工程有限公司生產(單純固定液，工作液是純溶液，固定速度是1 mm/h，第一類醫療器械生產企業登記證號：20090363，10～30 ℃溫度下保存)。甲醛溶液為廣州市東紅化工廠生產，蘇木精染液(哈瑞氏)、伊紅染液(醇溶性)由中國上海宏茲實業有限公司生產。SAKURA Tissue Tek Vip-5全自動密閉式組織脫水機、DRS-2000J-D2全自動染色機均為日本櫻花檢驗儀器株式會社生產。Thermo HM325輪轉石蠟切片機為德國Thermo公司生產，切片厚度2～3 μm。BJ43-PAS8000病理圖像分析儀由北京市中西集團公司生產。OLYMPUSBx51熒光顯微鏡由日本奧林巴斯株式會社生產。探針：TERC探針由中國北京金菩嘉醫療科技有限公司提供，為GLP HER-2/CSP17探針。

1.1.2 標本來源

中山市博愛醫院2011年3月—2015年1月門診及住院部送檢的各種組織標本200例，分別固定在4%中性緩沖甲醛液及聚羥基丙烯酸溶液中12 h。其中大標本有：乳腺癌69例、乳腺纖維腺瘤41例、子宮平滑肌瘤40例、胎盤組織25例，同一病變部位各取材2塊，組織按照標準取材大小（1.0 cm×1.0 cm×0.2 cm）切取。小標本有宮頸組織25例，同一病變部位各取材2塊，按照0.5 cm×0.3 cm×0.2 cm大小取材。69例乳腺癌患者均為女性，年齡33～76歲，平均(54.2±2.5)歲。術前未行任何輔助治療(內分泌治療、放療、化療)，病理診斷均為乳腺浸潤性導管癌。各標本均見明顯的腫瘤。

1.2 實驗方法

1.2.1 組織處理

活體組織分別直接置于聚羥基丙烯酸和4%中性緩沖甲醛液中，量是標本體積的10倍，標本固定12 h后取材。置于全自動組織脫水機中進行脫水、透明和浸蠟等處理。詳細步驟如下：聚羥基丙烯酸和4%中性緩沖甲醛液分別固定2 h，75%、80%、85%、90%、95%、100%、100%乙醇分別固定1 h、1 h、1 h、1 h、50 min、50 min、45 min，二甲苯×2各50 min，石蠟×4各45 min，次日上午7:30包埋、切片厚2～3 μm，裱片于防脫片載玻片上。

1.2.2 傳統HE染色

兩組切片分別經二甲苯×3各5 min，100%、95%、80%、75%乙醇各3 min，流水洗，蘇木精染12 min，流水洗，1%鹽酸乙醇分化數秒，流水洗，1%氨水返藍1 min，流水洗，1%醇溶性伊紅染1 min，70%、95%乙醇各30 s，100%乙醇×2各2 min，二甲苯×2各2 min，中性樹膠封固。每張組織切片的HE染色均在相同的條件下進行，以保證結果的客觀性和可信度。

1.2.3 HE結果的判斷與評分

對常規病理切片染色結果的評定借助BJ43-PAS8000圖像采集分析儀采用的標準是色度分析，依據中國常規病理切片質控中心推薦的質控評分標準［3］，評議內容包括：脫蠟度、透明度、著色度和顏色鮮亮度情況等。評議結果分為4級：優質、優良、中等、差。具體標準是：

① 優質：脫蠟好、透明度好、著色適中、顏色鮮亮的切片；② 優良：測試片中所有組織染色都很好，但是有些背景；③ 中等：測試片中所有組織染色普遍較弱，或出現大量背景；④ 差：測試片中所有組織染色非常弱，或根本不染色。切片優良率=(優良片數+優質片數）/總切片數。

1.2.4 乳腺癌樣本玻片FISH預處理程序

將組織切片置于65 ℃過夜烘烤，老化玻片。將組織切片浸于二甲苯中脫蠟、復水。50 ℃下用質量分數為300 g/L酸性亞硫酸鈉處理組織切片20～30 min。90 ℃下用水處理組織切片30 min。室溫下于2×SSC溶液中漂洗2次，每次5 min。將組織切片浸泡在200 μg/mL蛋白酶K工作液中，37 ℃下溫育5～30 min，于2×SSC溶液中漂洗2次，每次5 min。室溫下于聚羥基丙烯酸和4%中性緩沖甲醛固定液中分別固定10 min。室溫下將組織切片玻片依次置于梯度乙醇脫水，加熱玻片至56 ℃。

1.2.5 標本準備及變性玻片和探針混合液

在質量分數為70%的甲酰胺/2×SSC變性液中，溫度72～74 ℃變性5 min，-20 ℃預冷的70%、85%和100%乙醇梯度脫水各3 min，玻片自然干燥，置于45～50 ℃烤片機上預熱2～5 min后與探針雜交。

1.2.6 探針與樣本雜交

將變性后的探針混合液10 μL滴于玻片雜交區域，將玻片置于預熱的濕盒中，42 ℃保溫箱中過夜雜交。

1.2.7 玻片洗滌

將玻片置于3瓶50%甲酰胺/2×SSC溶液中，各漂洗10 min；將玻片置于2×SSC溶液中，漂洗10 min；將玻片置于0.1% NP-40/2×SSC溶液中，漂洗5 min；將玻片室溫浸泡在70%乙醇中，漂洗3 min。

1.3 結果觀察

首先在HE染色切片上確認癌細胞區域，然后在10倍物鏡下，在FISH標本上找到與HE染色切片上相同的組織細胞結構，仔細觀察信號。在40倍物鏡下掃描整張切片，觀察是否存在HER-2表達的異質性，以及標本的質量，滿意的標本應在75%以上。癌細胞核中都有雜交信號，在100倍物鏡下觀察癌細胞核的FISH結果并進行信號計數和比值計算［4］。計數30個細胞，統計Ratio值(Ratio值=30個細胞核中紅信號總數/30個細胞核中綠信號總數)。

1.4 結果分析

計數細胞必須是各通道信號均清晰可辨的細胞，細胞核輪廓不清或有重疊的不分析，雜交不均勻的區域不分析。背景深影響信號判斷的區域不分析。在分析石蠟切片時，分析的區域應在腫瘤細胞集中的部位(需由病理科醫師認定)。如果超過25%的細胞核內信號太弱，則該區域不進行分析。如果超過10%的細胞質內有信號，則該區域不進行分析。

1.5 結果判斷

Ratio值＜1.8為陰性結果，提示該樣本無HER-2基因擴增；Ratio值＞2.2為陽性結果，提示樣本中HER-2基因發生擴增；Ratio值介于1.8~2.2之間時，可以選擇增加計數細胞至100個，或重做FISH實驗來判斷最終結果。

1.6 統計學處理

采用SPSS 19.0統計軟件進行統計學分析。切片HE染色優良率、FISH結果符合率的差異均用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 HE染色

兩組固定液制片HE色彩鮮艷，細胞核與細胞質對比分明(圖1、2)。聚羥基丙烯酸、4%中性緩沖甲醛固定組組織切片HE染色優質片分別為155張、166張，優良片41張、33張，中等片3張、1張，差片1張、0張。染色優良率分別為98.0%、99.5%，兩組間優良率差異無統計學意義(χ2=1.33，P=0.25)。

圖1　聚羥基丙烯酸固定后宮頸組織HE染色結果Fig.1 The results of HE staining in cervical tissues fixed by poly hydroxy acrylic acid

圖2　4%中性緩沖甲醛固定后宮頸組織HE染色結果Fig.2 The results of HE staining in cervical tissues fixed by 4% neutral buffered formaldehyde

2.2 FISH檢測結果

兩組固定液制片，采用FISH檢測乳腺癌HER-2表達，熒光顯微鏡下均發出可被肉眼識別的熒光信號，背景清晰(圖3、4)。聚羥基丙烯酸、4%中性緩沖甲醛固定組組織切片FISH陽性率分別為26.09%、23.19%，兩組間陽性率差異無統計學意義(χ2=0.50，P=0.5，表1)。

表1　兩組固定液制片乳腺癌HER-2基因FISH檢測結果Tab.1 Detection results of HER-2 gene by FISH with two groups of fixative solution in producing section

圖3　聚羥基丙烯酸固定后乳腺癌HER-2基因檢測結果Fig.3 Detection results of HER-2 gene in breast cancer tissues fixed by poly hydroxy acrylic acid

圖4　4%中性緩沖甲醛固定后乳腺癌HER-2基因檢測結果Fig.4 Detection results of HER-2 gene in breast cancer tissues fixed by the 4% neutral buffered formaldehyde fixative solution

3 討 論

優質的HE切片仍是臨床的病理診斷最根本的依據。其制作需經過一系列技術流程，其中最關鍵的就是組織固定，組織標本常用4%中性緩沖甲醛固定。乳腺癌是婦女最常見的惡性腫瘤之一，HER-2是浸潤性乳腺癌的重要臨床生物標志物，HER-2受體陽性與乳腺癌不良預后有關，并認為是獨立于其他因素之外的指標，其意義不亞于淋巴結轉移情況對乳腺癌預后的影響。HER-2狀態應該在所有新診斷和復發性乳腺癌中確定［5-7］。Shirsat等［8］指出乳腺癌靶向基因FISH檢查可作為HER-2基因狀態常規管理的一個低成本篩查。

將組織浸入某些化學試劑，使組織、細胞內的物質盡量保持其生活狀態時的形態結構和位置，這一過程稱為固定［9］。恰當的固定液應該在一定的溫度下，能省時省力又能確保效果。固定不當的標本，細胞的通透性降低，對染料的物理化學作用減弱，附著力降低，生物染料的發色團和助色團很難與被染物結合，造成在組織切片染色定位不佳，模糊不清，甚至沒著色等現象，直接延誤病理診斷［10-12］。

4%中性緩沖甲醛固定液一直是病理界固定的權威試劑，近年來隨著人們環保意識的增強，人們發現甲醛暴露可導致蛋白質生理和病理功能的修改，干擾基因正常表達［13］。國際癌癥研究機構認定甲醛是環境污染物，主要模式是DNA-蛋白質交聯的形成，使細胞的細胞毒性和細胞凋亡增加，特別是作用于造血干細胞上［14］，引起鼻咽癌、白血病［15］，使孕期的胎兒患腎母細胞瘤風險增加［16］。在馬德里召開的第二次國際科學會議討論了甲醛遺傳毒性，大量新的科學數據表明甲醛主要影響外源性和內源性生物DNA的形成［17］。

環保試劑近幾年來一直是國內外大醫院極力推薦的試劑，國外已有使用無害化學試劑替代4%中性緩沖甲醛固定液進行病理制片的相關報道［18-20］，國內董愉等［21］報道乙醚酒精固定液固定的冷凍切片HE染色效果最佳。張麗榮等［22］研究證實FineFix固定液與福爾馬林液固定的組織進行對比，經FineFix固定的組織形態結構完整，尤其在提取DNA和RNA的質和量上具有明顯的優越性。汪偉等［23］研究顯示PB-FA混合固定液，經PAS染色后基底膜得到更加清晰的顯示，從而提高了腎活檢穿刺病理診斷的準確性。裴希等［24］用FAA固定液處理后的眼球，能使纖維組織較多偏硬的鞏膜得到軟化，易脫水、浸蠟和切片。田玉旺等［25］應用GS環保試劑HE染色，色彩鮮艷，核漿對比分明，與傳統HE染色結果相比差異無統計學意義。

以熒光標記DNA進行FISH對檢測乳腺癌石蠟組織HER-2原癌基因的核苷酸序列技術方法而言是公認的比較成熟的、比較權威的方法［26］。Rosa等［27］研究證實人HER-2在20%~30%的原發性浸潤性乳腺癌中有基因擴增和蛋白的過表達。Lee等［28］對971例浸潤性乳腺癌HER-2基因的FISH圖像文件進行回顧性分析指出組織前固定可能會影響到HER-2基因擴增狀態的結果。美國臨床腫瘤學家Portier等［29］指出延遲固定時間1~3 h通過FISH對HER-2檢測雜交信號有明顯影響。王瑩［30］嘗試應用環保型GS試劑取代傳統試劑，并應用FISH技術檢測HPVL1殼蛋白的表達，探討GS環保試劑對HPVL1殼蛋白檢測的影響。張進華等［31］應用GS環保試劑制作的石蠟切片提取DNA，進行實時熒光定量VCR技術擴增，并與常規方法制作的石蠟切片進行比較，結果證實GS液能較好地保存組織中的DNA。Fischer等［32］用非醛固定液固定組織，發現大多數細胞HER-2免疫組化抗原正常表達。

縱觀國內外文獻，并未見報道聚羥基丙烯酸、甲醛對HE染色優良率及對FISH檢測乳腺癌HER-2基因擴增陽性率的差異比較，且上述報道并未對實驗數據進行統計學分析。

本研究組織前固定時間為12 h，從取材到制成HE切片時間控制在24 h內符合病理規章制度要求，作者應用新型環保固定液聚羥基丙烯酸組織固定硬組織如乳腺纖維腺瘤，軟組織如胎盤組織，大組織如乳腺浸潤性導管癌組織，小組織如宮頸組織，質地致密組織如乳腺浸潤性導管癌組織，質地疏松組織如絨毛組織，良性組織如乳腺纖維腺瘤組織，惡性組織如乳腺浸潤性導管癌這種對固定質量要求比較高的組織。最后大體觀察：無因固定不當造成的組織皺縮、變硬、切片不完整、龜裂等現象；從放大40~200倍鏡下所見：色彩鮮艷，細胞核與細胞質對比分明，分裂相染色體表現黑藍色，各種成分層次分明。切片HE染色片的優良率控制在98%以上，符合病理科醫療質量與安全考核方案的規定：標準常規石蠟包埋HE染色片的優良率(優質、優良切片所占的比例)不低于95%，優級率(甲級切片所占的比例)不低于35%，與傳統試劑4%中性緩沖甲醛固定液制作的HE染色結果優良率相比差異無統計學意義。

甲醛固定組織的主要作用機制是醛基與氨基基團形成可逆的羥甲基衍生物和穩定的亞甲基橋從而使甲醛和蛋白質發生廣泛的交聯，可能使甲醛改變許多生物分子，包括核酸和蛋白質［33］。聚羥基丙烯酸固定組織的主要作用機制可能是羥基和羧基基團發生可逆的酯化反應，羧基和氨基集團中和反應，前者生成穩定的酯化物、硬化組織，后者維系穩定的反應條件，從而使聚羥基丙烯酸和蛋白質發生廣泛的交聯［34］。

本研究中聚羥基丙烯酸固定乳腺浸潤性導管癌組織，切片HER-2基因FISH陽性率為26.09%，4%中性緩沖甲醛固定乳腺浸潤性導管癌組織，切片HER-2基因FISH陽性率為23.19%，與劉秋雨等［35］報道的44例乳腺癌FISH檢測HER-2基因，陽性10例，陽性率為23%，基本一致。

綜上所述，應用聚羥基丙烯酸無毒、無揮發、固定效率高，減少了甲醛對環境的污染，改用新型環保組織固定液具有環保與學術價值。然而，迄今為止，因在質量控制、標準化、成本價格和毒力試驗等方面原因，沒有哪個環保固定液替代品能撼動4%中性緩沖甲醛的地位，環保固定液應用在組織前固定只停留在試驗階段：HE染色組織形態好，但由于本研究并沒囊括病理科所有標本種類的固定，作為一種新型環保試劑問世時間短，遠期效果還有待在多種組織大樣本量去驗證。FISH檢測乳腺癌HER-2基因效果佳，雖然與4%中性緩沖甲醛相比較陽性率差異無統計學意義，但到底以哪個陽性率為準會對后期指導個體化治療產生不同的后果。如果結合檢測同一標本使用2種固定液的HER-2的免疫組化染色，以初步確定不同的陽性率是聚羥基丙烯酸固定產生的假陽性還是4%中性緩沖甲醛固定產生的假陰性又或是存在手工操作存在差異的可能，效果可能會更佳。

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Comparison of the role that poly hydroxy acrylic acid plays in the detection of HER-2 gene in breast cancer by hematoxylin and eosin staining and fluorescence in situ hybridization with that of 4% neutral buffered formaldehyde

CHEN Zhiqiang， WANG Ying， MI Xianjun， CHEN Ang， ZHONG Shoujun， HUANG Huayong， DENG Wentong LIU Chaofan， XU Xiumei， DAI Xinzhen （Department of Pathology， Zhongshan Boai Hospital Affiliated to Southern Medical University， Zhongshan 528400，Guangdong Province， China）

［Key words］Poly hydroxyl acrylic acid； Formaldehyde； Tissue section； Hematoxylin eosin staining； Breast cancer； HER-2 gene； Fluorescence in situ hybridization

［Abstract］Background and purpose: Adequate tissue fixation， transparent dewaxing is an important step of hematoxylin eosin （HE） staining and fluorescence in situ hybridization （FISH） in detection of breast cancer HER-2 gene.The purpose of this study was to make a comparison between poly hydroxyl acrylic acid which is an environmentally friendly fixation liquid and 4% neutral buffered formaldehyde in tissue fixation for HE staining and FISH to detect the HER-2 gene in the breast cancer tissue sections.The study aimed to evaluate the feasibility of replacing 4% buffered formaldehyde， a traditional fixation liquid， with the poly hydroxyl acrylic acid， an environmentally friendly fixationfluid.Methods: This project was performed on tissue samples collected from 69 cases of breast cancer， 41 cases of breast fibroadenoma， 40 cases of uterine leiomyoma， 25 cases of cervical tissue， 25 cases of placenta obtained from the outpatient and inpatient departments of Zhongshan Boai Hospital from Mar.2011 to Jan.2015， from each of which two samples were drawn and two blocks of each specimen were divided into two groups randomly.Then one group was fixed with 4% neutral buffered formaldehyde and made into 200 sections by HE while the other group was fixed with poly hydroxyl acrylic acid and made into another 200 sections.The slice level of the two groups was determined by the staining condition of the sections， and SPSS 19.0 was employed to compare the excellent and good rate of HE staining.Additional 69 sections were produced with two groups of breast invasive ductal carcinoma tissues， and SPSS 19.0 was used to detect the amplification of HER-2 gene by FISH.Results: First， the number of best-quality slices stained with HE fixed separately by poly hydroxyl acrylic acid and 4% neutral buffered formaldehyde was 155 and 166， respectively.The number of excellent pieces was 41 and 33， respectively， while the number of mediocre pieces was 3 and 1 with bad pieces being 1 and 0， respectively.The excellent and good rates of HE staining were 98% and 99.5%， respectively.There was no significant difference between the two groups （χ2=1.33， P＞0.05）.Second， the positive rates of the tissue slices by FISH fixed separately by poly hydroxyl acrylic acid and 4% neutral buffered were 26.09% and 23.19%，respectively.There was no significant difference between the two groups （χ2=0.50， P>0.05).Conclusion: The results obtained with HE staining and FISH using poly hydroxyl acrylic acid as a fixation liquid are not significantly different from those using 10% neutral buffered formaldehyde.Therefore， poly hydroxyl acrylic acid meets the requirements of environmental protection， and thus has the potential to be promoted and widely used.

DOI:10.3969/j.issn.1007-3969.2016.2.001

中圖分類號：R737.9

文獻標志碼：A

文章編號：1007-3639(2016)2-0121-07

基金項目：廣東省醫學科研基金立項課題（A2011746）；中山市科技計劃項目重大專項（20113A004）；中山市局立項課題（2014J128）。

通信作者：陳志強 E-mail：765228687@qq.com

收稿日期：（2015-06-18 修回日期：2015-09-13）