藥物性肝病患者髓過(guò)氧化物酶基因多態(tài)性分析

姜月紅，王燕穎.黑龍江省醫(yī)院檢驗(yàn)科，黑龍江哈爾濱　50036；.上海市東方醫(yī)院消化內(nèi)科，上海　000

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藥物性肝病患者髓過(guò)氧化物酶基因多態(tài)性分析

姜月紅1，王燕穎2
1.黑龍江省醫(yī)院檢驗(yàn)科，黑龍江哈爾濱150036；2.上海市東方醫(yī)院消化內(nèi)科，上海200120

［摘要］目的探討髓過(guò)氧化物酶（MPO）基因多態(tài)性與藥物性肝病（DILI）之間的關(guān)系。方法病例采用對(duì)照分析的方法，方便收集37例藥物性肝病患者和30例健康對(duì)照者外周血標(biāo)本，提取DNA進(jìn)行MPO-463G/A多態(tài)性檢測(cè)。結(jié)果MP0-463 GG、GA和AA 3種基因型的頻率在DILI組中分別為86.5％、10.8％和2.7％，在對(duì)照組中分別為73.4％、23.3％和3.3％；將攜帶MP0-463 GA和AA型者合并后與攜帶MPO-463 GG型相比較，患DILI的風(fēng)險(xiǎn)顯著增高，相對(duì)于G等位基因，攜帶A等位基因的個(gè)體患DILI的風(fēng)險(xiǎn)顯著降低，說(shuō)明MP0-463 G/A多態(tài)性與DILI的發(fā)生有關(guān)。結(jié)論髓過(guò)氧化物酶基因多態(tài)性與藥物性肝病易感性之間存在相關(guān)性，值得進(jìn)一步研究。

［關(guān)鍵詞］藥物性肝病；髓過(guò)氧化物酶；基因多態(tài)性

藥物性肝病（Drug-induced liver disease，DILI）是指由于臨床治療、營(yíng)養(yǎng)或藥物濫用所引起的肝細(xì)胞損傷性疾病，其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，主要與藥物、個(gè)體差異和藥物與機(jī)體的相互作用等方面相關(guān)，近幾年關(guān)于診斷DILI沒(méi)有特異性的診斷標(biāo)準(zhǔn)［1］。髓過(guò)氧化物酶（Myeloperoxidase MPO）是中性粒細(xì)胞嗜天青顆粒產(chǎn)生的氧化應(yīng)激相關(guān)酶，能催化產(chǎn)生次氯酸能引起宿主DNA損傷［2］，MPO的基因具有多態(tài)性，不同基因型的個(gè)體MPO基因表達(dá)水平不同，導(dǎo)致個(gè)體對(duì)外源性物質(zhì)易感性的差異，流行病學(xué)研究表明髓過(guò)氧化物酶（MPO）463G/A多態(tài)性與多種疾病相關(guān)。目前已在多種炎癥和惡性腫瘤中觀察到了MPO-463G/A基因多態(tài)性的作用，例如冠心病、大腸癌等疾病的易感性都與MPO-463G/A基因的多態(tài)性有關(guān)。該研究應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)—限制片段長(zhǎng)度多態(tài)性（PCR—RFLP）技術(shù)，對(duì)DILI患者與常規(guī)查體者進(jìn)行基因檢測(cè)及相關(guān)檢查，采用病例—對(duì)照分析，旨在研究MPO基因多態(tài)性與DILI易感性之間的關(guān)系，為DILI的早期診斷和預(yù)防提供新的方法，現(xiàn)報(bào)道如下。

1　資料與方法

1.1一般資料

方便選擇2009年9月—2011年9月黑龍江省醫(yī)院消化內(nèi)科與傳染科及健康體檢者作為研究對(duì)象，分為DILI組、健康對(duì)照組。DILI組：37例，男11例，女26例，年齡25～68歲，平均（40.51±8.21）歲；研究入選標(biāo)準(zhǔn)［3］：①入組患者用藥后，同時(shí)在1～4周內(nèi)發(fā)生肝損害；②患者伴有皮疹、發(fā)熱、瘙癢等過(guò)敏反應(yīng)現(xiàn)象；③經(jīng)檢測(cè)末梢血嗜酸性粒細(xì)胞的水平＞0.06；④患者在臨床上出現(xiàn)有肝內(nèi)淤膽或者肝細(xì)胞損害的特征與病理變化；⑤MIT或者藥物淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果呈陽(yáng)性；⑥檢測(cè)病毒性肝炎結(jié)果為陰性；⑦患者伴有藥源性肝損害的病史，同時(shí)若是應(yīng)用相同的藥物可復(fù)發(fā)。

健康對(duì)照組：30例，其中男9例，女21例；年齡23～63歲，平均（41.23±9.01）歲，所有對(duì)象均無(wú)心、肝、肺等器官疾患，肝功能檢測(cè)無(wú)異常。以上兩組資料得到患者的同意，并通過(guò)倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。在性別年齡構(gòu)成差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

1.2儀器和試劑

Tap DNA聚合酶購(gòu)自日本Takara公司；限制性核酸內(nèi)切酶A ci l購(gòu)自美國(guó)NEB公司；PCR引物由上海博亞生物公司合成；凝膠圖象掃描儀、Gene Amp 2400 PCR儀（美國(guó)ABI公司）。

1.3MPO基因多態(tài)性檢測(cè)

1.3.1DNA提取1 mL新鮮血液離心去掉上層血漿后，加入紅細(xì)胞裂解液至紅細(xì)胞溶血完全，將離心沉淀后的懸液添加150 μL Solution I，應(yīng)用旋渦混勻器震蕩將其搖勻，時(shí)間約為10～25 s，保存在恒溫65℃的條件下，約30 min。在向其加入約300 μL的Solution II進(jìn)行混勻，同樣在65℃條件下保存，離心后去上清液。并在上清液中加入250 μL無(wú)水乙醇。然后取得的溶液進(jìn)行離心吸附柱，向其中加入500 μL的Solution III，進(jìn)行離心后，棄用柱液。再向其中添加Eppendorf15 000 rpm于管中，同時(shí)進(jìn)行離心，約3 min，且收集管。將所得的離心吸附柱放在一個(gè)1.5 mL的離心管中，再次殺菌，且加入60 μL EluteSolution，65℃孵育3 min，溫度控制在65℃的左右，最后應(yīng)用15 000 rpm離心，時(shí)間為1 min，把所收集的DNA保存在-20℃的冰箱中。

1.3.2PCR擴(kuò)增依據(jù)NCBI GeneBank資料：MPO基因長(zhǎng)11kb，位于17q23-q24，其中包含內(nèi)含子11個(gè)、外顯子12個(gè)，基因庫(kù)注冊(cè)號(hào)為M19508。PCR產(chǎn)物為350bp。擴(kuò)增喊MPOG=463基因的PCR引物為下游5'-GCA ATG GTT CAA GCG ATT CTT C-3'及上游5'-CGG TAT AGG CAC ACA ATG GTG AG-3'。每25 μL PCR反應(yīng)液中包含模板DNA100 μg，各種引物0.4 μmol/L、dNTP0.2 mmol/L，1.5 mmol/L MgCL21.0U以及Taq聚合酶、反應(yīng)緩沖液等。于Gene Amp 2400PCR儀器中進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)條件為95℃變性2 min，94.2℃30 s，63.6℃30 s，72℃45 s，持續(xù)35個(gè)循環(huán)后溫度降至72℃持續(xù)8 min。取5 μL PCR置入％瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳分析，測(cè)定PCR產(chǎn)量。

1.3.3RFLP分析應(yīng)用限制性內(nèi)切酶Aci I分析MPO基因-463位點(diǎn)多態(tài)性反應(yīng)體系如下：Buffer緩沖液2 μL，PCR產(chǎn)物8 μL，無(wú)菌去離子水9.5 μL，Aci I酶0.5 μL，總體積為20 μL。將上述各物質(zhì)混勻后置于恒溫水浴（37℃）中16 h左右。用2 μL Loading Buffer與上述酶切產(chǎn)物混勻，點(diǎn)于含0.5 g/mL EB的3.0％瓊脂糖凝膠點(diǎn)樣孔中電泳，于凝膠成像系統(tǒng)下進(jìn)行觀察并將實(shí)驗(yàn)結(jié)果拍照記錄。

1.4統(tǒng)計(jì)方法

采用SPSS20.0軟件統(tǒng)計(jì)進(jìn)行分析研究，等位基因頻率與組間基因型頻率的資料對(duì)比應(yīng)用Χ2檢驗(yàn)、相對(duì)危險(xiǎn)度分析、Logistic回歸分析MP0基因463位點(diǎn)不同基因型在兩組人群構(gòu)成比以O(shè)R值和95％CI表示DILI發(fā)生危險(xiǎn)性。

2　結(jié)果

如表1所示，以MPO-463位點(diǎn)GG型純合子基因型為對(duì)照，攜帶MPO-463 GA型和單獨(dú)攜帶MPO-463AA型在DILI組與對(duì)照組間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。將攜帶MP0-463GA型和攜帶MP0-463AA型合并后與攜帶MP0-463GG型比較，兩組結(jié)果差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），同時(shí)兩組檢測(cè)到的G/A等位基因頻率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表1　MPO基因分布與DILI的關(guān)系［n（％）］

3　討論

DILI是一種自身免疫性疾病，多是藥物和蛋白的共價(jià)結(jié)合形成免疫原性結(jié)合物（代謝產(chǎn)物和生物活性物質(zhì)）［4］，通過(guò)抗原攝取、處理，而引起細(xì)胞增殖表達(dá)使機(jī)體肝臟受損，許多細(xì)胞因子也參與了反應(yīng)。一般來(lái)講，DILI是主要的誘導(dǎo)因素為藥物不斷的轉(zhuǎn)化過(guò)程中多形成代謝物，而這些代謝產(chǎn)物一般都是細(xì)胞內(nèi)部的較大分子物質(zhì)，比如脂質(zhì)、蛋白質(zhì)等成分，它能夠促使DNA破壞、脂質(zhì)膜過(guò)氧化、蛋白功能紊亂等。一般多數(shù)病人停藥后能夠恢復(fù)，使得組織和臨床上會(huì)發(fā)生相應(yīng)的改變。有關(guān)數(shù)據(jù)表示［5］，由于國(guó)內(nèi)外新藥的不斷使用，DILI發(fā)病率逐漸上升。目前，使用的髓過(guò)氧化物酶（MPO）屬于一種介導(dǎo)的白細(xì)胞酶，MPO能夠分泌反應(yīng)性物質(zhì)，從而作用影響機(jī)體自身的免疫功能，在生理狀況下，可以很好的催化過(guò)氧化氫與氯離子進(jìn)行反應(yīng)，進(jìn)而生成生成次氯酸。相關(guān)研究表示［6］，機(jī)體內(nèi)的多種自由基會(huì)與其反應(yīng)從而殺死病原微生物，因此，MPO可以參體內(nèi)的免疫反應(yīng)，同時(shí)改善機(jī)體的免疫系統(tǒng)使其發(fā)生作用。若是機(jī)體處于氧化應(yīng)激或者炎癥的時(shí)候，其催化所產(chǎn)生的物質(zhì)會(huì)超過(guò)機(jī)體的抵抗呢你，成為負(fù)荷物質(zhì)，進(jìn)而會(huì)引起多種的組織損傷。MPO能夠氧化巰基，致使細(xì)胞中的色素及血紅蛋白失取活性，蛋白質(zhì)進(jìn)而降解，因此會(huì)很大程度的損傷肝細(xì)胞。而白細(xì)胞經(jīng)過(guò)黏附、趨化、等作用在肝實(shí)質(zhì)內(nèi)被活化而滲出了血管壁，通過(guò)脫顆粒等一些物質(zhì)刺激多種介質(zhì)損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞和肺泡上皮細(xì)胞。

有關(guān)研究顯示［7］，MPO作為一種氧化應(yīng)激的的酶類，主要用于衡量機(jī)體組織氧化和代謝的指標(biāo)。人工的MPO在加工的過(guò)程中，其基因位于染色體的17q23-q24上，主要有11個(gè)內(nèi)含子和12個(gè)外顯子構(gòu)成［8］，Alu激素使其中一個(gè)SP-1轉(zhuǎn)錄結(jié)合位點(diǎn)的喪失，從而造成編碼區(qū)上游463位點(diǎn)G突變A。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示MP0-463 GG、GA和AA 3種基因型的頻率在DILI組中分別為86.5％、10.8％和2.7％，在對(duì)照組中分別為73.4％、23.3％和3.3％，其中MP0-463GA型和攜帶MP0-463AA型合并后與攜帶MP0-463 GG型比較，兩組結(jié)果差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），同時(shí)兩組檢測(cè)到的G/A等位基因頻率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。說(shuō)明MPO與DILI存在某種相關(guān)性，同時(shí)MPO也屬于血紅素輔基的血紅素蛋白酶，作為細(xì)胞的氧化感受器，MPO的基因一般多數(shù)是以其他形態(tài)存在的，可以影響機(jī)體對(duì)疾病的敏感特異性。因此，MPO基因多態(tài)性與DILI易感性是呈現(xiàn)關(guān)聯(lián)的關(guān)系。

綜上所述，髓過(guò)氧化物酶基因多態(tài)性與藥物性肝病易感性之間存在相關(guān)性，能夠?yàn)榕R床方面的研究提供有價(jià)值的資料，也值得更進(jìn)一步的研究。

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Analysis of Myeloperoxidase Gene Polymorphism in Patients with Drug-induced Liver Disease

JIANG Yue-hong1，WANG Yan-ying2
1.Department of Clinical Laboratory，Heilongjiang Provincial Hospital，Harbin，Heilongjiang Province，150036 China；2.Department of Gastroenterology，Shanghai East Hospital，Shanghai，200120 China

［Abstract］Objective To discuss the correlation between the myeloperoxidase gene polymorphism and drug-induced liver disease. Methods The peripheral blood samples of 37 cases of patients with drug-induced liver disease and 30 healthy control people were collected according to the case control analysis method，and the MPO-463G/A polymorphism detection was carried out by extracting DNA. Results The genotype frequency of MP0-463 GG，GA and AA was respectively 86.5％，10.8％and 2.7％in the DILI group and 73.4％，23.3％and 3.3％in the control group；the risk of suffering from DILI in patients with MP0-463 GA and AA obviously increased compared with that of the patients with MPO-463 GG，the risk of suffering from DILI of individuals with A allele obviously decreased compared with that of the individuals with G allele，which indicated that MP0-463 G/A polymorphism was correlated with the occurrence of the DILI. Conclusion Myeloperoxidase gene polymorphism has a correlation with the susceptibility of drug-induced liver disease，which is worth further research.

［Key words］Drug-induced liver disease；Myeloperoxidase；Gene polymorphism

［中圖分類號(hào)］R322.4+7

［文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼］A

［文章編號(hào)］1674-0742（2016）05（b）-0079-02

DOI：10.16662/j.cnki.1674-0742.2016.14.079

收稿日期：（2016-02-12）