乳腺癌中HER-2基因多態性與蛋白表達的相關性研究

蘇永輝，姜永冬，謝靜靜，龐達哈爾濱醫科大學附屬腫瘤醫院乳腺外科，黑龍江 哈爾濱 150081

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乳腺癌中HER-2基因多態性與蛋白表達的相關性研究

蘇永輝，姜永冬，謝靜靜，龐達
哈爾濱醫科大學附屬腫瘤醫院乳腺外科，黑龍江 哈爾濱 150081

［摘要］背景與目的：致病基因的多態性可能會影響該基因的功能，從而引起個體腫瘤易感性的差異和個體內生物活性物質效應的改變。本研究旨在研究HER-2基因多態性與其蛋白表達的關系，并分析其與乳腺癌臨床病理特征的相關性。方法：收集303例漢族女性乳腺癌患者為研究對象，運用MassARRAY技術平臺檢測HER-2基因rs2517954和rs2517955單核苷酸多態性。同時采用免疫組織化學法檢測相應乳腺癌組織中HER-2蛋白表達并檢測雌激素受體（estrogen receptor，ER）、孕激素受體（progesterone receptor，PR）、P53及Ki67表達。以Pearson χ2分析這兩個位點和其蛋白表達的關系，并分析其與乳腺癌臨床病理特征的相關性。結果：在共顯性模型下，HER-2基因rs2517954和rs2517955位點多態性與其蛋白表達相關（χ2=9.613，P=0.008；χ2=9.613，P=0.008）。在顯性模型下，HER-2基因rs2517955位點TT純合突變型和CT雜合突變型的頻率與其蛋白表達相關（χ2=8.894，P=0.003）。HER-2基因rs2517954和rs2517955位點多態性與患者的臨床分期、腫瘤大小、組織學分級、淋巴結轉移、ER、PR、Ki67及P53表達均無顯著相關性（P＞0.05）。結論：HER-2基因rs2517955多態性位點與其蛋白表達具有相關性，對該位點進一步研究可能有助于闡明乳腺癌中HER-2蛋白的表達機制。

［關鍵詞］乳腺癌；HER-2基因；基因多態性；rs2517954；rs2517955

Correspondence to: PANG Da E-mail: pangdasir@163.com

HER-2基因定位于17號染色體上，編碼跨膜受體樣蛋白，具有酪氨酸激酶活性，能促進細胞分裂、細胞增殖和細胞轉化［1］。HER-2蛋白由HER-2基因編碼，其在乳腺癌細胞中過表達，與腫瘤的侵襲性表型、生存期短及對內分泌藥物的耐藥現象相關［2］。致病基因的多態性可能會影響該基因的功能，從而引起個體腫瘤易感性的差異和個體內生物活性物質效應的改變。有研究顯示，HER-2基因655位密碼子（Ile655Val）多態性可能增加乳腺癌的易感性，但不同的研究結果尚存在分歧［3-5］。同時，Ile655Val多態性與HER-2陽性乳腺癌使用靶向藥物曲妥珠單抗治療所致的心臟不良反應相關［6］。但是，目前尚無關于HER-2基因多態性與HER-2蛋白表達的相關報道。本文通過MassARRAY方法檢測303例原發性乳腺癌患者HER-2基因rs2517954和rs2517955位點多態性，研究這兩個位點和其蛋白表達的關系，并分析其與乳腺癌臨床病理特征的相關性，以探討其在乳腺癌發病中的潛在價值。

1 資料和方法

1.1 研究對象

哈爾濱醫科大學附屬腫瘤醫院乳腺外科2011 年3月—2011年12月收治的原發性乳腺癌患者303例，均為漢族女性，均經病理證實，且入組前均未接受任何抗癌治療。本研究由哈爾濱醫科大學研究倫理委員會審查認可，所有患者均簽署知情同意書，同時收集患者的臨床信息。

1.2 免疫組織化學法檢測

采用免疫組織化學法對乳腺癌組織蠟塊標本進行雌激素受體（estrogen receptor，ER)、孕激素受體（progesterone receptor，PR)、HER-2、Ki67和P53檢測。ER和PR可見明顯的細胞核著色，且≥10%為陽性，無著色或陽性腫瘤細胞數＜10%和著色弱且陽性腫瘤細胞數＞10%為陰性。HER-2可見細胞膜著色，≥30%腫瘤細胞呈現強而完整均勻的細胞膜著色為陽性，無著色或陽性腫瘤細胞數＜10%和著色弱且陽性腫瘤細胞數＞10%為陰性。Ki67、 P53標記陽性結果為腫瘤細胞的細胞核呈棕黃色或棕褐色顆粒，Ki-67判斷標準：陽性細胞數≥14%為陽性，＜14%為陰性；P53判斷標準：陽性細胞數≥10%為陽性，＜10%為陰性。

1.3 DNA提取和引物設計

抽取乳腺癌患者清晨空腹外周EDTA抗凝血樣本2 mL，采用愛思進生物技術（杭州）有限公司DNA提取試劑盒提取基因組DNA，-80 ℃保存。

引物設計由華大基因公司按照MassARRAY分子量陣列分析系統的要求，利用Assay Designer引物設計軟件設計相應的引物及探針并合成。

1.4 基因型檢測

提取純化后的基因組DNA樣品定量稀釋至100 ng/μL，按設計順序每孔加1 μL樣品于384孔板上，然后添加PCR擴增體系使反應物的終濃度如下：0.5 U的Taq聚合酶，100 ng基因組DNA，各0.1 pmol的PCR引物，500 μmol的脫氧核糖核苷三磷酸（deoxyribonucleoside triphosphate，dNTP）。PCR反應條件為：94 ℃ 15 s；94 ℃20 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min(45 個循環)；72 ℃3 min，4 ℃保存。添加0.3 U的蝦堿性磷酸酶去除剩余的dNTP。在384孔中加入2 μL單堿基延伸反應液及適量引物，進行單堿基延伸反應。反應條件：94 ℃ 30 s；94 ℃ 5 s，52 ℃ 5 s，80 ℃ 5 s（40個循環）；72 ℃ 3 min。反應產物用樹脂脫鹽60 min后經自動點樣儀點樣于SpectroCHIP（Sequenom）芯片。點樣后的芯片使用MassARRAY Analyzer Compac進行質譜檢測。結果使用Typer4.0軟件分型。

1.4 統計學處理

應用SPSS 13.0軟件進行統計學處理。檢驗HER-2基因rs2517954和rs2517955位點基因多態頻率是否符合Hardy-Weinberg平衡定律，以Pearson χ2分析這兩個位點基因多態性與HER-2蛋白表達和乳腺癌臨床病理學參數的相關性。雙側P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 Hardy-Weinberg平衡檢測

HER-2基因rs2517954位點CC、CT和TT三種基因型頻率分別為18.8%、54.8%和26.4%，分布符合Hardy-Weinberg平衡(P=0.07)。rs2517954位點CC、CT和TT三種基因型頻率分別為26.4%、54.8%和18.8%，分布符合Hardy-Weinberg平衡(P=0.07)。

2.2 HER-2基因rs2517954和rs2517955位點與HER-2蛋白表達的關系

在共顯性模型下，HER-2基因rs2517954位點基因型多態性與HER-2蛋白表達之間具有顯著相關性(χ2=9.613，P=0.008)。在顯性模型下，rs2517954 的CC純合野生型患者HER-2蛋白表達陽性率為26.3%(26/99)，TT純合突變型和CT雜合突變型患者HER-2蛋白表達陽性率為73.7%(73/99)，兩組差異無統計學意義(χ2=2.899，P=0.089，表1)。在共顯性模型下，HER-2基因rs2517955位點基因型多態性與HER-2蛋白表達之間具有顯著相關性(χ2=9.613，P=0.008)。在顯性模型下，rs2517955的CC純合野生型患者HER-2蛋白表達陽性率為15.2%(15/99)，而TT純合突變型和CT雜合突變型患者HER-2蛋白表達陽性率為84.8%(84/99)，兩組差異有統計學意義(χ2=8.894，P=0.003，表1)。

2.3 HER-2基因rs2517954和rs2517955位點與乳腺癌臨床病理特征的關系

HER-2基因rs2517954和rs2517955位點多態性與患者的臨床分期、腫瘤大小、組織學分級、淋巴結轉移、ER、PR、Ki67及P53表達均無顯著相關性(P均＞0.05，表2、3)。

表1　HER-2基因rs2517954和rs2517955位點與其蛋白表達的關系Tab.1 The relationship between HER-2 gene rs2517954 and rs2517955 loci and protein expression

表2　rs2517954與乳腺癌臨床病理特征的關系Tab.2 The relationship between rs2517954 and clinicopathological characteristics of breast cancer

表3　rs2517955與乳腺癌臨床病理特征的關系Tab.3 The relationship between rs2517955 and clinicopathological characteristics of breast cancer

3 討 論

HER-2蛋白由原癌基因HER-2編碼，是結合在細胞膜表面的受體酪氨酸激酶，參與細胞生長和分化的信號轉導途徑。研究表明，在15%~20%的乳腺癌中可以檢測到HER-2蛋白的過表達［7］。轉染HER-2基因的哺乳動物細胞系，DNA合成增強，細胞生長速度加快，侵襲性增強，并且在裸鼠體內成瘤性及轉移能力增強［8］。臨床上HER-2蛋白過表達的乳腺癌患者往往表現出生存率低、腫瘤惡性程度增強、進展迅速、易于發生轉移、化療緩解期短及對三苯氧胺和細胞毒性化療藥耐藥等特點［7，9］。

目前關于HER-2基因多態性的研究主要在于HER-2基因655位密碼子多態性的研究，該位點突變可導致異亮氨酸置換為纈氨酸，從而引起蛋白質結構的改變，可能與乳腺癌的易感性相關［10］，其結果尚存在分歧［3-5，11］。同時該位點的多態性與乳腺癌經不同方案治療的預后相關［12］。HER-2基因rs903506位點與突尼斯人乳腺癌的易感性相關［11］。本文所研究的rs2517954和rs2517955位點均位于HER-2基因的啟動子區域，查詢Hapmap數據庫，rs2517954位點在北京地區漢族人群中CC、CT和TT基因型的頻率分別為29.5%、43.2%和27.3%；rs2517955位點在北京地區漢族人群中CC、CT和TT基因型的頻率分別為22.0%、61.0%和17.1%。這兩個位點基因型的頻率與本組實驗所得數據略有差異，可能與實驗樣本量和研究人群特異性有關。本實驗發現，在共顯性模型下rs2517954和rs2517955位點不同基因型(CC、CT 和TT基因型)與乳腺癌中HER-2蛋白表達相關。且在顯性模型下，rs2517955位點TT純合突變型和CT雜合突變型的頻率與HER-2蛋白表達呈正相關。這種蛋白表達差異的機制尚不清楚。我們推測rs2517955位點可能是轉錄因子結合位點，其基因型的改變可能通過影響DNA的轉錄，從而影響HER-2蛋白的表達。但是，HER-2基因多態性如何調控蛋白表達的機制，尚需進一步的研究證實。

乳腺癌中HER-2蛋白的過表達往往與乳腺癌的組織學分級［13］及ER和PR的表達狀況［14］等臨床病理特征相關。而本研究結果顯示，HER-2基因rs2517954和rs2517955位點多態性與患者的臨床分期、腫瘤大小、組織學分級、淋巴結轉移、ER、PR、Ki67及P53表達均無顯著相關性。

綜上所述，HER-2基因2517955位點多態性與乳腺癌HER-2蛋白的表達具有相關性，對該位點的進一步研究可能有助于乳腺癌患者HER-2狀態評估，也有利于闡明乳腺癌中HER-2蛋白的表達機制。

［參 考 文 獻］

［1］HOLMES W E， SLIWKOWSKI M X， AKITA R W， et al.Identification of heregulin， a specific activator of p185erbB2 ［J］.Science， 1992， 256（5060）： 1205-1210.

［2］MéNARD S， PUPA S M， CAMPIGLIO M， et al.Biologic and therapeutic role of HER2 in cancer ［J］.Oncogene， 2003，22（42）： 6570-6578.

［3］DAHABREH I J， MURRAY S.Lack of replication for the association between HER2 I655V polymorphism and breast cancer risk： a systematic review and meta-analysis ［J］.Cancer Epidemiol， 2011， 35（6）： 503-509.

［4］MA Y， YANG J， ZHANG P， et al.Lack of association between HER2 codon 655 polymorphism and breast cancer susceptibility： meta-analysis of 22 studies involving 19，341 subjects ［J］.Breast Cancer Res Treat， 2011， 125（1）： 237-241.

［5］TAO W， WANG C， HAN R， et al.HER2 codon 655 polymorphism and breast cancer risk： a meta-analysis ［J］.Breast Cancer Res Treat， 2009， 114（2）： 371-376.

［6］BEAUCLAIR S， FORMENTO P， FISCHEL J L， et al.Role of the HER2 ［Ile655Val］genetic polymorphism in tumorogenesis and in the risk of trastuzumab-related cardiotoxicity ［J］.Ann Oncol， 2007， 18（8）： 1335-1341.

［7］SOERJOMATARAM I， LOUWMAN M W， RIBOT J G， et al.An overview of prognostic factors for long-term survivors of breast cancer ［J］.Breast Cancer Res Treat， 2008， 107（3）：309-330.

［8］BAASNER S， VON M H， KLENNER T， et al.Reversible tumorigenesis in mice by conditional expression of the HER2/ c-erbB2 receptor tyrosine kinase ［J］.Oncogene， 1996，13（5）： 901-911.

［9］丁 渭， 鄭春艷， 賀智敏， 等.HER2介導乳腺癌細胞多藥耐藥的作用及機制 ［J］.國際病理科學與臨床雜志， 2005，25（5）： 381-385.

［10］NELSON S E， GOULD M N， HAMPTON J M， et al.A casecontrol study of the HER2 Ile655Val polymorphism in relation to risk of invasive breast cancer ［J］.Breast Cancer Res，2005， 7（3）： R357- R364.

［11］KALLEL I， KHARRAT N， AL-FADHLY S， et al.HER2 polymorphisms and breast cancer in Tunisian women ［J］.Genet Test Mol Biomarkers， 2010， 14（1）： 29-35.

［12］HAN X， DIAO L， XU Y， et al.Association between the HER2 Ile655Val polymorphism and response to trastuzumab in women with operable primary breast cancer ［J］.Ann Oncol，2014， 25（6）： 1158-1164.

［13］HUSSEIN M R， ABD-ELWAHED S R， ABDULWAHED A R.Alterations of estrogen receptors， progesterone receptors and c-erbB2 oncogene protein expression in ductal carcinomas of the breast ［J］.Cell Biol Int， 2008， 32（6）： 698-707.

［14］LAL P， TAN L K， CHEN B.Correlation of HER-2 status with estrogen and progesterone receptors and histologic features in 3，655 invasive breast carcinomas ［J］.Am J Clin Pathol，2005， 123（4）： 541-546.

Association between HER-2 gene polymorphism and protein expression in breast cancer

SU Yonghui，JIANG Yongdong， XIE Jingjing， PANG Da （Department of Breast Cancer Surgery， Harbin Medical University Cancer Hospital， Harbin 150081， Heilongjiang Province， China）

［Key words］Breast cancer； HER-2 gene； Gene polymorphism； rs2517954； rs2517955

［Abstract］Background and purpose: Pathogenic gene polymorphism may affect the function of gene，leading to the difference of individual tumor susceptibility and heterogeneity of bioactive substances in individuals.The purpose of this study was to investigate the interrelationship between HER-2 gene polymorphism and its protein expression， and to evaluate their association with the clinicopathological characteristics of breast cancer.Methods: The data from a total number of 303 female breast cancer patients of Han ethnicity were collected.The MassARRAY platform was used to examine HER-2 gene rs2517954 and rs2517955 single nucleotide polymorphisms.Meanwhile immunohistochemistry was used to detect HER-2 protein expression and corresponding estrogen receptor （ER），progesterone receptor （PR）， P53 and Ki-67 expressions in breast cancer tissues.Pearson chi-square test was used to study the relationship of the two loci and the protein expression， and their correlation with clinicopathological features of breast cancer was analyzed.Results: Under the codominant model， HER-2 gene rs2517954 and rs2517955 loci polymorphisms were associated with its protein expression （χ2=9.613, P=0.008； χ2=9.613, P=0.008）.And under the dominant model， HER-2 gene rs2517955 loci TT homozygous and CT heterozygous mutant was associated with its protein expression （χ2=8.894, P=0.003）.There were no significant correlations between HER-2 gene rs2517954， and rs2517955 loci polymorphisms， and breast cancer patients’ clinical stage， tumor size， histological grade， lymph node metastasis， ER， PR， Ki-67 and P53 expressions （P>0.05).Conclusion: HER-2 gene rs2517955 loci polymorphism is correlated with its protein expression.Further studies may be helpful to elucidate the mechanism of HER-2 protein expression in breast cancer.

DOI:10.3969/j.issn.1007-3969.2015.02.004

中圖分類號：R737.9

文獻標志碼：A

文章編號：1007-3639(2016)02-0140-05

基金項目：國家自然科學基金青年基金項目（81202075）；哈爾濱醫科大學“中俄”合作醫學轉化基金（CR201402）。

通信作者：龐達 E-mail：pangdasir@163.com

收稿日期：（2015-01-04 修回日期：2015-06-07）