低氧狀態下芹黃素通過抑制HIF-1α下調卵巢癌SKOV3細胞GluT-1表達的實驗研究*

鄧潔　張小霞　鄧曉楊　彭聰　羅劍波　朱濤

(1.成都醫學院第一附屬醫院婦科， 四川 成都 610000;2.四川大學華西醫院呼吸病學研究室/呼吸內科，四川 成都 610041

·論著·

低氧狀態下芹黃素通過抑制HIF-1α下調卵巢癌SKOV3細胞GluT-1表達的實驗研究*

鄧潔1張小霞1鄧曉楊1彭聰1羅劍波1朱濤2

(1.成都醫學院第一附屬醫院婦科， 四川 成都 610000;2.四川大學華西醫院呼吸病學研究室/呼吸內科，四川 成都 610041

【摘要】目的研究在低氧狀態下芹黃素能否通過抑制HIF-1α下調卵巢癌SKOV3細胞GluT-1表達。方法將卵巢癌SKOV3細胞分為常氧組、低氧組和低氧+芹黃素組。在低氧狀態下對卵巢癌SKOV3細胞使用終濃度為50 μM的芹黃素進行干預，在不同時間點(0h、24h和72 h)使用MTT法對SKOV3細胞活性進行檢測；同時在干預24h后，分別使用qPCR法和western blot法對卵巢癌SKOV3細胞GluT-1和HIF-1α mRNA和蛋白表達水平進行檢測。結果 低氧環境下SKOV3細胞活性呈時間依賴性下降，差異均有顯著統計學意義(P均<0.05)；且在各時間點低氧+芹黃素組活性較低氧組下降更加明顯，差異均有顯著統計學意義(P均<0.05)。同時，在干預24h后卵巢癌SKOV3細胞GluT-1和HIF-1α mRNA和蛋白的表達水平較非干預組細胞明顯降低，差異均有顯著統計學意義(P均<0.05)。結論 在低氧狀態下，芹黃素可以通過抑制HIF-1α的合成下調卵巢癌SKOV3細胞GluT-1的表達，從而抑制腫瘤細胞的增殖。該基礎研究為芹黃素應用于卵巢癌等惡性腫瘤的治療奠定了一定的理論基礎。

【關鍵詞】芹黃素；卵巢癌；SKOV3細胞；葡萄糖轉運蛋白-1；缺氧誘導因子-1α

卵巢癌(ovarian cancer)是人類女性最常見的婦科腫瘤之一，由于卵巢組織結構來源多樣，造成卵巢癌病理類型具有復雜的生物學特點。同時，調查顯示卵巢癌細胞惡性程度普遍較高，據美國癌癥協會(American Cancer Society, ACS)統計顯示美國卵巢癌患者5年生存率僅有44%[1-4]。缺氧誘導因子-1α (Hypoxia-inducible factor-1α, HIF-1α)是一種在低氧狀態下誘導表達的核轉錄因子[5,6]。研究發現HIF-1α對于肺癌、肝癌、乳腺癌和卵巢癌等大多數腫瘤的增殖、轉移和血管生成等均有重要的調控作用[5,6]。抑制和下調HIF-1α可有效抑制肺癌和卵巢癌等腫瘤的生長和分化[5-9]。芹黃素(apigenin)作為一種常見的植物黃酮類化合物，廣泛存在于多種水果和茶葉中。目前多個研究顯示芹黃素具有抗炎癥反應和抗腫瘤等藥理活性，并認為其藥理作用與下調HIF-1α表達密切相關[10-12]。本研究目的是旨在探討低氧狀態下芹黃素對卵巢癌SKOV3細胞的抑制作用及潛在的分子機制。

1材料和方法

1.1主要試劑和材料PCR試劑盒購自寶生物工程有限公司；Heracell 150i細胞培養箱購買于美國Thermo Scientific公司；鼠抗人GluT-1抗體、鼠抗人HIF-1α抗體和鼠抗人β-actin抗體購于美國Cell signaling公司；芹黃素購買于美國Sigma公司；DMEM培養基購買于美國Gibco公司；MTT試劑盒購買于美國Promega公司；其余試劑均為市售分析純。

1.2細胞培養卵巢癌SKOV3細胞常規接種在含10%FBS、100 g/L青霉素、100 g/L鏈霉素的DMEM培養液中，置于37℃、95%空氣、5% CO2孵箱內培養。每48 h換液、傳代1次，取對數生長期細胞用于實驗。卵巢癌SKOV3細胞分為常氧組(Normoxia組)、低氧組(Hypoxia組)和低氧+芹黃素組(Hypoxia+Apigenin組)。其中常氧組和低氧組細胞加入PBS，低氧+芹黃素組加入溶于0.5% DMSO終濃度為50 μM的芹黃素，而后將低氧組和低氧+芹黃素組細胞移置于低氧環境(1% O2、5% CO2和94% N2)進行培養。

1.3卵巢癌SKOV3細胞活性檢測取對數生長期卵巢癌SKOV3細胞消化制成單細胞懸液，接種于96 孔培養板中，每孔接種100 μL約含5×103個細胞。使用MTT比色試驗對芹黃素干預后不同時間點(0h、24h和72 h)的細胞生長狀態進行測定，實驗重復5次。細胞活性(%) = (OD樣本/OD 常氧組0h) × 100 (%)[13]。

1.4qPCR檢測卵巢癌SKOV3細胞Glut-1和HIF-1α mRNA表達檢測干預24h后，按照qPCR試劑盒說明書提取細胞總RNA。引物：Glut-1正義5′-CCGCAACGAGGAGAACCG-3′，反義5′- GTGACCTTCTTCTCCCGCATC-3′；HIF-1α正義 5′-CTGCCA CCACTG ATGAATTA-3′，反義5′-GTATGT GGGTAGGA GATGGA-3′；β-actin正義：5′- CTCCAT CCTG GCCT CGCTGT-3′，反義：5′-GCTGT CACCTT CACC GTTCC-3′。使用β-actin作為內參基因，使用2-ΔΔCT公式計算目的基因相對表達量。ΔΔCt = (Ct,目標-Ct,β-actin)干預組-(Ct,目標-Ct,β-actin)對照組。

1.5Western blot法檢測卵巢癌SKOV3細胞中Glut-1和HIF-1α蛋白表達干預24h后，按照試劑盒操作要求，首先提取細胞總蛋白，并進行聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，然后轉移至硝酸纖維素濾膜上，用脫脂奶粉封閉1 h，分別加入鼠抗人單克隆抗體Glut-1 (1∶1000)、HIF-1α (1∶1000)和β-actin (1∶1200)，4℃孵育過夜，洗膜后加入相應的辣根過氧化物酶標記的二抗(1∶2000)，用ECL進行顯色，用凝膠成像分析系統進行掃描。

1.6統計學方法計量資料以均數±標準差表示。采用SPSS 17.0進行單因素方差分析，兩樣本均數多重比較采用LSD法，P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1SKOV3細胞活性測定低氧狀態下，卵巢癌SKOV3細胞活性隨時間延長而逐漸下降，差異均有顯著統計學意義(P均<0.05)。且對應時間點與低氧組相比較，低氧+芹黃素組細胞活性下降更加顯著，差異均有顯著統計學意義(P均<0.05)，見表1。

Table 1Cell viability of HCT116 cells in different time points (0 h, 24h, and 72h)

干預時間 0h24h72h常氧組111低氧組100.4±2.688.2±8.4①71.2±10.3①低氧+芹黃素組102.3±3.152.6±15.3①②33.6±11.4①②

注：①與對應時間點常氧組相比較P<0.05；②與對應時間點低氧組相比較P<0.05。

2.2SKOV3細胞GluT-1 mRNA和蛋白的表達在干預24h后，低氧狀態下卵巢癌SKOV3細胞GluT-1 mRNA和蛋白的表達較常氧狀態下明顯增加，差異有顯著統計學意義(P均<0.05)；與低氧組比較，低氧+芹黃素組細胞GluT-1 mRNA和蛋白表達水平較低，差異有顯著統計學意義(P均<0.05)，見表2和圖1。

2.3SKOV3細胞HIF-1α mRNA和蛋白的表達 在干預24h后，低氧狀態下卵巢癌SKOV3細胞HIF-1α mRNA和蛋白的表達較常氧狀態下明顯增加，差異有顯著統計學意義(P均<0.05)；與低氧組比較，低氧+芹黃素組細胞HIF-1α mRNA和蛋白表達較低，差異有顯著統計學意義(P均<0.05)，見表2和圖2。

表2　卵巢癌SKOV3細胞Glut-1和HIF-1α mRNA和蛋白表達水平

注：①與常氧組相比較P<0.05；②與低氧組相比較P<0.05。

圖1卵巢癌SKOV3細胞GluT-1蛋白表達的western blot結果

Figure 1The western blot result of the protein expression of GluT-1 in SKOV3 cells

圖2卵巢癌SKOV3細胞HIF-1α蛋白表達的western blot結果

Figure 2The western blot result of the protein expression of HIF-1α in SKOV3 cells

3討論

流行病學調查卵巢癌(ovarian cancer)是人類女性生殖系統僅次于宮頸癌的惡性腫瘤。由于卵巢組織胚胎分化來源較為豐富，故導致卵巢成為機體腫瘤病理類型最豐富的組織器官[1-4]。研究數據顯示2012年全球卵巢癌新發病人數約為23.9萬，死亡人數約為14萬[1-4]。同時，由于卵巢組織位置處于腹腔深處，卵巢癌患者一般診斷時多處于Ⅲ～Ⅳ期，故預后相對較差。據美國癌癥協會(American Cancer Society, ACS)統計顯示美國卵巢癌患者5年生存率僅有44%左右，而全球卵巢癌患者5年生存率僅有30%左右[1-4]。尋求新的卵巢癌治療方法和途徑具有重要的臨床價值和意義。

由于腫瘤組織失去細胞生長抑制和增殖的無序性，使實體腫瘤組織內部長期處于低氧狀態。研究發現腫瘤組織內部的低氧與腫瘤細胞的增殖、分化、浸潤、轉移和血管生成等惡性行為密切相關[5-9]。進一步的研究顯示缺氧誘導因子-1α (Hypoxia-inducible factor-1α, HIF-1α)在該過程中扮演著重要的角色[5-9]。一般情況下低氧狀態可以誘導腫瘤細胞HIF-1α的表達增加，并進一步上調包括VEGF、NDRG1和GluT-1等下游分子的合成和表達[7, 14-17]。其中GluT-1是細胞糖代謝的重要分子，GluT-1在腫瘤細胞的增殖和分化中扮演著重要的角色[16, 17]。大量的研究表明抑制和阻斷HIF-1α相關的信號通路可以有效的抑制包括肺癌A549細胞、乳腺癌MDA-MB-231細胞以及卵巢癌SKOV3和A2780細胞在內的多種腫瘤細胞的增殖、轉移和浸潤等惡性行為[7, 8, 14-17]。如Wei D等的研究顯示低氧狀態下地高辛可以通過抑制HIF-1α下調肺腺癌A549細胞VEGF和NDRG1表達，并有效抑制A549細胞的增殖和分化[7]。Ataie-Kachoie P等的研究發現在低氧狀態下米諾環素(minocycline)可以通過下調卵巢癌SKOV3和A2780細胞HIF-1α的表達抑制AKT/mTOR信號通路，并抑制腫瘤的增殖和侵襲[8]。

芹黃素(apigenin)作為一種常見的植物黃酮類化合物，傘形科植物旱芹葉中含量較為豐富，此外還廣泛存在于多種水果和茶葉以及水蔓青、虎杖和毛葉藜蘆等中草藥中。目前大量研究發現芹黃素具有顯著的抗炎癥反應、抗氧化應激、抗器官纖維化及抑制腫瘤增殖、分化和腫瘤血管生成等多種生物學活性[10-12, 18-21]。進一步研究發現芹黃素的多種生物學活性與調控HIF-1α相關的信號通路密切相關[10-12, 18-21]。Fang J等研究發現在低氧狀態下芹黃素可以通過抑制HIF-1α下調人前列腺癌PC3和DU145細胞以及結腸癌HCT-8細胞VEGF的表達，以及小鼠移植瘤的血管生成[10]。Tong X等的研究證實在皮膚組織中芹黃素可以有效的抑制和改善紫外線(UVB)誘導的致癌作用(carcinogenesis)，并認為該作用與下調HIF-1α信號通路密切相關[11]。Melstrom LG等的研究顯示在低氧狀態下芹黃素可以通過有效抑制胰腺癌細胞HIF-1α的合成下調GluT-1和VEGF的表達[12]。在本研究中我們發現低氧環境下SKOV3細胞活性呈時間依賴性下降，差異均有顯著統計學意義(P均<0.05)；且在各時間點低氧+芹黃素組活性較低氧組下降更加明顯，差異均有顯著統計學意義(P均<0.05)。該結果表明在低氧狀態下芹黃素對卵巢癌SKOV3細胞有顯著的抑制作用。進一步研究發現在干預24h后卵巢癌SKOV3細胞GluT-1和HIF-1α mRNA和蛋白的表達水平較非干預組細胞明顯降低，差異均有顯著統計學意義(P均<0.05)。該結果表明芹黃素對于低氧狀態誘導的HIF-1α和GluT-1表達有抑制作用。

4結論

在低氧狀態下，芹黃素可能可以通過抑制HIF-1α的合成下調卵巢癌SKOV3細胞GluT-1的表達，從而抑制腫瘤細胞的增殖。該基礎研究為芹黃素應用于卵巢癌等惡性腫瘤的治療奠定了一定的理論基礎。

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Apigenin reduces GluT-1 expression via down-regulation of HIF-1α under hypoxic conditions in ovarian cancer SKOV3 cells

DENG Jie1, ZHANG Xiaoxia1, DENG Xiaoyang1, et al

(1.DepartmentofGynecology,TheFirstAffiliatedHospitalofChengduMedicalCollage,Chengdu610000,China; 2.DivisionofPulmonaryDiseases,StateKeyLaboratoryofBiotherapyofChina,DepartmentofRespiratoryMedicine,WestChinaHospital,SichuanUniversity,Chengdu610041,China)

【Abstract】ObjectiveTo explore the value of apigenin on glucose transporter-1 (Glut-1) expression in ovarian cancer SKOV3 cells in hypoxia, and its underlying molecular mechanism. MethodsOvarian cancer SKOV3 cells were divided into 3 groups, including Normoxia group, Hypoxia group and Hypoxia+Apigenin group. At specified time points (0, 24 and 72 h), cell viabilities were analyzed by MTT assay. After 24 hours interventions, Glut-1 and HIF-1α mRNA expression were detected by qPCR, and, Glut-1 and HIF-1α protein expression were measured by Western blot. Results The proliferation of ovarian cancer SKOV3 cells under hypoxic conditions was time-dependently inhibited by apigenin. Our data demonstrated that hypoxia noticeably enhanced the mRNA and protein expression of GluT-1 and HIF-1α in SKOV3 cells. Meanwhile, the hypoxia-enhanced GluT-1 and HIF-1α were significantly suppressed by apigenin. Conclusion Apigenin could suppress GluT-1 expression possibly through inhibition of HIF-1α in ovarian cancer SKOV3 cells in hypoxia.

【Key words】Apigenin; Ovarian cancer; SKOV3 cells; Glucose transporter-1; Hypoxia-inducible factor-1α

基金項目：四川省醫學會科研課題(171140342)；中國博士后科學基金(2014M552369)

通訊作者：鄧曉楊，E-mail：dengxiaoyang2014@sina.com

【中圖分類號】R 965.2

【文獻標志碼】A

doi：10.3969/j.issn.1672-3511.2016.05.005

(收稿日期：2015-05-25； 編輯： 張文秀)